人脐带间充质干细胞治疗慢加急性肝衰竭小鼠的疗效、安全性及体内分布

Safety， efficacy， and in vivo distribution of human umbilical cord⁃derived mesenchymal stem cells in acute⁃on⁃chronic liver failure mice

摘要

目的 探讨人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）治疗慢加急性肝衰竭（ACLF）小鼠的疗效、安全性及体内分布规律。 方法 选取雌性C57BL/6小鼠100只，随机分为对照组（25只）和模型组（75只）。模型组用四氯化碳（CCl₄）诱导建立ACLF模型，以小鼠生存情况、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红素（TBIL）及透明质酸（HA）显著升高及肝组织病理损伤作为造模成功判定标准。造模后，模型组存活41只，对照组25只均存活。在疗效与安全性实验中，造模成功且存活的31只模型鼠随机分为：PBS组（n=12）和hUC-MSCs组（n=19）；同时取15只作为对照（未造模）。三组于给药后24，72，168 h记录生存小鼠，检测血清ALT、AST、TBIL及HA水平，并行肝组织苏木精-伊红（HE）及Masson染色。在体内示踪实验中，剩余10只模型小鼠和10只对照小鼠注射荧光素酶和绿色荧光蛋白（GFP）标记的MSC后，进行小动物活体成像及各脏器GFP免疫荧光以观察MSC细胞体内分布。　结果　模型组ALT、AST、TBIL及HA较对照组显著升高，符合ACLF特征。与PBS组相比，hUC-MSCs组小鼠生存率增加（67% vs 89%），血清ALT、AST、TBIL及HA水平均有不同程度下降，其中AST及HA水平下降差异具有统计学意义（均P<0.01），病理学显示肝细胞坏死及纤维化减轻。示踪结果显示，hUC-MSCs早期主要滞留于肺，24 h后在肝脏出现弱荧光信号，168 h时肝、脾、肾组织中GFP表达较示踪对照组明显增强（P<0.05）。　结论　hUC-MSCs可改善ACLF小鼠肝功能和组织损伤，提高生存率，并有明确的归巢与器官分布特征。

Abstract

Objective To investigate therapeutic efficacy， safety， and in vivo distribution of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells（hUC-MSCs） in acute-on-chronic liver failure（ACLF） mice. Methods A total of 100 female C57BL/6 mice were randomly assigned to control group（n=25） and model group（n=75）. The mice were administrated with CCl₄ to induce ACLF model. Survival status， marked elevations in serum alanine aminotransferase（ALT）， aspartate aminotransferase（AST）， total bilirubin（TBIL）， and hyaluronic acid（HA）， and histopathological liver injury were used to evaluate the successful establishment of model. After modeling， 41 model mice survived， and all 25 control mice survived. In the efficacy and safety study， 31 model mice were randomly assigned to PBS group（n=12） and hUC-MSC group（n=19）， and 15 control mice served as control group. Survival mice were recorded， and serum levels of ALT， AST， TBIL， and HA were measured at 24， 72， 168 h after treatment. HE staining and Masson staining were used to observe the pathology of liver tissues. In the in vivo tracing study， the remaining 10 model mice and 10 control mice received Luc-GFP-labeled hUC-MSCs， and then small-animal bioluminescence imaging and organ immunofluorescence were performed to evaluate the cell distribution. Results Compared with controls， the model mice exhibited significant increases in ALT， AST， TBIL， and HA， consistent with ACLF features. Compared with PBS group， the survival rate increased（67% vs 89%）， serum ALT， AST， TBIL， and HA levels decreased by varying degrees， especially AST and HA（both P<0.01）， and hepatocellular necrosis and fibrosis were alleviated. In vivo tracing experiment demonstrated an organ-specific distribution pattern of hUC-MSCs， characterized by early pulmonary retention， weak hepatic fluorescence at 24 h， and enhanced GFP expression in the liver， spleen， and kidney at 168 h（P<0.05）. Conclusion The hUC-MSCs can improve the liver function， attenuate the tissue injury， and elevate the survival of ACLF mice， and exhibit a clear homing and organ-distribution profile.

