基于代谢组学的糖链植物疫苗浸种处理对北柴胡化学成分的影响

Effects of glycan plant vaccine seed soaking on Bupleurum chinense DC. based on metabolomics

摘要

目的 探讨糖链植物疫苗浸种处理对北柴胡化学成分的影响。 方法 将北柴胡种子分为浸种组和未浸种组，浸种组以糖链植物疫苗进行浸种处理，未浸种组不做处理。两组样品采集后，采用基于超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱（UHPLC-Q-TOF-MS）的非靶向代谢组学技术分析浸种组与未浸种组北柴胡的代谢物差异；将采集的数据预处理后导入SIMCA软件进行主成分分析，初步观察两组样本的整体代谢分布趋势。采用t检验（P0.05）结合倍数变化（FC）值（如FC1.2或FC0.8）作为筛选标准筛选两组的差异代谢物；并通过MS-DIAL软件、在线数据库、二级碎片裂解规律等对差异化合物进行结构鉴定。 结果 主成分分析结果显示，未浸种组与浸种组北柴胡在得分图中呈现明显分离趋势，糖链植物疫苗浸种处理显著改变了北柴胡的整体化学成分组成。在浸种处理后，共有37种化学成分的积累水平发生显著改变：其中19种成分的含量显著上调，18种成分的含量则呈现下调趋势。进一步的差异化合物表征表明，浸种处理主要促进了黄酮类和皂苷类成分的积累。 结论 糖链植物疫苗浸种处理可显著改变北柴胡的化学成分，为糖链植物疫苗在柴胡生态种植中的应用提供了依据。

Abstract

Objective To explore the effect of seed soaking treatment with glycan plant vaccine on the chemical constituents of Bupleurum chinense DC. Methods Seeds of Bupleurum chinense DC. were divided into two groups： soaking group（treated with glycan plant vaccine） and non-soaking group（no treatment）. After sample collection， an untargeted metabolomics approach based on ultra-high performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry（UHPLC-Q-TOF-MS） was employed to compare the metabolite differences between the two groups. After preprocessing， the acquired data were imported into SIMCA software for principal component analysis（PCA） to preliminarily evaluate the overall metabolic distribution trends in the two groups. Differential metabolites were screened using a t-test（P0.05） combined with fold change（FC1.2 or FC0.8）. Structural identification of the diffe⁃rential compounds was then performed using MS-DIAL， online databases， and MS/MS fragmentation patterns. Results PCA results showed a clear separation in the score plot between non-soaking group and seed soaking group， indicating that seed soaking treatment with glycan plant vaccine significantly altered the overall chemical composition of Bupleurum chinense DC. Seed soaking treatment markedly changed the accumulation levels of 37 chemical constituents， among which 19 constituents were significantly up-regulated， while 18 constituents were down-regulated. Further characterization of the differential compounds revealed that seed soaking treatment predominantly promoted the accumulation of flavonoids and saponins. Conclusion Seed soaking treatment with glycan plant vaccine can significantly modify the chemical composition of Bupleurum chinense DC.， providing a rationale for the application of glycan plant vaccine in its ecological cultivation.

Graphical abstract

关键词

北柴胡 / 糖链植物疫苗 / 浸种处理 / UHPLC-Q-TOF-MS / 非靶向代谢组学 / 化学成分

Key words

Bupleurum chinense DC. / glycan plant vaccine / seed soaking treatment / UHPLC-Q-TOF-MS / untargeted metabolomics / chemical constituents

柴胡为伞形科植物柴胡（Bupleurum chinense DC.）或狭叶柴胡（Bupleurum scorzonerifolium Willd.）的干燥根^［1］，始载于《神农本草经》^［2］。柴胡为常用中药材，其性苦，味微寒，有疏散退热、疏肝解郁、升举阳气之功效^［3］，常用于感冒发热、口苦、咽干、胸胁胀满、月经不调等症状。研究表明柴胡含有种类丰富的三萜皂苷类、黄酮类以及挥发油类^［4-6］成分。北柴胡是山西的道地药材，在山西省的种植规模较大，主要集中在山西运城、临汾、长治等地，此外，山西大同、吕梁、忻州等地区也有相当规模的种植基地。山西北柴胡在药材市场具有较大影响。

