TNF⁃α通过上调NMDA受体NR1亚基磷酸化促进炎性痛大鼠热痛觉过敏

TNF⁃α promotes thermal hyperalgesia in inflammatory pain rats by up⁃regulating NR1 subunit phosphorylation of NMDA receptor in spinal cord

摘要

目的 探讨肿瘤坏死因子α（TNF-α）在完全弗氏佐剂（CFA）诱导炎性痛大鼠热痛觉过敏中的作用机制。 方法 为观察TNF-α抑制剂（anti‑rTNF‑α）对CFA炎性痛大鼠热痛行为以及脊髓组织内NMDA受体NR1亚基磷酸化（p-NR1）的影响，将大鼠随机分为对照组、CFA组、anti-rTNF-α组和CFA+anti-rTNF-α组。大鼠左侧脚掌皮下注射生理盐水或CFA，脚掌注射前24 h、2 h和注射后23 h鞘内注射vehicle或anti-rTNF-α，脚掌注射前2 d、注射后2 h和24 h检测热痛行为，即大鼠对热痛刺激的缩足反射潜伏期（PWL），热痛行为检测结束后取脊髓组织，采用Western blot检测p-NR1的表达。为观察鞘内注射重组TNF-α（rTNF-α）对大鼠热痛行为及脊髓组织中p-NR1的影响，将大鼠随机分为vehicle组、rTNF-α组、anti-rTNF-α组和anti-rTNF-α+ rTNF-α组。大鼠鞘内注射vehicle或anti-rTNF-α，间隔1 h后再鞘内给予vehicle或rTNF-α。鞘内注射前2 d、注射后0.5 h和2 h分别进行PWL检测，热痛行为检测结束后采用Western blot检测脊髓组织p-NR1的表达。 结果 与对照组相比，CFA组注射后2 h和24 h时PWL时程缩短（P0.01），注射后24 h时脊髓组织中p-NR1表达增加（P0.01）；与CFA组相比，CFA+anti-rTNF-α组注射后2 h和24 h时PWL时程延长（P0.01）。与vehicle组相比，rTNF-α组大鼠注射后0.5 h和2 h时PWL时程缩短，注射后2 h时p-NR1表达升高（均P0.01）；与rTNF-α组相比，anti-rTNF-α+rTNF-α组注射后0.5 h和2 h时PWL时程延长，注射后2 h时p-NR1表达降低（均P0.01）。 结论 脊髓中的TNF-α通过增加NMDA受体NR1亚基的磷酸化，促进CFA诱导的热痛觉过敏产生。

Abstract

Objective To investigate the role and mechanism of tumor necrosis factor-α（TNF-α） in the development of thermal hyperalgesia induced by complete Freund′s adjuvant（CFA）. Methods To observe the effects of TNF-α inhibitor （anti-rTNF-α） on thermal hyperalgesia and the phosphorylation of NMDA receptor NR1 subunit（p-NR1） in the rat model of inflammatory pain induced by CFA， rats were randomly divided into four groups： control group， CFA group， anti-rTNF-α group and CFA+anti-rTNF-α group. Saline or CFA was subcutaneously injected into the left hind paw of rats， and vehicle or anti-rTNF-α was intrathecally injected 24 h and 2 h before paw injection， and 23 h after paw injection. The paw withdrawal latency（PWL） in response to thermal nociceptive stimulation was assessed 2 d before paw injection， and 2 h and 24 h after paw injection. After the behavior test， spinal dorsal horn tissues were collected to detect the expression of p-NR1 by Western blot. To observe the effects of intrathecal injection of recombinant TNF-α（rTNF-α） on thermal hyperalgesia and spinal p-NR1 expression， rats were randomly assigned to four groups： vehicle group， rTNF-α group， anti-rTNF-α group and anti-rTNF-α+rTNF-α group. Rats received an intrathecal injection of vehicle or anti-rTNF-α， followed by an intrathecal administration of vehicle or rTNF-α 1 h later. PWL was measured 2 d before intrathecal injection， and 0.5 h and 2 h after intrathecal injection. After PWL assessment， spinal dorsal horn tissues were harvested to detect p-NR1 expression by Western blot. Results Compared with control group， PWL was significantly decreased at 2 h and 24 h after injection in CFA group（P0.01）， and spinal p-NR1 expression was increased（P0.01）. PWL was significantly increased at 2 h and 24 h after injection in CFA+anti-rTNF-α group compared to CFA group（P0.01）. Compared with vehicle group， PWL decreased at 0.5 h and 2 h after injection and p-NR1 expression increased in rTNF-α group（P0.01）. Compared with rTNF-α group， PWL at 0.5 h and 2 h after injection increased while p-NR1 expression decreased in anti-rTNF-α+rTNF-α group（P0.01）. Conclusion Spinal TNF-α can promote CFA-induced thermal hyperalgesia by enhancing the phosphorylation of the NMDA receptor NR1 subunit.

