具有双重药物缓释功能的复合骨水泥材料的抗菌作用及促成骨性能

Antibacterial activity and osteogenic performance of composite calcium phosphate cements with dual drug sustained⁃release capability

摘要

目的 探究负载淫羊藿苷（ICA）和盐酸米诺环素（MH）明胶微球-磷酸钙骨水泥（GMs+CPC）材料的抗菌作用和促成骨性能，为种植体周围炎骨缺损再生治疗提供理想的骨替代材料。 方法 将复合骨水泥材料分为GMs+CPC组（明胶微球与磷酸钙骨水泥混合）、GMs（ICA+MH）+CPC组（同时负载ICA和MH药物的明胶微球与磷酸钙骨水泥混合）及GMs（ICA）/GMs（MH）+CPC组（负载ICA或MH药物的明胶微球与磷酸钙骨水泥混合）。采用抑菌环和菌落计数实验检测各组材料对牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌的抗菌作用。制备各组材料浸提液，将浸提液与骨髓间充质干细胞（BMSCs）共培养，检测碱性磷酸酶（ALP）活性的表达及成骨分化相关基因Runx2、骨钙素（OCN）、Ⅰ型胶原蛋白（Col-1）的表达。将各组材料植入兔股骨缺损区，通过HE和Masson染色观察新生骨情况，并分析Masson染色新生骨面积百分比，通过免疫组化染色检测OCN和Col-1在新生骨中的表达。 结果 GMs（ICA+MH）+CPC和GMs（ICA）/GMs（MH）+CPC对牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌均具有抗菌作用，其中GMs（ICA）/GMs（MH）+CPC的抗菌作用较强。浸提液与BMSCs共培养的第7天，GMs（ICA）/GMs（MH）+CPC组ALP活性和OCN mRNA表达水平均显著高于GMs（ICA+MH）+CPC组和GMs+CPC组（P0.05），各组间Runx2和Col-1的mRNA表达水平差异无统计学意义。动物标本组织学染色结果显示，相比于GMs+CPC组和GMs（ICA+MH）+CPC组，GMs（ICA）/GMs（MH）+ CPC组的新生骨量较多（P0.05），且骨小梁处OCN和Col-1的阳性染色强度增强。 结论 GMs（ICA）/GMs（MH）+CPC材料对种植体周围炎主要致病菌中牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌的抗菌作用较强且具有良好的促成骨效果。

Abstract

Objective To investigate the antibacterial effect and osteogenic properties of gelatin microspheres-calcium phosphate cement（GMs+CPC） loaded with icariin（ICA） and minocycline hydrochloride（MH），thus providing a promising bone substitute for the regenerative treatment of peri-implantitis-related bone defects. Methods The composite calcium phosphate cements were divided into three groups： GMs+CPC group（gelatin microspheres mixed with calcium phosphate cement）， GMs（ICA+MH）+CPC group（gelatin microspheres co-loaded with ICA and MH mixed with calcium phosphate cement）， and GMs（ICA）/GMs（MH）+CPC group（gelatin microspheres separately loaded with ICA or MH， then mixed with calcium phosphate cement）. The antibacterial effects of the materials against Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum were evaluated using Kirby-Bauer disk diffusion test and colony counting assay. Extracts of the materials from each group were prepared and co-cultured with bone marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）. Subsequently， the alkaline phosphatase（ALP） activity and the expression of osteogenic differentiation-related genes， including Runx2， osteocalcin（OCN）， and type Ⅰ collagen（Col-1）， were measured. The materials from each group were implanted into rabbit femoral defects. New bone formation was observed via HE and Masson staining， and the percentage of new bone area was calculated by Masson staining. The expressions of OCN and Col-1 in the newly formed bone were detected by immunohistochemical staining. Results Both GMs（ICA+MH）+CPC and GMs（ICA）/GMs（MH）+CPC exhibited antibacterial effects against P. gingivalis and F. nucleatum， and the antibacterial effect of GMs（ICA）/GMs（MH）+CPC was better. On the 7th day of co-culture of the extract with BMSCs， ALP activity and OCN mRNA expression in GMs（ICA）/GMs（MH）+CPC group were significantly higher than those in GMs（ICA+MH）+CPC group and GMs+CPC group（P0.05）， and the mRNA levels of Runx2 and Col-1 showed no significant difference among groups. Histological staining of animal specimens revealed that the newly formed bone in GMs（ICA）/GMs（MH）+CPC group significantly increased compared with the other two groups（P0.05）， and the positive staining intensities for OCN and Col-1 in the trabecular bone area were enhanced. Conclusion The GMs（ICA）/GMs（MH）+CPC material exerts strong antibacterial activity against the main pathogens of peri-implantitis， P. gingivalis and F. nucleatum， and good favorable osteogenic properties.