近年来，柴胡在中医临床和中药工业的用量急剧增加，野生资源已经不能满足市场的需求，人工栽培是目前柴胡药材的主要来源。然而，柴胡种子在自然状态下萌发时间长、成苗率低。糖链植物疫苗是一种具有激活植物自身免疫、提高植物抗病与抗逆能力的糖类物质^［7］，国内外已获农药登记的糖链植物疫苗产品主要包括壳寡糖、葡寡糖和寡聚半乳糖醛酸^［8］。糖链植物疫苗浸种处理农作物可以促进种子较早发芽，利于增产增收，提高药材品质^［9-11］，但糖链植物疫苗在中药材中的应用尚未见系统研究和相关报道。

基于超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱（UHPLC-Q-TOF-MS）的植物代谢组学技术可以对植物样本提取物进行全面分析，快速、准确地识别不同样本之间的差异代谢物^［12］。近年来UHPLC-Q-TOF-MS技术广泛应用于快速鉴定药用植物化学成分以及差异代谢物识别，如藏药翼首草^［13］、人参^［14］、谷子^［15］等。本研究拟将糖链疫苗应用于北柴胡浸种过程，并基于植物代谢组学技术分析糖链疫苗浸种处理对北柴胡化学组成的影响，为北柴胡的生态种植模式研究提供参考。

1 材料与方法

本研究将北柴胡种子随机分为未浸种组和浸种组（糖链植物疫苗浸种处理）。两组种子在完全相同的环境条件下培养至预定的生长期。样本采集后，通过基于UHPLC-Q-TOF-MS的非靶向代谢组学技术对两组样本的化学成分进行检测。随后，结合多元统计分析筛选组间差异代谢物，旨在系统阐明疫苗浸种处理对北柴胡化学成分积累的影响。

1.1 材料和试剂

Agilent 1290超高效液相色谱购自美国安捷伦公司；Triple TOF 5600+高分辨质谱仪购自美国AB SCIEX公司；KQ5200E型超声波清洗器购自昆山市超声仪器有限公司；CPA225D型十万分之一分析天平购自德国Sartorius公司；Milli-Q纯水制备系统购自美国Millipore公司；质谱级甲酸、乙腈均购于美国Thermo Fisher Scientific公司；甲醇为分析纯，购自天津市大茂化学试剂厂。色谱分离采用Venusil XBP C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm， 1.8 μm）。

1.2 样品

糖链疫苗浸种的北柴胡（浸种组，JZ-1、JZ-2、JZ-3）以及未浸种处理的北柴胡（未浸种组，DZ-1、DZ-2、DZ-3），生长年限均为2年，种植于山西省平顺县试验田，经山西大学秦雪梅教授鉴定为伞形科植物柴胡（B.chinense DC.）的干燥根。

1.3 基于UHPLC-Q-TOF-MS的柴胡化学成分分析

1.3.1 供试品溶液及质量控制（quality control， QC）样本制备

取干燥北柴胡样品沿芦头剪下，根部粉碎，过100目筛。取北柴胡粉末约2.0 g，置于10 mL 锥形瓶中，加50%甲醇水溶液10 mL，涡旋1 min，超声提取30 min，放冷至室温，8 000 r/min离心10 min，取上清液，过0.22 µm微孔滤膜，得供试品溶液。取各批次北柴胡提取液等量混合，过0.22 µm微孔滤膜，得QC溶液。

1.3.2 色谱条件

色谱条件Waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 µm），流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈（B）；梯度洗脱（0~15 min，10%~40%B；15~28 min，40%~75%B；28~33 min，75%~95%B；33~35 min，95%~95%B；35~37 min，95%~10% B）。柱温为35 ℃，体积流量为0.3 mL/min，进样量为3 µL。

