闽南地区幽门螺杆菌耐药基因突变分析

Analysis of drug resistance gene mutations in Helicobacter pylori in Minnan region

摘要

目的 检测闽南地区幽门螺杆菌（Hp）感染患者中Hp及常用抗生素耐药基因突变情况。 方法 收集第九〇九医院病理科2025年1—6月经亚甲蓝染色诊断为Hp阳性胃黏膜石蜡组织样本280例，通过多重实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测样本的克拉霉素耐药23S核糖体核糖核苷酸（23S rRNA）基因、喹诺酮类耐药脱氧核糖核酸促旋酶A亚单位（gyrA）基因、阿莫西林耐药青霉素结合蛋白（PBPs）基因、四环素耐药16S核糖体核糖核苷酸（16S rRNA）基因及呋喃唑酮耐药丙酮酸黄素氧化蛋白还原酶（porD）和酮戊二酸氧化还原酶（oorD）基因，并分析耐药基因突变与临床因素的相关性。 结果 280例中，qRT-PCR法检出Hp阳性279例，阴性1例，与亚甲蓝染色法比较，阳性符合率为99.64%（279/280）。23S rRNA基因、gyrA基因、PBPs基因、16S rRNA基因突变率分别为45.88%（128/279）、33.69%（94/279）、3.58%（10/279）、3.58%（10/279），未发现porD和oorD基因突变；双重及多重耐药基因突变率为24.01%（67/279）。男性23S rRNA基因突变率低于女性［41.14%（72/175）vs 53.85%（56/104），P0.05］；23S rRNA基因、gyrA基因、PBPs基因、16S rRNA基因突变在不同年龄、不同疾病类型患者间差异无统计学意义（P0.05）。 结论 闽南地区23S rRNA基因及gyrA基因突变率高，PBPs基因、16S rRNA基因、porD和oorD基因突变率较低，23S rRNA基因突变可能与患者性别有关。

Abstract

Objective To detect Helicobacter pylori（Hp） and gene mutations associated with resistance to commonly used antibiotics in Hp-infected patients in Minnan region. Methods A total of 280 paraffin-embedded gastric mucosal specimens confirmed as Hp-positive by methylene blue staining were collected from the Department of Pathology of the 909th Hospital from January to June 2025. Multiplex real-time quantitative polymerase chain reaction（qRT-PCR） was performed to detect mutations in the 23S ribosomal ribonucleic acid（23S rRNA） gene（related to clarithromycin resistance）， deoxyribonucleic acid gyrase subunit A（gyrA） gene（related to quinolone resistance）， penicillin-binding protein（PBPs） gene（related to amoxicillin resistance）， 16S ribosomal ribonucleic acid（16S rRNA） gene（related to tetracycline resistance）， and pyruvate flavodoxin oxidoreductase D（porD） and 2-oxoglutarate oxidoreductase D（oorD） genes（related to furazolidone resistance）. The correlations between antibiotic resistance gene mutations and clinical factors were further analyzed. Results Among the 280 specimens identified as Hp-positive by methylene blue staining， 279 were confirmed as Hp-positive and one was negative by qRT-PCR. Compared with methylene blue staining， the positive concordance rate was 99.64%（279/280）. The mutation rates of 23S rRNA， gyrA， PBP and 16S rRNA genes were 45.88%（128/279）， 33.69%（94/279）， 3.58%（10/279）， and 3.58%（10/279）， respectively. No mutations were detected in the porD or oorD genes. The mutation rate of dual⁃ and multi-drug resistance genes was 24.01%（67/279）. The mutation rate of the 23S rRNA gene in male patients was 41.14%（72/175）， which was significantly lower than that in female patients（53.85%，56/104，P0.05）. No statistically significant differences were observed in the mutation rates of the above-mentioned four genes among patients with different age or disease types（P0.05）. Conclusion In Minnan region， the mutation rates of the 23S rRNA and gyrA genes are relatively high， while those of the PBPs， 16S rRNA， porD and oorD genes are low. The mutation rate of the 23S rRNA gene may be associated with patient sex.