Graphical abstract

关键词

骨水泥 / 淫羊藿苷 / 盐酸米诺环素 / 抗菌活性 / 骨再生 / 种植体周围炎

Key words

calcium phosphate cement / icariin / minocycline hydrochloride / antibacterial activity / bone regeneration / peri-implantitis

种植体周围炎是一种发生在种植体周围组织的由牙菌斑引起的炎症状态，已成为导致种植体周围骨组织丧失、种植体松动和脱落最主要的生物并发症之一，患病率为19%~22%^［1，2］。重度种植体周围炎患者常需要手术治疗，缓解炎症的同时进行骨移植促进种植体周围的骨再生。磷酸钙骨水泥（calcium phosphate cement，CPC）不仅具有与骨组织相似的矿物相，还在生物相容性、可塑性和原位固化等方面表现出优异的性能，在骨科的疾病治疗上有着广阔的应用前景^［3］。然而，CPC的孔隙率有限，降解速度缓慢，缺乏成骨诱导和抗菌性能，限制了其在口腔种植体周围炎所致骨缺损再生修复中的应用^［4，5］。因此，对CPC材料进行改性以加快其降解速度，并负载药物使其兼具抗菌作用和成骨诱导性能，将有助于CPC材料在口腔炎症环境下骨缺损修复领域的广泛应用。

近年来，有学者将抗生素或其他抗菌物质与骨水泥结合，制备具有预防术后感染功能的骨水泥材料^［6，7］。然而，研究大多集中在术后感染的常见菌，如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌等细菌抗菌性能的研究。盐酸米诺环素（minocycline hydrochloride，MH）是目前临床治疗种植体周围炎和牙周炎常用的局部治疗药物^［8］。淫羊藿苷（icariin，ICA）是中药淫羊藿的主要活性成分之一，具有促进骨再生、抑制骨吸收、减轻炎症反应等作用^［9，10］。将CPC与抗菌及促成骨药物相结合，明确其对种植体周围炎主要致病菌的抗菌作用及促成骨性能，具有重要的研究价值。本研究主要探究同时负载ICA和MH两种药物的明胶微球（gelatin microspheres，GMs）与磷酸钙骨水泥混合的GMs（ICA+MH）+CPC材料和分别负载ICA和MH两种明胶微球与磷酸钙骨水泥混合的GMs（ICA）/GMs（MH）+CPC材料对种植体周围炎主要致病菌的抗菌作用及促成骨性能，为其在口腔种植体周围炎所致骨缺损再生治疗的应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

牙龈卟啉单胞菌（编号：ATCC33277）和具核梭杆菌（编号：ATCC10953）为本实验室冻存。SD大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）为本实验室冻存。6只成年雄性新西兰兔（体质量2.0~2.5 kg），购自西安迪乐普生物医学有限公司，实验动物生产许可资质编号：SCXK（陕）2019-002。

1.1.2 主要试剂及仪器

淫羊藿苷、盐酸米诺环素购自德国MedChemExpress公司，脑心浸液培养基（brain heart infusion， BHI）为美国BD公司产品，α- MEM培养液、胰蛋白酶、青霉素/链霉素购自美国HyClone公司，碱性磷酸酶检测试剂盒为中国碧云天公司产品，Trizol试剂、逆转录试剂盒及荧光定量试剂盒购自于瑞士Roche公司，骨钙素（OCN）和Ⅰ型胶原蛋白（Col-1）免疫组化抗体购自美国GeneTex公司。酶标仪购于美国BioTek公司，倒置相差显微镜及照相系统购自日本Nikon公司。

