牛蒡子苷元通过抑制TLR4/MyD88/NF⁃κB通路改善创伤性骨关节炎大鼠的软骨损伤

Arctigenin improves cartilage damage in traumatic osteoarthritis rats by inhibiting TLR4/MyD88/NF-κB pathway

摘要

目的 探讨牛蒡子苷元（ATG）是否通过抑制Toll样受体4（TLR4）/髓样分化因子88（MyD88）/核因子κB（NF-κB）通路来改善创伤性骨关节炎（TOA）大鼠软骨损伤。 方法 将SPF级SD大鼠随机分为假手术（sham）组、TOA组、ATG-L组（15 mg/kg）、ATG-H组（30 mg/kg）和ATG-H+脂多糖（LPS，TLR4激活剂）组，每组10只。苏木精-伊红（HE）和番红O-固绿染色观察软骨组织形态并进行Mankin′s评分；末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）检测软骨细胞凋亡；酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清骨钙素（BGP）、碱性磷酸酶（ALP）和Ⅱ型胶原羧基端交联肽（CTX-Ⅱ）水平，软骨组织白细胞介素（IL）-6、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、IL-1β水平；羟胺法检测超氧化物歧化酶（SOD）活性，硫代巴比妥酸检测丙二醛（MDA）含量，比色法检测一氧化氮（NO）含量；蛋白免疫印迹法检测切割型半胱天冬酶-3蛋白（cleaved-Caspase-3）、基质金属蛋白酶-13（MMP-13）、TLR4/MyD88/NF-κB通路蛋白表达。 结果 与sham组比较，TOA组大鼠软骨组织有明显损伤，软骨细胞有明显死亡，软骨组织变薄，软骨基质中纤维成分增多，Mankin评分、软骨细胞凋亡率升高（P<0.05），血清BGP、ALP和CTX-Ⅱ水平升高（P<0.05），软骨组织中TNF-α、IL-1β和IL-6水平、NO和MDA水平、cleaved-Caspase-3、MMP-13、TLR4、MyD88和p-NF-κB/NF-κB蛋白表达水平升高（P<0.05），软骨组织中SOD活性降低（P<0.05）。与TOA组比较，ATG-L组和ATG-H组大鼠软骨组织形态有明显改善，软骨组织增厚，软骨基质中纤维成分减少，Mankin评分、软骨细胞凋亡率降低（P<0.05），血清BGP、ALP和CTX-Ⅱ水平降低（P<0.05），软骨组织中TNF-α、IL-1β和IL-6水平、NO和MDA水平、cleaved-Caspase-3、MMP-13、TLR4、MyD88和p-NF-κB/NF-κB蛋白表达水平降低（P<0.05），软骨组织中SOD活性升高（P<0.05）。LPS可降低ATG对TOA大鼠软骨损伤的改善作用（P<0.05）。 结论 ATG可能通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路来降低TOA大鼠炎症反应和氧化应激程度以改善关节软骨损伤。

Abstract

Objective To explore whether arctigenin（ATG） improves cartilage damage in rats with traumatic osteoarthritis（TOA） by inhibiting Toll-like receptor 4（TLR4）/myeloid differentiation factor 88（MyD88）/nuclear factor-kappa B（NF-κB） pathway. Methods SPF-grade SD rats were randomly divided into sham group， TOA group， ATG-L group（15 mg/kg）， ATG-H group（30 mg/kg）， and ATG-H+lipopolysaccharide（LPS， a TLR4 activator， 500 μg/kg）， with 10 rats in each group. HE and O-fixed green staining were used to observe the morphology of cartilage tissue and perform Mankin scoring. TUNEL was used to detect the apoptosis of chondrocytes； enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） was used to detect serum levels of osteocalcin（BGP）， alkaline phosphatase（ALP）， type Ⅱ collagen carboxyl-terminal cross-linked peptide（CTX-Ⅱ）， the levels of interleukin（IL-6）， tumor necrosis factor-α（TNF-α）， and interleukin-1β（IL-1β） in cartilage tissue. Hydroxylamine method was used to detect the activity of superoxide dismutase（SOD）， thiobarbituric acid was used to detect the content of malondialdehyde（MDA）， and colorimetric method was used to detect the content of nitric oxide（NO）. Western blotting was used to detect the expressions of cleaved-Caspase-3， matrix metalloproteinase-13（MMP-13）， and TLR4/MyD88/NF-κB pathway proteins. Results Compared with sham group， the mice in TOA group exhibited obvious cartilage damage， including cartilage thinning， matrix fibrosis， and increased cell death， accompanied by significantly elevated Mankin score and chondrocyte apoptosis rate（P<0.05）； serum levels of BGP， ALP， and CTX-Ⅱ were elevated（P<0.05）； the levels of TNF-α， IL-1β， IL-6， NO， and MDA in cartilage tissue were increased， while SOD activity was decreased（all P<0.05）； the protein expression levels of cleaved-Caspase-3， MMP-13， TLR4， MyD88， and the p-NF-κB/NF-κB ratio were all up-regulated（P<0.05）. Compared with TOA group， the cartilage tissue morphology was significantly improved， the cartilage thickness was increased， and the fibrous components in cartilage matrix were reduced in ATG-L group and ATG-H group； the Mankin score and the chondrocyte apoptosis rate were decreased（P<0.05）； serum levels of BGP， ALP， and CTX-II were lowered（P<0.05）； in cartilage tissue， the levels of TNF-α， IL-1β， IL-6， NO， and MDA were reduced while SOD activity was increased（P<0.05）； the protein expression levels of cleaved-Caspase-3， MMP-13， TLR4， MyD88， and p-NF-κB/NF-κB ratio were all down-regulated（P<0.05）. LPS administration attenuated the improvement effect of ATG on cartilage injury in TOA rats（P<0.05）. Conclusion Arctigenin may improve joint cartilage injury by reducing inflammatory response and oxidative stress in TOA rats via the inhibition of TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