Graphical abstract

关键词

幽门螺杆菌 / 胃癌 / 抗生素 / 耐药 / 基因突变 / 实时荧光定量聚合酶链反应

Key words

Helicobacter pylori / gastric cancer / antibiotics / drug resistance / gene mutation / qRT-PCR

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）是一种革兰阴性微需氧菌，呈螺旋状，寄生于人类胃黏膜中^［1］。Hp感染与慢性活动性胃炎、胃十二指肠溃疡、肠化生、上皮内瘤变、胃癌及胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤的发生密切相关^［2］。1994年，国际癌症研究机构将Hp列为Ⅰ类致癌物^［3］。我国Hp感染率接近50%^［4］，国内外共识均指出，只要确诊Hp感染，除非存在抗衡因素，均应接受根除治疗^［5，6］。根除Hp有助于促进活动性胃炎和胃十二指肠溃疡的康复，阻止胃黏膜萎缩、肠化生及上皮内瘤变的进展，有效降低胃癌和胃黏膜淋巴瘤的发生风险^［7］。目前，临床上常用的根除Hp感染方法是含铋剂的四联疗法，即质子泵抑制剂、铋剂联合2种抗生素（常用抗生素包括甲硝唑、左氧氟沙星、克拉霉素、阿莫西林、四环素、呋喃唑酮6种）^［8］。然而，随着Hp经验性治疗的普及和抗生素的广泛使用，Hp耐药率不断上升，根除成功率逐渐下降，且存在地域差异^［9］。Hp耐药基因突变是导致抗生素耐药的主要原因^［8］。因此，检测Hp耐药相关基因及其突变位点，以指导临床精准用药，提高Hp根除率，具有重要的临床意义和社会价值。目前，闽南地区关于Hp耐药基因突变的研究鲜有报道。本研究采用qRT-PCR方法对280例胃黏膜活检组织进行Hp及其相关耐药基因检测，分析其耐药基因突变情况及趋势，旨在为本地区经验性用药及难治性Hp患者的精准抗生素选择提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源

收集第九〇九医院病理科2025年1月至2025年6月明确诊断为Hp感染胃黏膜石蜡组织样本280例。其中女性105例，男性175例；年龄19~82岁，中位年龄（58±5）岁。按病理诊断结果分为慢性炎症（包括非萎缩性胃炎及萎缩性胃炎）183例，肠上皮化生62例，上皮内瘤变35例。纳入标准：①样本为胃黏膜活检组织；②胃黏膜石蜡切片亚甲蓝染色阳性；③患者常年居住（连续居住1年以上者）于闽南地区；④有足够组织样本细胞进行抗生素耐药基因联合检测；⑤患者及家属了解实验内容并签署知情同意书。排除标准：①患者非常年居住闽南地区；②患者活检前1月内有服用抗生素、质子泵抑制剂、H_２受体拮抗剂。本研究通过第九〇九医院伦理委员会审核（审批号：20251209）。

1.2 试剂与仪器

RM2245石蜡切片机购于德国徕卡有限公司；石蜡包埋组织切片核酸一步式提取试剂盒、HF24全自动核酸纯化仪购于厦门恺硕生物科技有限公司；幽门螺杆菌染色液购于泰普生物科学有限公司；试剂盒A（幽门螺杆菌克拉霉素耐药基因与喹诺酮类耐药基因突变检测试盒）和试剂盒B（耐呋喃唑酮、耐四环素及耐阿莫西林幽门螺杆菌核酸检测试剂盒）均购于江苏默乐生物科技股份有限公司，7500实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.3 亚甲蓝染色检测幽门螺杆菌