Graphical abstract

关键词

人脐带间充质干细胞 / 慢加急性肝衰竭 / 细胞治疗 / 肝功能 / 体内示踪 / 活体成像

Key words

human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells / acute-on-chronic liver failure / cell therapy / liver function / in vivo tracking / bioluminescence imaging

慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure，ACLF）是一种发生于慢性肝病基础上，由各种诱因引发的急性肝功能失代偿综合征，目前仍然是肝衰竭中发生率较高的一型，具有起病急、进展快、短期病死率高等特点^［1］。目前临床上尚缺乏针对ACLF的有效治疗手段^［2］。人脐带间充质干细胞（human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，hUC-MSCs）因具有低免疫原性、良好的免疫调节及组织修复能力，在肝脏疾病治疗中展现出广阔的应用前景^［3］。尽管已有研究报道hUC-MSCs在肝损伤模型中的治疗作用，但其在ACLF模型中的安全性、有效性及体内分布规律仍缺乏系统研究。本实验通过观察单次hUC-MSCs静脉给药对ACLF小鼠治疗有效性、安全性及其在体内分布，以明确其在ACLF模型中的治疗潜力及体内归巢特征。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

健康C57BL/6J Nifdc小鼠（6~8周，雌性）100只，购自北京维通利华实验动物技术股份有限公司，动物生产许可证号：SCXK（京）2021-0006。所有实验动物饲养环境温度控制在20~26 ℃，湿度维持在40%~70%，光照条件为12 h/12 h明暗交替，动物可自由进食和饮水。本研究已获得山西医科大学第一医院伦理委员会批准（批文号：DWYJ-2024-122）。

1.1.2 实验细胞

人脐带间充质干细胞，购自深圳市北科生物科技有限公司。

1.1.3 实验试剂及设备

间充质干细胞无血清基础培养基、人源血小板裂解物、TrypLE™ Express胰酶替代物购自美国赛默飞公司，带有荧光素酶（Luc）和绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组慢病毒购自赛业生物科技有限公司，D-虫荧光素钠购自上海源叶生物科技有限公司，四氯化碳（CCl₄）购自天津市登封化学试剂厂，橄榄油购自北京索莱宝科技有限公司。

37 ℃二氧化碳细胞培养箱（HER Acell 240i）购自美国赛默飞公司，倒置荧光显微镜（ECLIPSE Ts2R）购自日本尼康公司，全自动生化分析仪（3100）购自日本日立公司，小动物活体成像仪器（AniView100/600 Phoenix DXA）购自中国广州博鹭腾生物科技有限公司。

1.2 小鼠分组及模型建立

所有实验动物进行7 d适应性喂养，将100只雌性C57BL/6JNifdc小鼠随机分为对照组25只与模型组75只。对照组腹腔注射0.2 mL橄榄油，每周2次，连续8周；模型组参照经典CCl₄造模，先腹腔注射20% CCl₄ 0.2 mL，每周2次，连续8周，在最后一次注射结束后3 d，腹腔注射50% CCl₄ 0.2 mL^［4，5］。

对照组25只小鼠均存活，模型组造模成功后存活41只。随机取31只造模成功小鼠分为PBS组（n=12）和hUC-MSCs组（n=19），并另取15只对照小鼠用于疗效及安全性分析。此外，剩余小鼠用于体内示踪，分为：示踪对照组（n=10）与示踪模型组（n=10）。

1.3 hUC-MSCs疗效与安全性实验

1.3.1 小鼠分组处理

PBS组和hUC-MSCs组小鼠在腹腔注射50% CCl₄后4 h分别经尾静脉注射PBS 0.2 mL和等量hUC-MSCs悬液（1×10⁷/mL）。

1.3.2 一般生理指标观察

模型组小鼠在腹腔注射50% CCl₄及尾静脉注射hUC-MSCs后1 h观察一般表现，并记录各组小鼠存活率。

1.3.3 小鼠血标本采集及肝组织取材

对照组、PBS组和MSC组小鼠分别于尾静脉注射给药后24，72，168 h内眦静脉取血，分离血清用全自动生化分析仪检测丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红素（TBIL）和透明质酸（HA）等指标。