牛蒡子苷元 / TLR4/MyD88/NF-κB信号通路 / 创伤性关节炎 / 软骨损伤 / 炎症反应 / 氧化应激

Key words

arctigenin / TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway / traumatic arthritis / cartilage injury / inflammatory response / oxidative stress

创伤性骨关节炎（traumatic osteoarthritis， TOA）是指由于创伤导致关节软骨、骨及周围软组织损伤，进而引起关节软骨退变、磨损，骨质增生等病理改变，临床主要表现为关节疼痛、肿胀、活动受限等^［1］。TOA主要由外部创伤及运动损伤引发，常见诱因包括交通事故、运动过度导致半月板损伤等^［2］。炎性细胞浸润、软骨组织结构破坏与TOA发生机制密切相关^［3］。目前尚缺乏有效治疗TOA的方案，因此急需探寻新的药物用于TOA的治疗。牛蒡子苷元（ATG）属于双环氧木脂素，是从中药牛蒡中提取的一种活性成分，具有抗炎、调节免疫和抗氧化等功效^［4］。研究显示，ATG可降低骨关节炎大鼠炎症和软骨细胞焦亡，改善软骨组织形态^［5］。另有研究表明，ATG可降低椎间盘炎症和细胞外基质降解，促进软骨自噬，改善软骨组织形态^［6］。上述研究提示ATG可降低炎症反应程度，减弱软骨损伤，但其具体作用机制尚不明确。Toll样受体4（TLR4）/髓样分化因子88（MyD88）/核因子κ轻链增强子结合蛋白（NF-κB）信号通路是一条重要的免疫相关信号传导通路，在炎症反应、免疫应答等过程中发挥重要作用^［7］。研究显示，抑制该通路可减轻膝骨关节炎兔软骨细胞凋亡、软骨退化和炎症，提高软骨细胞存活^［7］。另有研究发现，抑制该通路可减轻膝骨关节炎大鼠炎症和软骨退化，改善软骨形态^［8］。推测该通路参与骨关节炎发生发展过程。基于此，本研究探讨ATG对TOA大鼠是否具有软骨保护作用，并阐明其潜在机制是否与调控TLR4/MyD88/NF-κB信号通路有关，以期为TOA的药物治疗提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

SD雄性大鼠，SPF级，50只，体质量300~330 g，10周龄，购自河南省实验动物中心，生产证号：SCXK（豫）2022-0001。饲养条件：（22±2）℃，湿度60%±5%，光照为12 h（早7：00至晚7：00）。本研究符合动物伦理要求，并经太原钢铁（集团）有限公司总医院伦理委员会审批通过，编号：科审S2024第（107）号。