将胃黏膜石蜡切片放于自动染色机脱蜡至蒸馏水，最后用蒸馏水冲洗；取出切片，放在染色架上自然沥干水分；根据组织大小滴1~2滴亚甲蓝染色液把切片组织掩盖，染色5 min后，用自来水冲洗约2 s；将冲冼过的切片放置在50~60 ℃的烘箱中5 min；取出，用中性树胶封固；在物镜为40×的显微镜下观察结果，由中高级病理医师复核。幽门螺杆菌呈紫蓝色弯曲杆状、S形或海鸥翼状，胃组织的细胞核呈蓝色，细胞浆呈红色。见到紫蓝色菌判断幽门螺杆菌阳性。

1.4 qRT-PCR检测幽门螺杆菌

1.4.1 幽门螺杆菌DNA的提取

选取胃黏膜幽门螺杆菌检测阳性的石蜡包埋组织蜡块，按4~8 μm的厚度进行切片，取10~15片于1.5 mL离心管中（视标本组织量增减切片数量），用于幽门螺杆菌DNA提取。样本DNA提取操作方法及步骤严格按石蜡包埋组织切片核酸一步式提取试剂盒说明书进行。所提DNA需立即检测，或-20 ℃保存。

1.4.2 幽门螺杆菌耐药基因检测

从试剂盒A和B中各取出引物探针和检测缓冲液，在2~8 ℃融化，取出混合酶液，将所有试剂轻微混匀，短暂离心。试剂盒A和B每人份各按照检测缓冲液12.5 μL、引物探针7.0 μL、混合酶液0.5 μL进行PCR反应体系的配制。计算好各试剂使用量，加入离心管中，充分混匀，短暂离心。PCR反应液的总量应满足临床样本的个数、1管阳性质控品和1管阴性质控品。PCR反应液配制完毕，进行PCR反应液的分装，PCR反应液A、B分别以每管20.0 μL分装于不同PCR反应孔，依次取5 μL待检测样本、阳性质控品和阴性质控品于加有PCR反应液的反应孔中；混匀，短暂离心。将反应管放入荧光PCR检测仪中，循环参数设置如下；42 ℃，2 min，1个循环；95 ℃，2 min，1个循环；95 ℃，10 s，58 ℃，45 s（采集荧光），40个循环。

1.4.3 结果判断

幽门螺杆菌16 S核糖体核糖核苷酸（16S ribosomal ribonucleicacid， 16S rRNA）基因阳性，提示Hp阳性。克拉霉素耐药23S核糖体核糖核苷酸（23S ribosomal ribonucleicacid， 23S rRNA）基因检测包括2143C、2143G、2144G 3个突变位点；喹诺酮类耐药脱氧核糖核酸促旋酶A亚单位（deoxyribonucleic acid gyrase subunit A， gyrA）基因的基因检测包括260T、261G、261A、271A、271T、272G这6个突变位点；阿莫西林耐药青霉素结合蛋白（penicillin binding proteins， PBPs）基因检测包括A320V、F366L、V374L、L423F、T556S、N562Y这6个突变位点；四环素耐药16S rRNA基因检测包括3个突变位点：A926C、G927T、A925C；呋喃唑酮耐药丙酮酸黄素氧化蛋白还原酶（pyruvate oxidoreductase， porD）和酮戊二酸氧化还原酶（oxoglutarate oxidoreductase，oorD）基因检测包括3个突变位点：C347G、A335G、C349A-G；以上其中任何1个位点或多个位点突变，均提示Hp对此抗生素耐药。基因突变结果的判读严格按照试剂盒说明书阳性判断值及检验结果的解释进行，PCR仪检测通道设置见表1。

1.5 统计学分析

采用SPSS 21.0统计软件分析，基因突变以例（%）表示，不同临床特征组间比较用χ²检验，以P0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 qRT-PCR法检出Hp阳性情况

亚甲蓝染色检测幽门螺杆菌阳性呈紫蓝色弯曲杆状、S形或海鸥翼状（见图1）。经亚甲蓝染色筛选出的280例Hp阳性样本中，用qRT-PCR法检出Hp阳性279例，阴性1例，与亚甲蓝染色法检出Hp阳性比较，阳性符合率为99.64%（279/280）。