所有采血与处死操作均在深度异氟烷麻醉下进行。取血采用内眦静脉法，采血后滴加眼部润滑剂保护角结膜。末次采血与组织取材前，在充分麻醉状态下采用颈椎脱臼作为确认性处死方式。处死后取肝脏组织，使用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片行苏木精-伊红（HE）及Masson染色观察病理变化，并采用Suzuki评分法评估损伤程度。Suzuki评分含肝窦淤血、肝细胞坏死和细胞质空泡化，每项指标损伤程度由轻到重计为0~4分^［6］。

1.4 hUC-MSCs体内示踪实验

1.4.1 重组慢病毒转染hUC-MSCs

首先构建稳定表达Luc和GFP基因的hUC-MSCs细胞株。将携带Luc和GFP基因的重组慢病毒对hUC-MSCs进行转染，经嘌呤霉素筛选后构建双标记hUC-MSCs稳转细胞系。采用稳定表达荧光素酶和GFP基因的细胞株，按不同细胞数量（0，5×10⁵，1×10⁶，1.5×10⁶细胞/EP管）分装后，加入终浓度为150 μg/mL的D-虫荧光素（D-Luciferin），室温孵育3 min后，在IVIS Spectrum（In Vivo Imaging System）小动物活体荧光成像系统上进行生物发光成像。

1.4.2 体内示踪

示踪对照组和示踪模型组小鼠分别注射Luc-GFP-hUC-MSCs和Luc-GFP-hUC-MSCs。并分别于腹腔注射荧光素底物后30 min、24 h、48 h、72 h、168 h 进行活体成像，记录发光强度，观察hUC-MSCs体内分布情况。处死小鼠后，取其肝、脾、肺、心、肾等主要器官组织，通过示踪仪检测GFP荧光信号。

1.4.3 组织中GFP免疫荧光检测

处死小鼠后，取其肝、脾、肺、心、肾等主要器官组织，进行免疫荧光检测GFP。

1.5 统计学分析

实验数据采用SPSS 21.0软件进行分析。计量资料根据数据分布情况，以均数±标准差（X±S）表示。组间比较前，采用Shapiro-Wilk检验评估正态性，并通过Levene检验验证方差齐性。采用双因素方差分析（two-way ANOVA）评估处理因素（对照/PBS/hUC-MSCs）和时间因素（24，72，168 h）及其交互作用；若时间与处理之间交互作用有统计学意义，则在各时间点内分别进行单因素方差分析，并采用Bonferroni校正的两独立样本t检验进行组间两两比较；若交互作用无统计学意义，则主要解释时间和处理的主效应，并在必要时于各因素水平内进行事后两两比较。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况及存活率

造模成功后，小鼠表现出精神不振、呼吸变弱、对外界环境不敏感、抓取抵抗减弱、饮食饮水减少的症状。与PBS组相比，治疗24 h后，hUC-MSCs组小鼠的情况显著改善，状态好转，活动度逐渐增加，饮食饮水也随之增加；而对照组小鼠在整个过程中则无明显变化。

PBS组12只小鼠在24 h内死亡3只，48 h内再死亡1只；相比之下，hUC-MSCs组19只小鼠在24 h内死亡2只，48 h后两组小鼠的整体状态均趋于好转，此后未再出现死亡。PBS组存活率为67%（8/12），而hUC-MSCs组存活率提高至89%（17/19）。对照组小鼠活动状态始终正常，未出现异常变化。hUC-MSCs组较PBS组死亡风险降低，尽管差异未达到统计学显著水平（χ²=2.35，P=0.125），提示hUC-MSCs具有提高ACLF小鼠存活率的趋势。

2.2 肝功能及肝纤维化指标检测结果

CCl₄造模后，小鼠血清ALT、AST、TBIL和HA水平均出现不同程度升高。两因素方差分析显示，ALT和AST的时间主效应和组别主效应均显著，并存在明显的时间×组别交互作用（P<0.001），提示肝细胞损伤的动态变化受时间和处理方式共同影响。HA同样具有显著的时间主效应、组别主效应及交互作用（P<0.001），表明基质沉积随时间逐步加重，其程度受到处理方式显著调节。相比之下，TBIL仅表现出显著的组别主效应（P<0.001），时间主效应较弱，且无交互作用，说明三组间TBIL的差异在整个损伤过程中呈现一致趋势，而不受时间节点影响。