Graphical abstract

关键词

TNF-α / p-NR1 / 热痛觉过敏 / 完全弗氏佐剂 / 脊髓 / 大鼠

Key words

TNF-α / p-NR1 / thermal hyperalgesia / CFA / spinal cord / rats

炎性痛在临床是一类由外周组织炎症或者免疫反应引发的病理性疼痛，主要表现为痛觉过敏或者异常疼痛，严重影响患者生活质量^［1］。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是最早被发现、最具代表性的促炎细胞因子。临床研究发现，慢性腰痛、骨关节炎、类风湿关节炎患者脑脊液中^［2］、偏头痛患者血浆^［3］中的TNF-α水平升高，且与疼痛视觉模拟评分（VAS）正相关。大量动物模型也证实，角叉菜胶、完全弗氏佐剂（complete Freund's adjuvant，CFA）致炎后，脊髓组织中TNF-α显著升高，且与机械/热痛敏程度正相关^［4］。有研究发现脊髓内TNF-α主要来源于神经胶质细胞^［5］，其释放出的TNF-α可持续激活其他神经胶质细胞内的NF-κB通路^［6］，促进更多促炎因子（如TNF-α、IL-1β、IL-6）的合成以及释放，形成恶性循环，最终加剧脊髓组织内的炎症因子的水平。有研究发现抑制脊髓组织内TNF-α与TNF受体（TNFR）的结合能有效缓解疼痛行为^［6］。但是TNF-α如何参与疼痛相关热痛觉敏感发生的分子机制并不十分清楚。

谷氨酸是外周伤害性信号向脊髓传递的重要神经递质，促离子型NMDA受体是谷氨酸在突触间传递信号的关键受体。NMDA受体主要由多个亚基组装形成，NR1亚基是其功能必需亚基^［7］，NR1亚基的磷酸化可调控NMDA受体的激活^［8］。NMDA受体激活后增加钙离子通透性，促进钙离子内流入细胞，启动下游分子事件，最终可导致神经元兴奋性升高、产生突触可塑性。有研究发现TNF-α孵育可以增强离体脊髓切片上NMDA电流的幅度^［9］，提示NMDA受体及神经元的相关功能可能会被TNF-α所调控。因此，推测TNF-α可能通过调控NMDA受体NR1亚基磷酸化，促进热痛觉过敏的发生。为验证该假设，本研究采用完全弗氏佐剂CFA注射诱导的炎性痛模型，通过鞘内给药干预TNF-α的作用，观察TNF-α对NR1亚基磷酸化以及动物热痛行为的影响，探究促炎因子TNF-α在炎性痛热痛觉过敏中的作用及可能机制，以期为炎性痛的机制研究以及潜在治疗靶点提供研究证据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

CFA原液、beta-actin抗体购自德国Sigma公司，TNF-α抑制剂anti-rTNF-α及重组合成的rTNF-α均购自美国RD Systems公司，p-NR1抗体购自美国Millipore公司。热板刺激仪（Model 39 Hot Plate）购自美国IITC公司，酶标仪购自美国Molecular Devices公司，Western blot电泳、转膜及发光系统均购自美国Bio-Rad公司。