1.3.3 质谱条件

采用电喷雾离子源（ESI），分别于正离子与负离子模式下对不同处理方法下的北柴胡样本进行数据采集。检测模式为IDA（信息依赖采集模式）；喷雾电压为+3 500 V、-2 500 V；离子源温度为500 ℃；气帘气为30 psi；雾化气和辅助气分别为55 psi、50 psi；去簇电压为60 V；碰撞能量为40 eV；扫描范围m/z 50~1 500。

1.4 数据分析方法

将采集到的质谱原始数据采用XCMS软件进行数据预处理，得到的样品峰面积矩阵数据导入SIMCA-P13.0软件中进行主成分分析（principal component analysis，PCA），判断各样品的聚集情况，用正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least-squares discriminant analysis，OPLS-DA）分析组间差异代谢物，并通过倍数变化（fold change，FC）值和t检验最终确定。根据北柴胡化学成分的相关文献^{［16，17］}，结合MS-DIAL 4.6、在线数据库（Human Metabolome Database、PubChem、Lipid Maps、Massbank等）对差异代谢物进行定性鉴别，质量误差小于5 ppm、二级碎片离子符合相关的裂解规律。最后利用KEGG数据库对差异代谢物进行通路富集分析，以识别关键的代谢通路。

2 结果

2.1 多元统计分析

对糖链疫苗浸种处理与未浸种的北柴胡样品进行多元统计分析。首先对QC样本进行PCA分析，在正负离子模式下分别构建第一主成分的PCA得分散点图，5个QC样品均处于±2 SD范围内，表明在采样过程中仪器的精密度较高，分析结果可靠（见图1）。由第一主成分（ESI⁺：PC1=0.308，ESI^-：PC1=0.302）和第二主成分（ESI⁺：PC2=0.148，ESI^-：PC2=0.152）构建的PCA得分散点图可见，糖链疫苗浸种处理与未浸种的北柴胡具有一定分离趋势（见图1）。为了进一步确定两组北柴胡的差异化学成分，采用有监督的模式识别方法OPLS-DA对数据进行进一步分析，正离子下模型参数为R²X=0.708，R²Y=1，Q²（cum）=0.708；负离子下模型参数为R²X=0.583，R²Y=1，Q²（cum）=0.678（见图2）。其中，R²X和R²Y分别表示模型对自变量矩阵（X）和因变量（Y）的解释能力，其值越接近1说明模型拟合越好；Q²（cum）为累积交叉验证预测能力参数，用于评估模型的预测可靠性，通常认为Q²0.5时模型具有较好的预测能力。

以t检验（P0.05）结合FC值（FC1.2或FC0.8）为标准筛选糖链疫苗浸种处理与未浸种北柴胡的潜在差异代谢物，根据差异变量的一级、二级质谱数据，结合文献报道^{［16，17］}的北柴胡化学成分的质谱数据和裂解规律共鉴定出37种差异化合物，其中包括柴胡皂苷（9个）、黄酮（4个）、氨基酸（7个）、脂质（11个），其他类（6个）。37个差异代谢物的离子碎片信息见表1。进一步绘制37种差异代谢物的层次聚类分析热图，用于表示每个样品中差异化合物的相对含量的异同，并在代谢物维度上进行层次聚类。37种差异代谢物的相对含量在浸种处理后差异明显，其中有19种成分含量上升，有18种成分含量下降（见图3）。