1.2 试剂和仪器

ATG（货号：HY-N0035）和TLR4激活剂脂多糖（LPS，货号：HY-D1056）购自美国MCE公司）；骨钙素（BGP，货号：ml106924）、碱性磷酸酶（ALP，货号：ml107021）、Ⅱ型胶原羧基端交联肽（CTX-Ⅱ，货号：ml038291）、白细胞介素（IL-6，货号：ml106838）、肿瘤坏死因子α（TNF-α，货号：ml106859）、白细胞介素（IL-1β，货号：ml107045）酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒购自上海酶联免疫生物科技有限公司；苏木精-伊红（HE）试剂（货号：G1120）、番红O-固绿染色试剂（货号：G1371）、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL，货号：T2130）、超氧化物歧化酶（SOD，货号：BC5165）、丙二醛（MDA，货号：BC0025）、一氧化氮（NO）试剂盒（货号：BC1475）购自北京索莱宝科技有限公司；NF-κB（货号：ab313430）、TLR4（货号：ab217274）、切割型半胱天冬酶-3蛋白（cleaved-Caspase-3）（货号：ab214430）、基质金属蛋白酶-13（MMP-13）（货号：ab315267）、β-肌动蛋白（β-actin）（货号：ab179467）、p-NF-κB（货号：ab239882）和MyD88（货号：ab131071）一抗及二抗IgG（货号：ab302644）购自英国Abcam公司。

CKX53显微镜、IX73荧光显微镜（上海门季生物科技有限公司）；LD-ZQP-86切片机（山东海曼科学仪器有限公司）；HBS-1101酶标仪（南京德铁实验设备有限公司）；HD-UV90紫外分光光度计（山东环美分析仪器有限公司）。

1.3 分组、造模与给药

按随机数字表法将大鼠分为5组：假手术（sham）组、TOA组、ATG-L组、ATG-H组、ATG-H+LPS组。除sham组外其余大鼠均建立TOA模型，腹腔注射戊巴比妥钠将大鼠麻醉，将大鼠左肢备皮消毒后切开膝关节的皮肤，暴露筋膜及前方关节囊，切断前交叉韧带，然后对膝关节髌骨进行复位，缝合并消毒处理，造模成功标志：行走时跛行，膝关节肿胀^［9］。sham组大鼠仅切开膝关节皮肤。

造模成功后第2天，ATG-L组和ATG-H组分别灌胃15 mg/kg和30 mg/kg的ATG^［5］，ATG-H+LPS组灌胃30 mg/kg的ATG并关节腔注射500 μg/kg的LPS^［10］，sham组和TOA组灌胃等体积生理盐水，1 d/次，持续28 d。

1.4 样本采集

治疗结束后，将大鼠麻醉，腹主动脉采血2 mL，切开左肢膝关节皮肤取出软骨组织，备测。

1.5 HE和番红O-固绿染色观察关节软骨组织形态

HE染色：取大鼠关节软骨样本，经4%多聚甲醛固定后，置于脱钙液中脱钙处理。依次完成清洗、脱水、石蜡包埋及切片步骤，经脱蜡后行HE染色，镜下观察软骨组织形态，根据文献［11］的方法进行Mankin′s评分，评分越高表明软骨组织损伤越严重。

番红O-固绿染色：将上述切片置于新配制的Weigert染液中染色5 min、盐酸乙醇分化15 s，水洗后固绿染色5 min、乙酸洗涤10 s，最后用番红O染液浸染5 min，于显微镜下观察。

1.6 TUNEL检测软骨细胞凋亡

取1.5中大鼠关节软骨切片，滴加TUNEL反应混合液和DAPI染色液，于荧光显微镜下观察，Image J分析细胞凋亡。

1.7 ELISA检测BGP、ALP、CTX-Ⅱ以及炎症因子水平

将血液置于4 ℃离心机中12 000 r/min离心10 min，取上清液用于BGP、ALP和CTX-Ⅱ水平检测；称取部分软骨组织，加入裂解液研磨匀浆后12 000 r/min离心10 min，取上清液用于TNF-α、IL-1β和IL-6水平检测。取上述上清液加入酶标管，再加入ELISA试剂盒中反应试剂、显色试剂，最后加入终止试剂，酶标仪检测吸光值，根据各因子标准曲线计算各指标水平。

1.8 SOD活性、MDA和NO含量的检测

称取部分软骨组织，加入预冷的无菌生理盐水后研磨匀浆，4 000 r/min离心10 min，取上清液加入离心管，再依次加入反应试剂、终止试剂，紫外分光光度计检测吸光值，根据标准品吸光值计算各因子水平。

1.9 Western blot检测蛋白表达水平

提取软骨组织总蛋白，BCA法分析蛋白浓度，将蛋白样品置于100 ℃水中水浴5 min，取10 μL进行电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入cleaved-Caspase-3、MMP-13、TLR4、MyD88、NF-κB、p-NF-κB和β-actin一抗（1∶5 000）4 ℃孵育过夜，二抗（1∶1 500）室温孵育2 h，置于ECL溶液中显色，曝光，以β-actin为内参分析蛋白灰度值。