1.2 实验动物及分组

健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠，体重250~350 g，购自山西医科大学实验动物中心。本研究通过山西医科大学动物伦理委员会审批（批准号：SYDL2022001），动物实验严格遵循《实验动物护理和使用指南》。动物饲养在SPF级环境中，温度维持在（22±2）℃，湿度为50%±10%，12 h/12 h明暗循环。所有动物均给予标准食物和自来水。

本研究包括两部分：①为观察TNF-α抑制剂（anti‑rTNF‑α）对CFA炎性痛大鼠热痛行为以及脊髓组织内NMDA受体NR1亚基的磷酸化（p-NR1）水平的影响，将大鼠随机分为对照组、CFA组、anti-rTNF-α组和CFA+anti-rTNF-α组，每组6只。各组大鼠左侧脚掌皮下注射生理盐水或CFA（80 μL），脚掌注射前24 h、2 h和注射后23 h^［10］鞘内注射PBS（0.01 mol/L，pH 7.4，5 μL）或anti-rTNF-α（14 μmol/L，5 μL），anti-rTNF-α在脚掌注射前24 h行鞘内注射以阻断基础状态下脊髓组织内TNF-α的作用，在脚掌注射前2 h和注射后23 h行鞘内注射以阻断脚掌CFA注射诱导释放的TNF-α的作用。②为观察鞘内注射重组合成的TNF-α（rTNF-α）对大鼠热痛行为及脊髓组织中p-NR1的影响，将大鼠随机分为vehicle组、rTNF-α组、anti-rTNF-α组和anti-rTNF-α+rTNF-α组，每组6只。各组大鼠鞘内给予PBS（0.01 mol/L，pH 7.4，5 μL）或anti-rTNF-α（14 μmol/L，5 μL），间隔1 h后鞘内再次给予PBS（0.01 mol/L，pH 7.4，5 μL）或rTNF-α（24 μmol/L，5 μL）。

1.3 实验方法

1.3.1 炎性痛模型构建

按体积比1∶1将CFA与生理盐水混匀为悬浊液，大鼠左侧脚掌足底（80 μL）皮下注射，构建炎性痛模型。

1.3.2 鞘内埋管进行鞘内给药

1%的戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉动物。手术分离大鼠颈背侧枕骨大孔处的皮肤、肌肉，破坏寰枕膜。将充满生理盐水的PE-10管（约7 cm）沿椎管内侧从枕骨大孔下方插入至脊髓腰膨大固定插管并缝合伤口。手术后5~8 d对大鼠神经功能以及体重进行监测，有激惹行为、肢体瘫痪或体重明显下降失去原体重超过15%~20%的大鼠被剔除。术后恢复良好无上述表现的大鼠进入后续实验。

鞘内给药时，将动物进行快速气体麻醉，用微量进样器通过PE-10管将PBS（0.01 mol/L，pH 7.4， 5 μL）、anti-rTNF-α（14 μmol/L，5 μL）或rTNF-α（24 μmol/L，5 μL）分别注射进入脊髓腰膨大处，之后向PE-10管注入5 μL生理盐水。

1.3.3 热痛行为测试

热痛行为检测采用热板测痛法。检测前大鼠适应检测装置及周围环境2~3 d，适应期间热板不加热。检测前，热板预先加热并将温度维持在52 ℃。检测时，将大鼠放入恒温52 ℃的热板上，记录从放入到出现舔或者抬左后肢的时间，该时间被记录作为热痛刺激的缩足反射潜伏期（paw withdraw latency，PWL）。若超过30 s没有出现舔或者抬后肢的行为反应，将大鼠移出，并记录时间为30 s。每只大鼠进行3次检测，间隔15 min，取3次的平均值作为PWL时间。所有大鼠均在药物注射前2 d进行基础状态（baseline，0 h）测试，第1部分实验在脚掌注射CFA后2 h、24 h再次进行测试；第2部分实验在鞘内注射rTNF-α后0.5 h、2 h再次进行测试。