1.2 载药明胶微球/骨水泥复合材料的制备

采用油包水（W/O）系统制备明胶微球，在10%的明胶溶液中分别加入0.01 g ICA制备GMs（ICA）、2.4 g MH制备GMs（MH）、或同时加入0.01 g ICA和2.4 g MH制备GMs（ICA+MH）。α-磷酸三钙、CaCO₃、CaHPO₄·2H₂O与羟基磷灰石按质量比86∶5∶5∶4称量制备固相粉末。按质量比9∶1分别称取定量的骨水泥固相粉末和不同种类GMs，将其在玻璃平板上均匀混合。其中，制备GMs+CPC材料称取无药物负载的GMs，制备GMs（ICA+MH）+CPC材料称取GMs（ICA+MH），制备GMs（ICA）/GMs（MH）+CPC材料则按照质量比1∶1的比例称取GMs（ICA）和GMs（MH）。然后，按液固比0.4 mL/g抽取2.5% Na₂HPO₄的液体加入到固相粉末中，用调浆匙迅速搅拌后填入模具中排除气泡，脱模得到各组材料的圆柱试样，25 ℃室温干燥后存储备用^［11］。

1.3 复合骨水泥材料的抗菌性能检测实验

1.3.1 细菌培养

取牙龈卟啉单胞菌的冻存菌株涂于含有10%无菌脱纤维羊血的BHI培养板上（加氯化血红素和维生素K），取具核梭杆菌的冻存菌株涂于BHI培养板上，将两种细菌置于37 ℃厌氧箱内培养。复苏成功后挑取单菌落涂布于新的琼脂培养板上。待平板上形成形态均一的菌落后，挑取菌落接种至液体培养基中进行增菌培养。

1.3.2 抑菌环实验

将30 μL 牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌菌悬液（1×10⁸ CFU/mL）均匀铺在BHI培养板上，然后将固化灭菌的GMs+CPC、GMs（ICA+MH）+ CPC、GMs（ICA）/GMs（MH）+CPC实验材料（n=3）轻轻地放到BHI培养板中心。在37 ℃厌氧条件下培养3 d，通过测量材料周边的抑菌圈的直径，评价材料的抗菌能力。

1.3.3 菌落计数实验

用100 μL培养基湿润灭菌的固化GMs+CPC、GMs（ICA+MH）+CPC、GMs（ICA）/GMs（MH）+CPC实验材料，各样本体积为63.62 mm³（n=3），再将10 μL牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌的菌悬液（1×10⁷ CFU/mL）分别均匀滴加到材料上。在37 ℃条件下培养24 h，将材料转移到新的含有2 mL BHI培养液的离心管中，离心管强烈振荡30 s使细菌从材料上分离。然后，将分离的细菌悬液用BHI培养液稀释1 000倍。将30 μL分离的细菌悬液均匀地铺到琼脂培养板上，在37 ℃厌氧条件下培养3 d，观察活菌菌落。

1.4 复合骨水泥材料的促成骨分化实验

1.4.1 复合骨水泥材料浸提液制备

将制备的GMs+CPC、GMs（ICA+MH）+CPC、GMs（ICA）/GMs（MH）+ CPC材料称重，钴-60辐照灭菌。按每0.1 g材料加10 mL PBS浸泡材料，第3天提取所需浸提液，以1∶9的体积比将其与细胞培养液混合，备用。

1.4.2 ALP活性检测

将常规复苏的BMSCs接种于24孔板，在37 ℃、5% CO₂培养箱中培养24 h，更换培养液分别加入3组材料的浸提液。每3 d换1次培养液，培养至第7天，PBS漂洗3次，加入0.1% Triton X-100裂解30 min，收集上清液。按照ALP活性检测试剂盒操作说明书操作，计算细胞的ALP活性。

1.4.3 成骨相关基因检测

将BMSCs细胞接种到6孔板，在37 ℃、5% CO₂培养箱中培养24 h，更换培养液为3组材料的浸提液，并设立不加浸提液的培养液组作为对照。每3 d换1次液，培养至第7天，PBS漂洗3次，用TRIzol提取各组细胞的各组RNA，用cDNA反转录试剂盒反转录。配制SYBR Green qPCR反应体系，于实时荧光定量PCR仪中检测。以GAPDH为内参分析成骨相关基因Runx2、OCN和Col-1的表达水平。实验所需引物由Invitrogen公司合成，引物序列见表1。