治疗24 h时，PBS组和hUC-MSCs组ALT和AST水平均显著高于对照组（P<0.001），hUC-MSCs组AST水平低于PBS组（P<0.01），提示hUC-MSCs能在急性早期部分减轻肝细胞损伤。PBS组和hUC-MSCs组HA也明显高于对照组（P<0.001）。72 h时PBS组和hUC-MSCs组ALT明显下降但仍高于对照组（P<0.001），PBS组AST仍高于对照组（P<0.001），而hUC-MSCs组与对照组之间差异不显著。此阶段PBS组和hUC-MSCs组的HA持续升高，仍显著高于对照组（P<0.001）。168 h时ALT和AST基本恢复至接近正常水平，三组之间差异均不显著；但PBS组HA水平最高，显著高于对照组和hUC-MSCs组（P<0.001），而hUC-MSCs组HA水平低于PBS组（P<0.001，见表1），提示其可抑制晚期基质沉积。

总体而言，CCl₄急性肝损伤在24 h最为显著，72 h明显缓解，168 h基本恢复。hUC-MSCs对ALT和AST的保护效应主要体现在急性早期，而对HA的抑制作用在后期更为突出；TBIL虽整体随损伤升高，但在处理组之间差异有限且不呈现时间依赖性。这些结果表明 hUC-MSCs对CCl₄所致急性肝损伤具有时间相关的保护作用，既能减轻早期肝细胞损伤，也能在后期降低基质沉积水平。

2.3 肝组织病理变化

2.3.1 形态学改变

对照组肝脏外观红润光滑，结构基本正常；PBS组小鼠的肝脏和脾脏均出现明显增大，质地变硬，提示明显的肝脏病理改变；与PBS组相比，hUC-MSCs组肝脏和脾脏的肿大程度及肝脏硬度均有所缓解（见图1）。此外，对照组和模型组间心脏、肺脏及肾脏的形态未见明显差异（见图1），提示在本实验条件下，CCl₄主要引起肝脏损伤，对其他主要器官影响较小。

2.3.2 肝组织HE及Masson染色

对照组在光镜下可见肝小叶结构清晰，肝索排列整齐，无明显坏死或炎症；PBS组则表现为广泛性肝细胞坏死，伴有大量炎性细胞浸润，肝索排列紊乱；hUC-MSCs组仅见部分肝细胞结构轻度破坏，局部区域存在小范围坏死，炎性细胞浸润相对较少，表明其肝组织损伤程度明显轻于PBS组（见图2）。Suzuki's评分结果进一步证实，hUC-MSCs模型组的肝损伤评分显著低于PBS模型组（1.9±0.4 vs 5.7±0.2，t=4.5，P<0.01）。

hUC-MSCs给药7 d后，取小鼠肝组织进行Masson's染色。结果显示，PBS组小鼠肝组织纤维化程度显著增加，而hUC-MSCs组纤维沉积明显减少，肝组织结构相对保持完整（见图3）。

2.4 hUC-MSCs小鼠体内分布情况

2.4.1 小鼠体内示踪成像结果

体内示踪实验前，在24孔板铺板密度为1.5×10⁴个细胞/孔，hUC-MSCs在MOI=30条件下慢病毒转染并以1 μg/mL嘌呤霉素筛选4 d，结果显示，细胞存活率较高，且可获得较理想且稳定的转染效率（见图4）。示踪模型组和示踪对照组小鼠分别经尾静脉注射均匀表达荧光素酶和GFP基因的hUC-MSCs，随后腹腔注射D-荧光素钠，并使用示踪仪进行体内发光成像。结果显示，在注射D-荧光素钠后30 min，两组小鼠体内均可见明显成像信号，肺脏聚集较明显，24 h肝脏可见少量荧光信号（见图5），在48，72，168 h小鼠体内未再检测到明显成像信号。

