生物信息学分析丁酸盐调控肝细胞癌细胞周期的作用机制

Mechanism of butyrate regulating cell cycle of hepatocellular carcinoma cells based on bioinformatics

摘要

目的 基于生物信息学分析丁酸盐与肝细胞癌（HCC）细胞周期调控基因的潜在关联，探讨丁酸盐抗HCC的机制。 方法 采用CCK-8法检测丁酸盐对HCC细胞增殖的抑制效果，明确其体外抗癌活性。基于UCSC Xena数据库筛选HCC组织与正常肝组织间的差异表达基因（DEGs），进一步通过生存分析、WGCNA分析鉴定出与HCC组织表型显著正相关的关键基因集；利用CTD数据库检索与丁酸盐存在相互作用的基因，并与HCC组织表型显著正相关的关键基因集进行交集分析，筛选出潜在的重叠基因；利用TCGA数据库和THPA网站分析HCC组织和癌旁组织中BIRC5、CDC20、KIF20A和CDK1蛋白的表达差异；利用ONCOLNC数据库分析BIRC5、CDC20、KIF20A和CDK1蛋白与HCC患者生存期的关联；利用STRING数据库结果分析BIRC5、CDC20、KIF20A和CDK1蛋白之间的相互作用。　结果　CCK-8法结果显示，丁酸盐对HCC细胞生长具有剂量依赖性抑制作用（P<0.05）。生物信息学分析表明，与癌旁组织相比，HCC组织中存在1 604个上调基因和2 049个下调基因（P<0.05）；WGCNA分析表明，青色模块基因与HCC组织表型呈正相关（P<0.05）。韦恩图交集分析显示，青色模块特征基因与CTD数据库中注释的丁酸盐相关基因存在交集，最终筛选获得4个核心基因：BIRC5、CDC20、KIF20A及CDK1；TCGA数据库和THPA网站结果显示，BIRC5、CDC20、KIF20A和CDK1蛋白在HCC组织中高表达（P<0.05）。与上述基因低表达的患者相比，高表达的HCC患者生存期短（P<0.05）。STRING数据库结果显示，BIRC5、CDC20、KIF20A和CDK1蛋白存在相互作用。　结论　丁酸盐可能通过调控BIRC5、CDC20、KIF20A、CDK1基因网络干扰HCC细胞周期、抑制癌细胞增殖，为丁酸盐用于HCC临床治疗提供了潜在分子靶点。

Abstract

Objective To investigate the potential association between butyrate and cell cycle regulatory genes of hepatocellular carcinoma（HCC） based on bioinformatics， and explore the effect and mechanism of butyrate against HCC. Methods CCK-8 assay was used to detect the inhibitory effect of butyrate on the proliferation of HCC cells and verify its in vitro anti-tumor activity. Differentially expressed genes（DEGs） between HCC tissues and normal liver tissues were screened based on the UCSC Xena database. Key gene sets significantly positively correlated with HCC phenotypic traits were further identified by survival analysis and weighted gene co-expression network analysis（WGCNA）. Genes interacting with butyrate were retrieved from CTD database， and intersected with the key gene sets positively correlated with HCC phenotypes to screen potential overlapping genes. The expression differences of BIRC5， CDC20， KIF20A and CDK1 proteins between HCC tissues and adjacent non-cancerous tissues were analyzed using TCGA database and THPA website. The correlations of the above four proteins with the survival time of HCC patients were analyzed via the ONCOLNC database. The protein interaction relationships among BIRC5， CDC20， KIF20A and CDK1 were analyzed based on the STRING database. Results CCK-8 assay results showed that butyrate inhibited the growth of HCC cells in a dose-dependent manner（P<0.05）. Bioinformatics analysis identified 1 604 up-regulated genes and 2 049 down-regulated genes in HCC tissues compared with adjacent non-cancerous tissues（P<0.05）. WGCNA revealed that genes in the turquoise module were significantly positively correlated with HCC tissue phenotypes（P<0.05）. Venn intersection analysis showed an overlap between turquoise module signature genes and butyrate-related genes annotated in the CTD database， and four core genes were finally screened out： BIRC5， CDC20， KIF20A and CDK1. The results from TCGA database and THPA website confirmed that BIRC5， CDC20， KIF20A and CDK1 were highly expressed in HCC tissues（P<0.05）. HCC patients with high expression of these genes exhibited shorter survival time than those with low expression（P<0.05）. STRING database analysis indicated that BIRC5， CDC20， KIF20A and CDK1 proteins interacted with each other. Conclusion Butyrate can impede HCC cell cycle progression and inhibit cancer cell proliferation by regulating the BIRC5，CDC20，KIF20A，CDK1 gene network， which provides potential molecular targets for the clinical application of butyrate in treatment of HCC.