1.5 复合骨水泥材料的动物实验

1.5.1 动物模型的建立

体质量为2.0~2.5 kg的成年雄性新西兰兔6只，用陆眠宁（0.1 mL/kg）肌内注射和5%戊巴比妥钠（0.3 mL/kg）耳缘静脉麻醉，将兔双侧股骨处皮肤脱毛，碘伏消毒，铺无菌单。分别于左右膝外侧切开皮肤及皮下组织，钝性分离肌肉，充分暴露股骨髁部，生理盐水降温下用磨钻制备直径6 mm的圆柱形骨缺损，分别植入GMs+CPC组、GMs（ICA+MH）+CPC组和GMs（ICA）/GMs（MH）+ CPC组对应的复合骨水泥材料，缝合切口。观察兔术后苏醒状态，连续3 d肌肉注射青霉素，观察伤口愈合情况。于术后4周耳缘静脉注射过量戊巴比妥钠处死所有动物，取股骨下段，生理盐水洗涤，4%多聚甲醛固定3 d。所有动物实验均符合西安医学院伦理委员会相关规定（伦理批号：XYLS2019139）。

1.5.2 组织学染色检测新骨生成

将固定的标本流水冲洗24 h，置于10% EDTA中脱钙5个月，每3 d换1次脱钙液。脱钙完成后流水冲洗12 h，乙醇分级脱水，常规石蜡包埋，切成厚度为5 μm连续薄片。用HE和Masson染色试剂盒染色，中性树胶封片，光镜观察骨形成情况。每个样本随机选取1张切片的3个视野拍摄图像，采用图像软件（Image J）分析Masson染色新生骨区域占整张图像的比值。

1.5.3　免疫组化染色检测成骨相关蛋白的表达组织处理及切片方法同1.5.2，将切片行OCN和Col-1抗体的免疫组化染色。一抗是鼠来源的OCN和Col-1（稀释度分别为1∶100和1∶200），二抗孵育后DAB显色，苏木素复染，乙醇梯度脱水，中性树胶封片，光学显微镜观察，细胞质呈棕黄色判定为阳性。

1.6 统计学分析

采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，计量数据用均数±标准差（X±S）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，P0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 复合骨水泥材料的抗菌性能

抗菌实验显示，GMs+CPC材料的周围未见抑菌环。GMs（ICA）/GMs（MH）+CPC材料对牙龈卟啉单胞菌的抑菌环直径大于GMs（ICA+MH）+CPC材料，两种材料对于具核梭杆菌的抑菌环直径接近培养板的直径。GMs+CPC组牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌的琼脂平板上均布满菌落。GMs（ICA）/GMs（MH）+CPC组牙龈卟啉单胞菌的琼脂平板上菌落数量显著少于GMs（ICA+MH）+CPC组，对于具核梭杆菌，两种材料的平板上均仅见少量菌落（见图1）。

2.2 复合骨水泥材料的促成骨分化性能

ALP活性检测结果显示，BMSCs在浸提液中培养第3天和第7天，GMs（ICA）/GMs（MH）+CPC组的ALP活性均显著高于GMs（ICA+MH）+CPC和GMs+CPC组（P0.05，见图2）。qRT-PCR检测结果显示，BMSCs在浸提液中培养7 d，GMs（ICA）/GMs（MH）+ CPC组OCN mRNA表达水平显著高于GMs（ICA+MH）+CPC和GMs+CPC组（P0.05），各组间Runx2和Col-1的mRNA表达水平差异无统计学意义（见图2）。