1.10 统计学分析

采用Graphpad Prism 8.0.1分析数据。计量资料均符合正态分布，表示为均数±标准差（X±S），多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK⁃q检验。P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ATG对大鼠软骨组织形态的影响

sham组大鼠软骨表面平整无明显损伤；TOA组大鼠软骨表面有明显裂痕，软骨细胞形态变形且排列紊乱，软骨变薄，潮线结构模糊；ATG-L组和ATG-H组大鼠软骨组织形态有所改善；与ATG-H组比较，ATG-H+LPS组软骨组织形态损伤加重（见图1）。

TOA组大鼠Mankin′s评分高于sham组（P<0.05）；ATG-L组和ATG-H组Mankin评分低于TOA组（P<0.05）；ATG-H+LPS组Mankin′s评分高于ATG-H组（P<0.05，见图1）。sham组大鼠软骨组织和细胞外基质形态完整；TOA组软骨表面有缺损，染色不均匀，软骨细胞有明显死亡，软骨组织变薄，软骨基质中纤维成分增多；与TOA组比较，ATG-L组和ATG-H组软骨组织增厚，软骨基质中纤维成分减少；与ATG-H组比较，ATG-H+LPS组软骨组织损伤程度明显加重（见图2）。

2.2 ATG对大鼠软骨细胞凋亡率的影响

TOA组软骨细胞凋亡率高于sham组（P<0.05），ATG-L组和ATG-H组软骨细胞凋亡率低于TOA组（P<0.05），ATG-H+LPS组软骨细胞凋亡率高于ATG-H组（P<0.05，见图3）。

2.3 ATG对大鼠血清BGP、ALP和CTX-Ⅱ水平的影响

TOA组BGP、ALP和CTX-Ⅱ水平高于sham组（P<0.05）；ATG-L组和ATG-H组BGP、ALP和CTX-Ⅱ水平低于TOA组（P<0.05）；ATG-H+LPS组BGP、ALP和CTX-Ⅱ水平高于ATG-H组（P<0.05，见表1）。

2.4 ATG对大鼠软骨组织中TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影响

TOA组TNF-α、IL-1β和IL-6水平高于sham组（P<0.05）；ATG-L组和ATG-H组TNF-α、IL-1β和IL-6水平低于TOA组（P<0.05）；ATG-H+LPS组TNF-α、IL-1β和IL-6水平高于ATG-H组（P<0.05，见表2）。

2.5 ATG对大鼠软骨组织SOD活性、NO和MDA含量的影响

TOA组NO和MDA含量高于sham组，SOD活性低于sham组（P<0.05）；ATG-L组和ATG-H组NO和MDA含量低于TOA组，SOD活性高于TOA组（P<0.05）；ATG-H+LPS组NO和MDA含量高于ATG-H组，SOD活性低于ATG-H组（P<0.05，见表3）。

2.6 ATG对大鼠膝关节软骨组织相关蛋白表达的影响

TOA组cleaved-Caspase-3、MMP-13、TLR4、MyD88和p-NF-κB/NF-κB蛋白表达高于sham组（P<0.05）；ATG-L组和ATG-H组cleaved-Caspase-3、MMP-13、TLR4、MyD88和p-NF-κB/NF-κB蛋白表达低于TOA组（P<0.05）；ATG-H+LPS组cleaved-Caspase-3、MMP-13、TLR4、MyD88和p-NF-κB/NF-κB蛋白表达高于ATG-H组（P<0.05，见图4和表4）。

3 讨论

TOA是由于急性关节创伤或慢性重复性损伤导致的继发性骨关节炎，其主要病理特征为关节软骨的进行性退变、磨损及软骨下骨重塑等，最终引起关节疼痛和关节功能障碍，严重影响患者正常生活^［12］。目前临床针对TOA尚无理想的治疗方案，采取药物治疗可以缓解患者病痛，但尚不能有效治愈患者^［13］。因此，深入探究软骨损伤的分子机制并开发新的治疗药物，对治疗TOA具有重要意义。近年来，中医药在TOA治疗过程中展现出独特优势和较好的治疗效果，ATG化学式为C₂₁H₂₄O₆，是一种木脂素类化合物，具有调节免疫和代谢、抗氧化和抗炎等多种药理特性^［4］。Tang等^［14］研究显示，ATG可减轻骨关节炎小鼠炎症，降低细胞外基质降解，减轻软骨细胞损伤。胡笑燊^［15］研究表明ATG可预防软骨退变，减轻软骨细胞损伤。基于ATG的抗炎和软骨保护特性，我们推测其可能对TOA亦具有治疗潜力。