1.3.4 Western blot检测p-NR1表达水平

所有大鼠在热痛行为测试结束后采用戊巴比妥钠麻醉（100 mg/kg，腹腔注射），快速取出腰段脊髓背角组织并置于液氮中速冻。速冻后的组织加入蛋白裂解液于匀浆器中进行匀浆，4 ℃离心，收集上清液。之后进行蛋白定量、变性。利用SDS-PAGE电泳技术对蛋白进行电泳分离，之后转移至硝酸纤维素膜上，加p-NR1抗体（1∶1 000稀释）4 ℃孵育过夜，洗膜后孵育HRP标记二抗1 h（1∶3 000稀释），ECL化学发光显影，以β-actin的蛋白表达量作为内参。

1.4 统计学分析

采用GraphPad Prism 8.0统计软件对数据进行分析，所有数据均以均值±标准差（X±S）表示，行为学数据分析采用重复测量方差分析，组内多时间点比较采用Bonferroni法，不同时间点的组间比较采用Turky′s法；其他数据比较采用单因素方差分析，结果均以P0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 CFA脚掌注射对大鼠热痛行为的影响

两组大鼠的缩足反射潜伏期的主效应有统计学意义（F=302.4，P0.001），不同时间大鼠的缩足反射潜伏期的主效应有统计学意义（F=259.7，P0.001），分组和时间对缩足反射潜伏期的交互作用有统计学意义（F=236.7，P0.001）。大鼠脚掌注射药物之前，各组大鼠基础状态（0 h）时的热痛行为指标PWL在统计学上差异无显著性。对照组大鼠在生理盐水外周注入后的2 h和24 h，PWL时程与注射前相比没有明显改变；与注射前相比，CFA组大鼠在CFA注射后2 h和24 h时PWL明显小于注射前；与对照组相比，CFA组注射后2 h 和24 h的PWL值明显降低，差异具有统计学意义（P0.01，见图1）。

2.2 鞘内注射anti⁃rTNF⁃α对CFA脚掌注射诱导的热痛行为的影响

四组大鼠的缩足反射潜伏期的主效应有统计学意义（F=143.4，P0.001），不同时间大鼠的缩足反射潜伏期的主效应有统计学意义（F=131.4，P0.001），分组和时间对缩足反射潜伏期的交互作用有统计学意义（F=107.2，P0.001）。各组大鼠给予药物之前基础状态（0 h）时的PWL在统计学上差异无显著性。对照组和anti-rTNF-α组大鼠PWL时程在脚掌注射前后各时间点均没有明显差异；与CFA组相比，CFA+anti-rTNF-α组大鼠在预先鞘内注射anti-rTNF-α后PWL时程明显延长，差异具有统计学意义（P0.01，见图2）。

2.3 鞘内直接注射rTNF-α对大鼠热痛行为的影响

四组大鼠的缩足反射潜伏期的主效应有统计学意义（F=69.57，P0.001），不同时间大鼠的缩足反射潜伏期的主效应有统计学意义（F=24.20，P0.001），分组和时间对缩足反射潜伏期的交互作用有统计学意义（F=9.489，P0.001）。各组大鼠在给予药物之前基础状态（0 h）时的PWL在统计学上差异无显著性。与vehicle组大鼠相比，rTNF-α组大鼠在鞘内注射rTNF-α后0.5 h出现PWL时程明显下降，并持续至2 h（P0.01）；与rTNF-α组相比，anti-rTNF-α+rTNF-α组大鼠在预先鞘内注射anti-rTNF-α后PWL时程明显延长（P0.01）；vehicle组和anti-rTNF-α组大鼠PWL时程在给药前后没有明显改变（见图3）。

2.4 CFA脚掌注射对脊髓背角组织中p-NR1表达水平的影响

Western Blot检测结果显示，与对照组大鼠相比，CFA组大鼠在左侧脚掌注射CFA后，左侧脊髓背角组织中p-NR1表达明显增加（P0.01），右侧脊髓背角组织中p-NR1表达也明显增加（P0.01）；对照组和CFA组大鼠左右两侧脊髓背角组织中p-NR1表达水平相近，差异无统计学意义（见图4）。