2.3 复合骨水泥材料的组织学分析

复合骨水泥材料植入4周，HE染色结果显示，GMs+CPC、GMs（ICA+MH）+CPC和GMs（ICA）/GMs（MH）+CPC组中均可见新生骨、成骨细胞和新生血管，新生骨包绕着纤维组织和未降解的复合骨水泥材料，且复合骨水泥材料内可见未完全降解的明胶微球。Masson染色结果显示，新生骨包绕着未完全降解的骨水泥材料，骨水泥材料内可见明胶微球。采用图像软件（Image J）对Masson染色新生骨区域占整张图片的比值进行分析，结果显示GMs（ICA）/GMs（MH）+CPC组的新生骨量多于GMs（ICA+MH）+ CPC和GMs+CPC组，差异具有统计学意义（P0.05，见图3）。

2.4 复合骨水泥材料的免疫组化分析

复合骨水泥材料植入4周，免疫组化染色结果显示各组骨髓、骨小梁处均出现一定面积成骨相关蛋白OCN和Col-1阳性染色区域，弱阳性表现为淡黄色染色，强阳性表现为棕黄色染色，未降解的复合骨水泥材料也染色呈棕黄色。相比于GMs+CPC和GMs（ICA+MH）+CPC组，GMs（ICA）/GMs（MH）+ CPC组OCN和Col-1骨小梁处的阳性染色强度增强（见图4）。

3 讨论

种植体周围炎已成为影响种植义齿使用年限、导致种植体松动脱落的重要病因^［12］。研究表明，在多数情况下单纯非手术方式治疗种植体周围炎，很难有效清洁受污染的种植体表面，并且不能引导骨缺损区域实现骨再生，常需要手术干预^［13］。手术治疗成功的关键之处在于彻底去除潜在的致病菌，对于种植体周围龈袋较深的病例，一般很难彻底清除袋底和种植体表面孔隙内的致病菌，因而导致种植体周围骨再生失败。研发一种同时兼具抗菌性能和促骨生成性能的骨移植材料，有效促进种植体周围炎的骨再生，一直是本领域的研究热点。

种植体周围炎的始动因子是菌斑生物膜，其中革兰阴性厌氧菌的数量和比例较高，是一种混合厌氧菌感染^{［14，15］}。针对两种种植体周围炎的主要致病菌牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌，本研究检测了复合骨水泥材料的抗菌性能，琼脂扩散实验和菌落计数实验结果显示，GMs+CPC材料无抑菌性能，ICA和MH药物的负载使得GMs（ICA+MH）+CPC和GMs（ICA）/GMs（MH）+CPC材料对于牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌均具有抑制作用。两种材料对于具核梭杆菌的抑制作用均较强，抑菌半径接近培养皿半径。而GMs（ICA）/GMs（MH）+CPC材料对于牙龈卟啉单胞菌的抑制作用显著强于GMs（ICA+MH）+CPC材料。由此可以推断，分别负载两种药物的复合骨水泥材料GMs（ICA）/GMs（MH）+CPC更有利于增强其对牙龈卟啉单胞菌的抗菌性能。ICA是一种黄酮类化合物，具有直接的抗菌活性，对牙龈卟啉单胞菌具有抑制作用^［11］。MH主要通过阻止细菌的蛋白合成而发挥抗菌作用，对龈下菌斑中的革兰阴性菌具有较强的抑菌效果^［16-18］。研究报道，ICA与MH联合应用对牙龈卟啉单胞菌表现出协同作用，对具核梭杆菌表现出相加作用^［11］。ICA可能通过β-内酰胺酶的抑制作用、离子泵失活、胞质膜不稳定或拓扑异构酶的抑制等作用来增强MH的抗菌效果^{［19，20］}。有研究表明，由17味中药组成的黄连上清软胶囊与MH联合应用可抑制牙菌斑的形成、杀灭龈沟液中的厌氧性病原菌、对种植体周围炎的治疗效果显著且安全性高^［21］。由此可见，某些中药成分与MH联合应用可表现出协同作用，提高MH对种植体周围炎主要致病菌的抗菌效果。