2.2 Hp常用5种抗生素耐药基因突变检测结果

279例qRT-PCR法检测Hp阳性样本中克拉霉素耐药基因突变率45.88%，喹诺酮类耐药基因突变率33.69%，阿莫西林耐药基因与四环素耐药基因的突变率均为3.58%；未发现呋喃唑酮耐药基因突变（见表2）。

2.3 Hp常用5种抗生素耐药基因双重突变及多重突变情况

闽南地区Hp阳性患者对5种抗生素耐药基因双重突变及多重突变的总突变率为24.01%（67/279），其中双重突变占20.79%（58/279），三重突变占3.23%（9/279），未见四重及以上抗生素耐药基因突变（见表3）。

2.4 Hp阳性患者耐药基因突变与病理特征的关系

对279例Hp阳性患者耐药基因突变与病理特征关系分析发现，男性23S rRNA基因突变率［41.14%（72/175）］低于女性［53.85%（56/104）］，差异有统计学意义（P0.05）；gyrA基因、PBPs基因、16S rRNA基因突变在不同性别患者间差异无统计学意义（均P0.05）；23S rRNA基因、gyrA基因、PBPs基因、16S rRNA基因突变在不同年龄、不同疾病类型患者间差异无统计学意义（P0.05，见表4）。

3 讨论

Hp感染是一种感染性疾病，随着临床抗生素的广泛使用，Hp单重及多重耐药率升高，导致难治性Hp感染者增多，Hp根除率持续下降。《马斯特里赫特Ⅵ/佛罗伦萨共识》报告指出根除Hp治疗应根据当地抗生素耐药性结果选择敏感抗生素^［6］。目前药物敏感度试验是判断Hp耐药性的金标准，但该方法需要体外培养Hp，耗时较长，培养条件苛刻，且敏感度偏低，很难在临床上广泛使用^［10］。基于分子生物学的Hp耐药基因检测，具有快速、简便、特异性和敏感性高等特点，被中国第六次全国幽门螺杆菌感染处理共识报告（非根除治疗部分）推荐为主要方法^［5，10］。其中，qRT-PCR技术利用几种不同荧光基团的组合，可同时检测Hp及其耐药基因，有较高的敏感性和特异性，用于Hp耐药基因突变检测，具有重要价值^［11］。

克拉霉素通过与细菌核糖体50S亚基中23S rRNA分子V结构域肽基转移酶环结合，促使肽酰基tRNA从受体位点提前释放，干扰肽链继续伸长，抑制蛋白质合成，达到抗菌作用；Hp对克拉霉素的耐药性主要是由于23S rRNA基因V结构域的点突变引起，以A2143G和A2144G点突变常见^{［12，13］}。喹诺酮类抗生素通过抑制DNA回旋酶活性，干扰细菌DNA的合成，达到抗菌作用；Hp对喹诺酮类抗生素的耐药性与编码DNA回旋酶中的gyrA基因的点突变相关，以C261A/G、G271A/T、A272G点突变常见^［12］。多项研究证实克拉霉素和喹诺酮类的表型耐药和基因型有较高的一致性，主要由Hp的23S rRNA和gyrA基因的常见位点突变所决定^{［10，14，15］}。有研究报道中国人群Hp对克拉霉素及喹诺酮类基因型耐药率分别为50.90%及33.00%^［15］，与本研究克拉霉素基因型耐药率45.88%，喹诺酮类基因型耐药率33.69%相近。