2.5 鞘内注射rTNF-α对脊髓背角组织中p-NR1表达水平的影响

Western Blot检测结果显示，与vehicle组大鼠相比，rTNF-α组大鼠在鞘内注射rTNF-α 2 h后，双侧脊髓背角组织中p-NR1表达均明显增加（P0.01）；与rTNF-α组相比，anti-rTNF-α+rTNF-α组大鼠在预先鞘内注射anti-rTNF-α后，双侧脊髓背角组织中p-NR1表达均明显降低（P0.01，见图5）。

3 讨论

炎性痛产生多起自于外周的炎性损伤，常规药物治疗和康复物理治疗主要作用在外周，镇痛效果有限。疼痛的形成以及持续与中枢神经系统内分子作用的关系也极为密切，因此有必要对炎性痛时中枢神经系统内的分子机制进行探究。

本研究观察到，大鼠脚掌皮下注射CFA建立炎性痛模型，大鼠对热痛刺激的缩足反射潜伏期在2 h和24 h均显著下降，这表明，CFA外周皮下注射后大鼠表现出热痛觉敏感，并可持续一段时间，其他研究者发现，热痛敏至少可维持10 d^［9-11］。本实验利用CFA炎性刺激诱导的热痛觉敏感的痛行为表现，深入探究TNF-α在炎性痛热痛觉过敏中的分子机制。

既往临床研究和动物研究均发现多种类型的疼痛均表现出脑脊液和神经组织中TNF-α的升高^［2-4］。本研究发现，CFA炎性痛大鼠的热痛觉过敏可以通过鞘内给予TNF-α抑制剂anti-rTNF-α而被缓解。anti-rTNF-α是TNF-α的中和抗体，可特异性中和TNF-α，阻断TNF-α与其受体（TNFR）的结合。anti-rTNF-α对热痛觉行为的抑制说明TNF-α在热痛觉过敏发生中的必要性。为了进一步证实脊髓TNF-α的上调是热痛觉过敏发生的充分条件，本研究直接鞘内给予重组合成的rTNF-α，以模拟内源性TNF-α的作用，结果发现，大鼠对热痛刺激反应的PWL时程明显缩短，与CFA诱导热痛觉过敏行为反应相似，而这种行为反应也可被预先鞘内注射TNF-α抑制剂anti-rTNF-α缓解。本结果说明，脊髓组织内TNF-α升高是热痛觉过敏发生的充分必要条件。还有研究发现，CFA外周皮下注射还可以诱导脊髓组织中TNF-α受体TNFR的表达，敲除脊髓组织内TNFR后可缓解CFA诱导的热痛觉过敏^［9］。因此，脊髓组织内TNF-α升高是炎性痛热痛觉过敏产生过程中的关键分子过程。另有研究发现，脊髓组织中的TNF-α主要是由小胶质细胞和星形胶质细胞合成释放^［5］。这些结果说明神经胶质细胞在疼痛形成过程中的贡献亦不可忽略，未来疼痛的干预也可以以神经胶质细胞作为干预的靶点。