除抗菌性能以外，良好的成骨诱导性能以促进骨再生对于种植体周围炎的治疗也至关重要。ALP是一种钙结合转运蛋白，促进细胞成熟、钙化，可作为一个衡量细胞成骨分化的早期重要标记物^［22］。本研究结果显示BMSCs在浸提液中培养的第3天和第7天，GMs（ICA）/GMs（MH）+CPC组的ALP活性显著高于GMs（ICA+MH）+CPC和GMs+CPC组（P0.05），表明GMs（ICA）/GMs（MH）+CPC材料具有显著的促进BMSCs成骨分化作用。OCN与细胞矿化紧密相关，在一定程度上反映细胞的矿化能力。qRT-PCR的结果显示，GMs（ICA）/GMs（MH）+CPC组的OCN表达水平显著高于GMs（ICA+MH）+CPC和GMs+CPC组（P0.05），表明GMs（ICA）/GMs（MH）+CPC材料可促进BMSCs细胞的矿化水平。有研究报道ICA通过多种信号通路刺激BMSCs向成骨细胞分化，包括骨形态发生蛋白、丝裂原活化蛋白激酶、一氧化氮和典型的Wnt/β-catenin通路^［23-25］。MH作用于成骨细胞后，可促进细胞ALP和OCN的表达，促进成骨细胞增殖、成骨分化和矿化^{［26，27］}，且低浓度MH可通过调控Wnt/β-catenin通路实现诱导大鼠牙髓干细胞成骨分化^［28］。本研究的结果证实，同时负载ICA和MH的GMs（ICA）/GMs（MH）+CPC材料可促进BMSCs的ALP和OCN表达，从而促进BMSCs的成骨分化。

本研究采用股骨缺损再生的兔模型检测复合CPCs材料在体内促进骨再生的能力，HE和Masson染色结果显示，相比于GMs+CPC和GMs（ICA+MH）+ CPC材料，GMs（ICA）/GMs（MH）+CPC材料可显著促进骨组织再生。OCN不仅是成骨细胞生物活性和骨矿化的重要相关蛋白，也是评价骨形成的一个具体指标^［29］。Col-1是人体内含量最丰富的胶原蛋白，也是矿化骨中唯一存在的胶原蛋白，其代谢产物的合成和分解情况间接反映了骨形成^［30］。本研究OCN和Col-1的免疫组化染色结果显示，相比于GMs+CPC和GMs（ICA+MH）+CPC材料，GMs（ICA）/GMs（MH）+CPC材料OCN和Col-1在骨小梁处的阳性染色均有不同程度的加深，说明GMs（ICA）/GMs（MH）+CPC材料植入体内后能促使细胞分泌大量的OCN和Col-1，从而促进骨再生。

BMSCs的成骨分化是骨形成和修复的关键环节，受多种信号通路调控。其中，Wnt/β-catenin信号通路作为调控BMSCs成骨分化的核心途径，对骨形成具有重要的影响^［31］。大量研究发现，一些异黄酮、多糖和酚类化合物通过Wnt/β-catenin信号通路，平衡成骨细胞和破骨细胞分化^{［32，33］}。其中，ICA可通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进BMSCs的RUNX2、ALP和OPN表达^［34］。本研究体外实验结果证实，GMs（ICA）/GMs（MH）+CPC材料可促进BMSCs的ALP和OCN表达，从而促进BMSCs的成骨分化。其植入体内后能促使细胞分泌大量的OCN和Col-1，进而促进骨再生。但本研究仍缺乏实验进一步验证ICA和MH通过靶向调控Wnt/β-catenin信号通路促进BMSCs的成骨分化。在今后的研究中，本课题组将进一步探究ICA和MH对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用及分子机制，进而阐明GMs（ICA）/GMs（MH）+CPC材料促进骨再生的机理。

综上所述，GMs（ICA+MH）+CPC和GMs（ICA）/GMs（MH）+CPC材料均具有抑制牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌的作用，其中GMs（ICA）/GMs（MH）+ CPC的抗菌作用较强且具有促进BMSCs成骨分化和体内骨再生的作用。GMs（ICA）/GMs（MH）+CPC材料可作为一种具有抗菌和促成骨性能的骨替代材料用于种植体周围炎的治疗。

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基金资助

陕西省教育厅重点科学研究计划项目(24JR146)

陕西省科技厅基础研究项目(2024JC-YBQN-0966)

西安市未央区科技计划项目(202331)

西安医学院科技能力提升专项计划项目(2024NLTS070)

西安市科技计划项目(25GXKJRC00027)