在注射后168 h处死小鼠，取其肝、脾、肺、心、肾等主要器官组织，通过示踪仪检测GFP荧光信号，结果同样未见明显成像（见图5F）。

2.4.2　离体主要脏器组织切片免疫荧光示踪结果为进一步明确hUC-MSCs在体内的具体分布情况，对各组织切片进行GFP免疫荧光染色，结果显示，在168 h时，示踪模型组肝脏组织中GFP阳性细胞水平显著高于示踪对照组（t=8.92，P<0.01）；在心脏和肾脏组织中，示踪模型组GFP阳性细胞水平亦高于示踪对照组（P<0.05）；相比之下，肺组织和脾脏组织中两组GFP阳性细胞水平相近，差异无统计学意义（见图6）。

3 讨论

全球流行病学数据显示，ACLF的28 d病死率通常为30%~50%，90 d可超过60%^［7］，且多伴多器官功能障碍和严重并发症。尽管诊断标准日益统一，但目前针对ACLF的有效治疗手段仍极为有限，急需探索兼具有效性与安全性的治疗策略。在此背景下，本研究以标准化CCl₄诱导的ACLF小鼠模型为基础，系统观察了hUC-MSCs的治疗作用、安全性及体内分布规律。结果表明，单次静脉给药的hUC-MSCs可显著提高小鼠生存率，改善肝功能，并减轻组织损伤和纤维沉积；示踪实验进一步发现hUC-MSCs由肺部短暂停留后向肝脏、脾脏优先聚集，提示其具备损伤趋化归巢能力。这一发现与既往多集中于急性肝损伤模型的研究有所不同^［8，9］，本研究在ACLF复杂病理状态下同时验证了疗效、安全性与归巢分布的整合结果，拓展了hUC-MSCs在慢性基础上急性打击场景中的应用边界，为临床应用提供了关键的实验依据。

目前，普遍认为ACLF发病过程包括3个关键阶段：①以肝纤维化或肝硬化为代表的慢性肝病基础；②在此基础上，由感染、毒物或出血等诱因触发的急性肝细胞损伤事件；③随后系统性炎症反应的过度激活，表现为细胞因子风暴以及病原相关分子模式和损伤相关分子模式的释放，最终导致多器官功能障碍^［10］。本研究建立的CCl₄诱导性ACLF小鼠模型较好地模拟了疾病的3个关键阶段：首先通过连续8周腹腔注射20% CCl₄，构建稳定的慢性肝损伤背景；随后给予一次性50% CCl₄急性冲击，以诱导广泛肝细胞坏死；在慢性肝损伤基础上叠加急性肝细胞坏死后，大量损伤相关分子模式释放并诱发系统性炎症反应的过度激活，从而再现ACLF发病过程中“慢性基础+急性打击+炎症放大”的典型病理特征^［11］。在本研究中，建模后小鼠在短期内出现接近50%的死亡率，ALT、AST、TBIL及HA等指标显著升高，提示肝实质明显受损。病理学分析亦证实模型动物存在大面积肝细胞坏死及显著炎性细胞浸润，符合ACLF典型组织学特征。综上，该模型在发病机制及临床可模拟性方面较好地再现了ACLF的核心特征，具备良好的代表性和可重复性，为后续干预研究提供了可靠基础。

研究表明，MSCs在急性肝损伤及肝衰竭中可通过免疫调节、旁分泌效应及抗氧化等多重机制发挥肝保护作用^{［12，13］}。在此基础上，本研究以CCl₄诱导的ACLF小鼠模型为研究对象，系统评估了hUC-MSCs的治疗效果、安全性及体内分布特征。结果显示，hUC-MSCs干预显著提高了模型小鼠的生存率，并明显改善ALT、AST等肝功能指标，且在给药后24 h内即观察到ALT、AST水平的快速下降，提示hUC-MSCs能够在急性损伤早期即发挥显著的肝保护作用。与既往主要聚焦于急性肝损伤或单一肝衰竭模型的研究不同，本研究进一步在同时具备急性损伤与基础肝功能失代偿特征的ACLF模型中验证了hUC-MSCs的早期干预价值，提示其可能为ACLF的早期治疗提供一个可行的时间窗口。