谷氨酸是脊髓水平处理痛信号的重要神经递质。NMDA受体是促离子型谷氨酸受体，主要允许钙离子内流，该受体激活后，离子通道开放，引发大量Ca²⁺内流，胞内Ca²⁺浓度快速升高，促发胞内分子过程。NMDA受体由多种亚基构成，主要由必需亚基NR1、调节亚基NR2及可选亚基NR3组装形成功能复合体，NR1亚基是受体功能必需亚基，调控受体膜定位与离子通透性^［7］；NMDA受体的活性受到磷酸化修饰调控，蛋白激酶可通过磷酸化受体亚基增强受体活性，而磷酸酶介导的去磷酸化则抑制受体活性^［8］。受体亚基磷酸化的调控机制使NMDA受体能够精准响应突触传递强度变化，在生理突触可塑性与病理中枢敏化中均发挥关键作用。应用免疫组织化学方法发现，NMDA受体的NR1亚基和TNFR共表达在神经元上^［11］。这一结果提示NR1亚基和TNFR可能存在有功能性联系。本研究对脊髓组织p-NR1的表达情况进行了检测，结果显示，CFA大鼠脊髓组织中p-NR1表达升高，直接鞘内注射rTNF-α后脊髓组织中p-NR1表达也升高，预先鞘内注射anti-rTNF-α可降低rTNF-α诱导的p-NR1表达。因此，TNF-α表达增高以及NMDA受体NR1亚基的磷酸化是CFA诱导热痛觉过敏发生的基础。此外，有研究采用TNF-α孵育离体脊髓片，发现神经元的自发兴奋性突触后电流（spontaneous excitatory postsynaptic currents， sEPSC）的频率和NMDA电流幅度均有增加^［9］。这一系列研究结果表明，NR1亚基磷酸化是TNF-α的下游分子机制。TNF-α通过增强NMDA受体NR1亚基的磷酸化水平，上调脊髓内神经元的兴奋性，使得更多疼痛信息上传进入高位中枢，成为炎性痛热痛觉敏感发生的重要机制。

本实验还对CFA左侧脚掌注射后左/右两侧的脊髓背角组织分别进行了p-NR1表达情况的检测。结果发现，相较CFA注射侧同侧脊髓，对侧脊髓的p-NR1表达水平与之相近，这提示单侧的伤害性刺激会导致脊髓中NR1受体的双侧磷酸化（镜像磷酸化）。有研究发现，单侧脚掌注射福尔马林可以诱导双侧脊髓组织内环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）的磷酸化^［12］。单侧踝关节外侧皮下注射CFA可引起脊髓双侧缝隙连接蛋白CX43表达增加^［13］。这些表现可能与镜像痛的产生相关。Obata等^［14］发现在坐骨神经损伤模型鼠鞘内注射促炎因子IL-1β、IL-6拮抗剂可缓解非损伤侧肢体出现的“镜像痛”。结合本研究结果，推测损伤侧脊髓组织释放的TNF-α可通过细胞外液或脑脊液扩散至对侧脊髓组织，进而激活对侧的神经胶质细胞，并兴奋对侧的神经元，促进NR1亚基的磷酸化，产生与同侧相近的生物学过程，进而参与了未刺激侧痛觉过敏的发生。这可能是人或动物单侧肢体受到损伤或者伤害性刺激后出现对侧镜像式疼痛过敏现象的基础。

TNF-α通过TNFR发挥作用。TNFR主要包括TNFR1和TNFR2两个亚型。神经损伤可以上调背根神经节内TNFR的表达^{［15，16］}，TNFR1主要表达在神经元，TNFR2主要表达在非神经细胞^［17］，提示TNF-α可能通过两种受体在不同类型的细胞发挥作用，而本研究采用的是非选择性的TNF-α抑制剂anti-rTNF-α，未能有效观察两种不同类型的TNFR所介导的不同作用。因此，TNF-α通过作用于哪种亚型的TNFR，之后通过什么机制，进而调控NR1磷酸化还有待进一步的研究证实。

综上，本实验揭示了脊髓组织内TNF-α在炎性痛热痛觉过敏形成中的分子机制。炎性痛时外周的伤害性信息传入脊髓，脊髓组织中TNF-α的释放增加，TNF-α上调NR1亚基磷酸化，神经元兴奋性增强、突触可塑性形成，最终引起热痛觉过敏的发生；鞘内应用TNF-α的抑制剂可降低NR1的磷酸化并缓解热痛觉过敏。本研究为揭示促炎因子参与脊髓痛信号调控的分子机制提供了实验证据，同时也明确提出促炎因子以及合成释放促炎因子的神经胶质细胞也可作为疼痛干预的靶点。

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基金资助

山西省自然科学基金面上项目(2012011042-4)

山西省留学人员科研资助项目(2011-045)