阿莫西林通过干扰细菌肽聚糖的合成来抑制细胞壁的合成，达到抗菌作用；Hp对阿莫西林的耐药性主要源于PBPs基因的突变^［16］。四环素通过结合Hp核糖体30S亚基中的16S rRNA，干扰蛋白质合成而发挥抗菌作用；Hp对四环素的耐药性主要与16S rRNA结合位点的突变相关，以926-928位点常见^［17］。呋喃唑酮通过阻碍Hp核糖体蛋白质等的合成，干扰细菌代谢和导致DNA损伤，发挥抗菌作用；Hp对呋喃唑酮耐药性主要与porD和oorD基因突变相关^［18］。另外，有研究表明阿莫西林、四环素及呋喃唑酮耐药性表型与基因型之间的一致性不佳，主要原因是这些突变与耐药性之间的相关性并不完美，以及可能存在其他与耐药性相关的突变未检出^［19］。有研究报道中国人群Hp对阿莫西林、四环素及呋喃唑酮基因型耐药率分别为3.23%，1.65%及2.05%^［20］，与本研究阿莫西林、四环素及呋喃唑酮基因型耐药率（3.58%，3.58%及0.00%）相近。

本研究结果显示，qRT-PCR方法检出Hp阳性279例，阴性1例，与亚甲蓝染色方法结果高度一致，这也表明亚甲蓝染色初筛阳性具有极高的可信度。本研究结果还显示男性23S rRNA基因突变率（41.14%）低于女性（53.85%），男性gyrA基因、PBPs基因及16S rRNA基因突变率均低于女性，但统计学比较差异无统计学意义，可能与男性患者相比，女性因妇科疾病使用抗生素的频率较高，更容易产生耐药基因突变；5种抗生素耐药基因突变率与年龄、疾病类型间比较差异无统计学意义，与文献报道^［21］相符。本研究结果显示5种抗生素耐药基因双重突变及多重突变的总突变率为24.01%，其中双重突变占20.79%，以23S rRNA及gyrA基因突变为主；三重突变占3.23%，未见四重及以上抗生素耐药基因突变；与文献报道^［22］双重及多重耐药Hp菌株的类型存在差异，可能与不同区域的临床用药习惯不同有关。本研究的主要局限性在于：Hp感染存在地域差异，且本研究样本量较少；试剂盒检测基因位点有限，可能会丢失部分基因突变导致耐药性产生的数据。因此，后续研究中需进一步加大Hp耐药基因检测例数，并分析闽南地区Hp耐药基因突变与临床因素的相关性；针对基因型对阿莫西林、四环素及呋喃唑酮的敏感性，仍需加大样本量深入研究，旨在揭示更多耐药机制及其相关突变位点，从而提升耐药表型与基因型之间的一致性，以便为本地区临床根除Hp提供更加准确、高效的方法。

综上所述，闽南地区Hp感染患者对克拉霉素及喹诺酮类的耐药基因突变率较高，而对阿莫西林、四环素及呋喃唑酮的耐药基因突变率则较低，耐药基因突变是导致抗菌药物耐药的主要因素。

参考文献

[1] 崔玉峰， 林毅军， 王志民.幽门螺杆菌分子检测技术研究进展［J/CD］. 中华实验和临床感染病杂志（电子版）， 2024， 18（5）：257-262.

[2] 朱进华， 冯祥， 华召来， 等.胃癌高发地区40~69岁人群幽门螺旋杆菌感染与胃部疾病关联分析［J］. 中华肿瘤防治杂志， 2023， 30（13）：765-772.

[3] Thrift AP， Wenker TN， El⁃Serag HB. Global burden of gastric cancer： epidemiological trends， risk factors， screening and prevention［J］. Nat Rev Clin Oncol， 2023， 20（5）： 338-349.

[4] 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所.中国幽门螺杆菌感染防控白皮书［EB/OL］.（2023-06-03）［2025-09-15］.

[5] 中华医学会消化病学分会幽门螺杆菌学组.第六次全国幽门螺杆菌感染处理共识报告（非根除治疗部分）［J］. 胃肠病学， 2022， 27（5）：289-304．

[6] Malfertheiner P， Megraud F， Rokkas T， et al. Management of Helicobacter pylori infection： the Maastricht VI/Florence consensus report［J］. Gut， 2022，71（9）：1724-1762.