免疫炎症反应失衡是ACLF发生发展的重要病理基础。既往研究表明，hUC-MSCs可通过抑制Th1/Th17细胞及M1型巨噬细胞活性，降低TNF-α、IL-1β和IFN-γ等促炎因子水平，同时促进Tregs及M2型巨噬细胞分化，增强IL-10、TGF-β等抗炎因子的分泌，从而重塑免疫微环境^{［14，15］}。在本研究中，HE染色结果显示，hUC-MSCs干预后肝组织坏死及炎性细胞浸润明显减轻，组织结构得到显著改善。这一病理学改变为hUC-MSCs在ACLF模型中发挥免疫调节和抗炎作用提供了直接的形态学证据，提示抑制过度炎症反应可能是其改善ACLF肝组织损伤的重要机制之一。

此外，ACLF的进展常伴随肝纤维化的加重，其发生发展与肝星状细胞（HSCs）活化及细胞外基质（ECM）过度沉积密切相关^［16］。已有研究指出，hUC-MSCs可通过抑制TGF-β/Smad信号通路中α-SMA的表达，并促进基质金属蛋白酶（MMPs）分泌，从而抑制HSCs活化并加速ECM降解^［17］。在本研究中，尽管实验后期HA水平仍呈上升趋势，但hUC-MSCs组HA水平显著低于PBS组，且Masson染色结果显示肝组织纤维沉积明显减少。这些结果提示，hUC-MSCs可能通过延缓纤维化进程、改善肝组织结构，为ACLF模型中肝脏修复创造更有利的微环境。该发现进一步拓展了hUC-MSCs在慢性肝纤维化模型中作用机制的认识，并提示其在ACLF相关纤维化调控中的潜在应用价值。

关于hUC-MSCs的体内分布特征，既往研究表明，MSCs经静脉输注后通常首先滞留于肺部，随后向损伤器官迁移，即所谓“肺部第一关口”现象^［18］。本研究利用Luc和GFP双标示踪体系并结合IVIS活体成像技术，对hUC-MSCs在体内的动态分布进行了系统追踪，结果显示，细胞在早期主要聚集于肺部，而随时间推移，肝脏等器官的荧光信号逐渐减弱，整体分布趋势符合既往报道的经典模式。值得注意的是，在168 h时，肝脏、脾脏及肾脏组织中仍可检测到GFP阳性信号，提示体内仍存在一定数量的hUC-MSCs，并可能定位于损伤或炎症相关组织。结合既往研究^［19］，这一现象可能与损伤微环境中趋化因子，如基质细胞衍生因子-1（SDF-1α）、细胞间黏附分子（ICAM-1）介导的炎症趋化作用密切相关。与此同时，本研究中在心脏等重要脏器中仅检测到极低水平的GFP信号，且未观察到明显的组织学异常，提示hUC-MSCs在ACLF小鼠体内具有较好的组织特异性分布特征及安全性。这一结果为hUC-MSCs在ACLF治疗中的进一步临床转化提供了实验依据。

尽管本研究结果具有一定代表性，但仍存在局限性。首先，动物模型难以完全复制临床ACLF的复杂病理过程，尤其在免疫反应和凝血障碍方面存在物种差异，可能限制其在高临床拟合度场景下的应用；其次，样本量有限，未进行长期随访，无法评价干细胞在更长时间内的存留及作用持续性；此外，本研究主要集中于表型及组织学层面的观察，尚未深入探讨信号通路及免疫分子网络的动态变化。因此，未来的研究方向应聚焦于构建多因素复合打击、具有器官间相互作用的高复杂度ACLF模型，结合多组学手段系统解析hUC-MSCs在免疫重编程与肝再生调控中的分子机制，并优化给药时机与剂量方案，以提高临床可转化性。

综上所述，本研究系统验证了hUC-MSCs在ACLF模型中的安全性与有效性，证实其可改善肝功能、减轻病理损伤并提高生存率。结合体内示踪结果，hUC-MSCs显示出明确的靶向归巢特性和良好生物安全性，为其在ACLF治疗中的临床转化提供了重要实验依据。

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基金资助

山西省重点研发计划项目(201903D421056)