与未经浸种处理的北柴胡组相比，对于皂苷类成分，除了山豆根皂苷Ⅶ降低之外，浸种处理后8种北柴胡皂苷类成分显著升高；此外，4种黄酮类化合物水平也显著升高。对于氨基酸类，除脯氨酰-亮氨酸的水平显著升高外，其余6种氨基酸水平均显著降低；11种脂类化合物中，6种脂肪酸、1种磷脂、1种脂肪酰胺的水平显著降低，1种鞘脂、1种磷脂、1种酰基乙醇胺的水平显著升高；6种其他类型化合物中，1种氨基酸衍生物、1种香豆素、1种有机酸的水平显著降低，而1种烯炔、1种倍半萜、1种香豆素的水平显著升高（见图4）。值得注意的是，浸种处理后脱落酸（ABA）含量亦显著升高。

2.2 相关代谢通路分析

进一步根据KEGG数据库对差异代谢物相关代谢通路进行分析。乙酰辅酶A（Acetyal-CoA）是皂苷类成分与脂肪酸类成分共同前体物质。Acetyal-CoA可进入三羧酸循环，与草酰乙酸共同合成柠檬酸，柠檬酸进一步生成丙二酰辅酶A，进而合成脂肪酸；另一方面乙酰辅酶A参与甲戊羟酸途径（MVA）合成3-异戊烯焦磷酸酯（IPP），与γ，γ-二甲基烯丙焦磷酸酯（DMAPP）共同合成2，3-氧化鲨烯进而生成皂苷类物质（见图5）。与未浸种组相比，浸种组北柴胡中脂肪酸类成分含量显著降低，8个皂苷类成分显著升高，提示糖链疫苗浸种处理后，可能减少脂肪酸类物质合成，增加皂苷类合成。

酪氨酸通过苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成途径生成苯丙氨酸，进而通过苯丙烷途径生成对香豆酰辅酶A，对香豆酰辅酶A进入桂皮酸途径与乙酸-丙二酸途径生成柚皮素，最终生成不同类型黄酮成分（见图5）。与未浸种组相比，浸种组北柴胡中酪氨酸含量显著降低，黄酮类成分含量显著升高，提示浸种处理增加了黄酮类成分的生物合成。

3 讨论

本研究基于UHPLC-Q-TOF-MS代谢组学技术并结合多元统计分析，共筛选并鉴定出37种在北柴胡浸种前后存在显著差异的化学成分。分析结果表明，糖链疫苗浸种处理对北柴胡中皂苷类和黄酮类有效成分的影响尤为显著，其整体含量均呈现明显上升趋势。乙酰辅酶A作为皂苷生物合成的前体物质，其含量变化与皂苷合成密切相关。推测，浸种处理可能通过促进脂肪酸β-氧化过程，提高乙酰辅酶A的生成量，进而推动皂苷类成分的合成积累。

此外，糖链疫苗浸种处理对黄酮类化合物的生物合成途径亦产生显著影响，具体表现为相关代谢产物积累增加。在对差异化合物进一步分析中发现，浸种处理后植物内源激素脱落酸的含量显著上升。脱落酸作为一种倍半萜类植物激素，已被多项研究证实可有效促进类黄酮代谢。例如，杨果等^［18］报道，脱落酸处理能够促使银杏叶片中花青苷和黄酮含量随时间推移持续上升；项妤等^［19］采用3.96 mg/L脱落酸喷施甘草叶面，使甘草苷质量分数由（0.353±0.090）%提升至（1.738±0.428）%，增幅达392%；Yamamoto等^［20］研究也表明，外源喷施脱落酸可显著增加葡萄果皮中花青苷含量。基于上述证据，本研究认为浸种处理所引起的黄酮类成分含量升高，可能与内源脱落酸水平的显著提升存在直接关联。

综上所述，糖链植物疫苗浸种处理有助于提高北柴胡中皂苷与黄酮类有效成分的含量，在促进增产、提升药材品质方面展现出潜力。然而，本研究仅设置了单一处理浓度，不同浓度糖链疫苗处理对北柴胡化学组成的影响及其最优处理条件尚待进一步系统研究。后续工作应围绕浓度梯度展开深入探讨，以明确其量效关系，为糖链疫苗在北柴胡生态种植中的科学应用提供充分依据。

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