当关节遭受创伤时，外力可直接作用于关节软骨，导致软骨的磨损、撕裂或剥脱等软骨损伤，破坏软骨结构，使软骨组织失去正常的光滑表面和弹性，影响关节的正常功能。本研究通过HE和番红O-固绿染色发现，TOA大鼠软骨组织有明显损伤，软骨表面有明显裂痕，软骨变薄，软骨细胞存在明显凋亡，软骨基质中纤维成分增多；ATG可减轻软骨组织损伤，改善软骨形态，降低Mankin′s评分。TOA发生时，关节内的组织完整性遭到破坏，免疫细胞被激活，引发免疫反应，促使大量炎性细胞募集到损伤区域，这些炎性细胞可释放TNF-α、IL-1β、IL-6等大量促炎细胞因子，对软骨组织造成炎性损伤。同时炎症因子还可激活基质金属蛋白酶的表达与活性，促进软骨细胞外基质降解，导致软骨基质流失，软骨变薄^［16］。本研究中，ATG治疗可降低炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平和基质蛋白酶MMP-13表达，减轻炎性损伤和基质降解。CTX-Ⅱ胶原蛋白是软骨的主要成分，炎症因子可抑制CTX-Ⅱ蛋白等细胞外基质成分合成，同时软骨被破坏降解后，CTX-Ⅱ被释放进入血液，其血清浓度可作为软骨组织分解代谢的分子标志物^［17］；软骨损伤还会引发软骨下骨的一系列病理改变，导致骨代谢失衡，血清BGP和ALP水平升高^［9］；TOA发生后，关节结构损伤会引发局部微环境紊乱与氧化应激，造成ROS水平激增，过量的ROS通过氧化损伤破坏软骨细胞的生物大分子及细胞膜结构，干扰其正常代谢，最终诱导软骨细胞凋亡，推动TOA的病理进程^［18］。本研究结果显示，ATG治疗可降低血清BGP、ALP和CTX-Ⅱ水平、氧化应激产物NO和MDA含量、凋亡蛋白cleaved-Caspase-3表达，提高SOD活性，减轻软骨降解和软骨细胞凋亡，改善骨代谢。提示ATG可降低TOA大鼠炎症反应和氧化应激，进而改善关节软骨损伤。

TLR4/MyD88/NF-κB是一条炎症相关的信号转导通路，在识别病原体、启动免疫反应以及介导炎症过程中发挥重要作用。当TLR4识别到相应的配体后，其胞内结构域发生构象变化，招募MyD88，MyD88再通过一系列生物学作用可激活NF-κB，进而启动炎症相关基因表达，引发炎症反应。Wan等^［19］研究表明抑制该通路可减轻关节炎软骨细胞软骨退化和滑膜炎症。Jin等^［20］研究表明抑制该通路可改善骨关节炎兔活动状态和运动功能，减轻软骨组织损伤和炎症。本研究结果发现，TOA组TLR4、MyD88和p-NF-κB/NF-κB蛋白表达水平高于sham组，ATG干预后可逆转上述蛋白表达，抑制该通路。而且同时用ATG和LPS干预大鼠发现，LPS可降低ATG对TOA大鼠软骨损伤的改善作用，促进软骨组织损伤，提高Mankin评分、软骨细胞凋亡率、血清BGP、ALP和CTX-Ⅱ水平、软骨组织TNF-α、IL-1β和IL-6水平、NO和MDA水平、cleaved-Caspase-3、MMP-13、TLR4、MyD88和p-NF-κB/NF-κB蛋白表达水平，降低软骨组织SOD活性。提示ATG改善TOA大鼠软骨损伤可能与抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路有关。

综上所述，ATG可能通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路来降低TOA大鼠炎症反应和氧化应激，进而改善关节软骨损伤。本研究的核心意义在于从TLR4/MyD88/NF-κB通路阐明了ATG的软骨保护机制，为中药活性成分治疗TOA提供了新的实验依据和作用靶点，也为TOA的临床药物研发提供了潜在候选方向。但本研究仅从蛋白表达水平验证通路调控关系，未深入探究ATG与TLR4的直接结合作用，也未阐明通路下游调控炎症、氧化应激及凋亡的具体靶基因网络。后续研究将结合免疫共沉淀、荧光素酶报告基因等技术验证ATG与TLR4的相互作用及下游靶基因。

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基金资助

山西省卫健委卫生健康科研课题计划项目(2024109)