[7] 高凯悦， 李海文.幽门螺旋杆菌与胃癌间关系的研究进展［J］. 胃肠病学和肝病学杂志，2025，35（4）：582-585.

[8] 中华医学会消化病学分会幽门螺杆菌学组.2022中国幽门螺杆菌感染治疗指南［J］. 中华消化杂志， 2022， 42（11）：745-756.

[9] 国家消化系统疾病临床医学研究中心（上海），国家消化道早癌防治中心联盟，中华医学会消化病学分会幽门螺杆菌学组， 等.中国幽门螺杆菌根除与胃癌防控的专家共识意见（2019年， 上海）［J］. 中华消化杂志， 2019， 39（5）：310-316.

[10] 马欣， 胡崇晖， 赵秀英.幽门螺杆菌耐药性的分子检测方法及进展［J］. 中华检验医学杂志， 2025， 48（3）： 419-424.

[11] Rahbarnia L， Farajnia S， Naghili B， et al. Comparative evaluation of nested polymerase chain reaction for rapid diagnosis of human brucellosis［J］. Arch Razi Inst， 2021， 76（2）：203-211．

[12] Tshibangu⁃Kabamba E， Yamaoka Y. Helicobacter pylori infection and antibiotic resistance： from biology to clinical implications［J］. Nat Rev Gastroenterol Hepatol， 2021，18（9）：613-629.

[13] 吴文冰， 方超英， 陈雯， 等 ．应用限制性片段长度多态性检测幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药性［J］. 山西医科大学学报， 2019， 50（8）： 1161-1164.

[14] Fernández⁃Caso B， Miqueleiz A， Alarcón T.Whole genome sequencing for studying Helicobacter pylori antimicrobial resistance［J］.Antibiotics（Basel）， 2023，12（7）：1135.

[15] Lok CH， Zhu D， Wang J， et al. Phenotype and molecular detection of clarithromycin and levofloxacin resistance in Helicobacter pylori clinical isolates in Beijing［J］. Infect Drug Resist， 2020，13：2145-2153.

[16] Kuo CJ， Ke JN， Kuo T， et al. Multiple amino acid substitutions in penicillin⁃binding protein⁃1A confer amoxicillin resistance in refractory Helicobacter pylori infection［J］. Microbiol Immunol Infect，2023，56（1）：40-47.

[17] Seriki AT， Smith SI， Adeleye AI， et al. Molecular analysis of low⁃level tetracycline resistance in clinical isolates of Helicobacter pylori among dyspeptic patients in South West Nigeria［J］.Glob Antimicrob Resist，2018，13：143-145.

[18] Han YY， Li JY， Guan JL， et al ．Application of furazolidone in Helicobacter pylori infection eradication［J］. J Dig Dis，2024，25（3）：148-155.

[19] Zhong Z， Zhang Z， Wang J， et al ．A retrospective study of the antibiotic⁃resistant phenotypes and genotypes of Helicobacter pylori strains in China［J］. Am J Cancer Res， 2021，11（10）：5027-5037.

[20] Hu SJ， Zhou Y， Deng YH， et al ．Characteristics of phenotypic antibiotic resistance of Helicobacter pylori and its correlation with genotypic antibiotic resistance：a retrospective study in Ningxia［J］. Helicobacter，2023，28（3）：e12960.

[21] 姜冠军， 徐建光， 孙逊.慢性胃炎活检组织幽门螺杆菌感染菌株耐药性及相关耐药基因与毒力基因［J］.中华医院感染学杂志， 2024， 34（15）：2302-2306.

[22] 吴以龙， 谢晶晶， 黄丽静， 等.闽浙边界地区上消化道症状者幽门螺杆菌耐药性及相关基因突变研究［J］.国际消化病杂志， 2023， 43（2）：114-120.

基金资助

福建省自然科学基金资助项目(2023J011843)

漳州市自然科学基金资助项目(ZZ2021J02)