亚精胺通过抑制神经元铁死亡发挥抗帕金森病神经保护作用

摘要

目的 探讨亚精胺降低脂质过氧化物积累、抑制神经元铁死亡、缓解帕金森病（Parkinson disease, PD）的作用机制。方法 30只7～8周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组、PD模型组和亚精胺治疗组，每组10只。PD模型组与亚精胺治疗组小鼠连续5 d腹腔注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP,30 mg/kg）建立PD小鼠模型；对照组小鼠腹腔注射等体积生理盐水；亚精胺治疗组自PD造模第1天起腹腔注射10 mg/kg亚精胺治疗，连续14 d。采用旷场实验测定小鼠运动总距离和平均运动速度，评价亚精胺治疗对PD小鼠模型行为学的影响。取小鼠黑质，经透射电子显微镜观察，并通过ELISA试剂盒测定黑质中丙二醛（MDA）、活性氧自由基（ROS）和Fe²⁺水平。Western blot法测定小鼠黑质铁死亡相关蛋白核因子E2相关因子2（Nrf2）、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）和血红素氧合酶-1（HO-1）的表达水平。Neuro2A细胞分为vehicle组、LPS组、亚精胺+LPS组、亚精胺+LPS+激活转录因子4短发夹RNA（ATF4 shRNA）组和亚精胺+LPS+非靶向短发夹RNA（shRNA NT）组。vehicle组不做任何处理，LPS组细胞加入100μg/mL LPS，亚精胺+LPS组细胞加入100μg/mL LPS和50μg/mL亚精胺，亚精胺+LPS+ATF4 shRNA组和亚精胺+LPS+shRNA NT组细胞分别转染ATF4 shRNA或shRNA NT后，加入100μg/mL LPS和50μg/mL亚精胺。采用RT-qPCR方法检测ATF4 mRNA;CCK-8法测定细胞增殖能力；ELISA法检测Fe²⁺、MDA水平；Western blot测定细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ、Beclin和p62的表达水平。结果 与对照组相比，PD模型组小鼠旷场实验运动总距离和平均运动速度降低（均P<0.05）;PD模型组小鼠黑质神经元出现肿胀、坏死或凋亡，神经元内线粒体内膜皱缩，嵴间隙变宽，膜密度增加；MDA、ROS、Fe²⁺水平升高（均P<0.05）;Nrf2、GPX4和HO-1蛋白相对表达降低（均P<0.05）。与PD模型组相比，亚精胺治疗组上述指标显著逆转（均P<0.05）。体外细胞实验，与vehicle组相比，LPS组细胞增殖能力降低（P<0.05）;Fe²⁺、MDA水平升高（均P<0.05）;LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ、Beclin相对表达水平降低（均P<0.05）,p62相对表达水平升高（P<0.05）;ATF4 mRNA相对表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。与LPS组相比，亚精胺+LPS组细胞增殖能力增强（P<0.05）;Fe²⁺、MDA水平降低（均P<0.05）;LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ、Beclin相对表达水平升高（均P<0.05）,p62相对表达水平降低（P<0.05）;ATF4 mRNA相对表达水平升高（P<0.05）。与亚精胺+LPS组相比，亚精胺+LPS+ATF4 shRNA组的ATF4 mRNA相对表达水平降低（P<0.05），且部分抵消了亚精胺处理对上述指标的逆转效果（均P<0.05）。结论 亚精胺通过上调ATF4的表达促进神经元自噬，逆转神经元内脂质过氧化物积累，抑制神经元铁死亡，从而缓解帕金森氏病。

关键词

帕金森病 / 亚精胺 / 神经元 / 脂质过氧化物 / 铁死亡 / 巨自噬 / ATF4