Graphical abstract

关键词

丁酸盐 / HCC / 细胞周期 / 生物信息学 / CTD数据库

Key words

butyrate / hepatocellular carcinoma / cell cycle / bioinformatics / Comparative Toxicogenomics Database

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球发病率和死亡率居高不下的恶性肿瘤之一，其发病周期长、分子机制复杂且预后极差，严重威胁人类健康^［1］。短链脂肪酸（SCFAs）作为肠道微生物重要的代谢产物，通过多途径参与HCC发生发展的调控^［2］，其中，丁酸盐的抗癌效应已在结直肠癌、肝癌等肿瘤中得到证实，主要通过表观遗传重塑、免疫微环境调控、细胞增殖抑制等机制发挥作用^［3-6］，但丁酸盐调控HCC细胞周期的具体机制尚未明确。研究表明，细胞周期失控导致HCC细胞无限增殖、凋亡抵抗，是HCC发生和转移的关键环节^［7，8］。在HCC中，多种癌基因和抑癌基因的异常表达导致细胞周期检查点功能丧失，进而引起细胞异常增殖、凋亡受阻、侵袭能力增强，并最终导致肿瘤的发生、发展和转移^［9］。因此，靶向细胞周期已成为HCC治疗的重要策略之一。由此可见，揭示丁酸盐对HCC细胞周期的调控作用及通路机制，是阐明其抗肝癌效应的关键切入点，故提出假设：丁酸盐可通过调控细胞周期相关信号通路，阻滞HCC细胞周期运转，最终抑制肝癌恶性进展。

生物信息学分析作为肿瘤分子机制研究的重要技术手段，具备高效挖掘多组学数据、系统解析基因调控网络、精准筛选核心靶点与关键信号通路的核心优势，能够为深入阐明抗肿瘤分子机制、挖掘潜在治疗靶点提供可靠的数据支撑与研究思路^［10］。故本研究基于上述研究基础，依托生物信息学分析策略，深入探究丁酸盐调控HCC进展的分子机制，以便为肿瘤靶向治疗提供有效策略。

1 材料与方法

1.1 细胞株与试剂

HCC细胞系Hep3B和HUH-7购自ATCC细胞库；丁酸钠（sodium butyrate，NaBu，货号B5887，上海黑崎生物科技有限公司，纯度≥98%，规格：250 mg）；CCK-8细胞增殖与毒性检测试剂盒（货号：HB-CCK-8-500T，汉恒生物科技有限公司，规格：500 tests）。

1.2 采用CCK-8法检测细胞增殖能力

Hep3B及Huh-7细胞采用含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗的DMEM高糖培养基进行培养，37 ℃、5% CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中培养。待细胞融合度达到80%~90%时，用0.25%胰蛋白酶- EDTA消化液进行消化传代，取对数生长期细胞用于后续CCK-8实验。

选取对数生长期的Hep3B及Huh-7细胞，用完全培养基重悬并调整细胞浓度，以每孔5×10³个细胞、终体积100 μL接种于96孔板，每组设置3个复孔；空白对照组加入等量不含细胞的完全培养基。将96孔板置于37 ℃、5% CO₂恒温培养箱中培养24 h，待细胞贴壁后，实验组分别加入终浓度为2.5，5，7.5，10，12.5，15，17.5 mmol/L的丁酸钠（NaBu），对照组加入等量完全培养基，继续培养24 h。培养结束后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，轻轻振荡96孔板使试剂与培养基充分混匀，避光孵育1~2 h。采用酶标仪在450 nm波长处测定各孔吸光度（OD值），按公式计算细胞相对增殖率：相对增殖率（%）=（OD_实验组- OD_空白组）/（OD_对照组-OD_空白组）×100%。所有实验独立重复3次，实验数据以均数±标准差（X±S）表示。

1.3 生物信息学分析

利用TCGA数据库（https：//portal.gdc.cancer.gov/）分析HCC与癌旁组织蛋白差异表达；利用ONCOLNC数据库（http：//www.oncolnc.org/）分析HCC患者中BIRC5、CDC20、KIF20A和CDK1蛋白表达与生存期的关联；利用STRING数据库（https：//string-db.org/）分析BIRC5、CDC20、KIF20A和CDK1蛋白之间的相互作用；利用THPA网站（https：//www.proteinatlas.org/）分析BIRC5、CDC20、KIF20A和CDK1基因在正常肝组织与HCC组织中的蛋白表达水平。

1.4 数据处理和统计学检验

采用GraphPad Prism8进行统计分析，计量数据以均数±标准差（X±S）表示，多组间整体比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），当组间差异有统计学意义时，进一步采用Tukey HSD检验进行任意两组间的比较。P<0.05被认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 丁酸盐对HCC细胞生长的剂量依赖性抑制作用

CCK-8结果显示，丁酸盐对2种HCC细胞系（Hep3B和Huh-7）生长具有剂量依赖性抑制作用，差异有统计学意义（P<0.05，见图1）。

2.2 HCC差异表达基因筛选

本研究纳入TCGA-HCC队列中379例具有完整生存随访信息的HCC患者，根据随访结局分为生存组（n=247）与死亡组（n=132），两组患者在病理分期方面存在显著统计学差异（P=7.70×10⁻⁵，FDR=2.30×10⁻⁴，见表1）。接下来，使用LIMMA方法对肝癌组织与正常组织的基因表达水平进行差异分析，设置阈值为2倍差异和P<0.01，结果显示，分别有1 604个显著上调和2 049个显著下调的差异表达基因（见图2）。

2.3 基于WGCNA分析的青色模块基因与HCC肿瘤进展的关联结果

本研究中利用3 653个差异基因的表达谱进行WGCNA分析，首先进行聚类分析，查看临床特征与各个样本的关系，最终获得了11个共表达模块（见图3A、3C）。青色模块的基因与HCC组织表型显著正相关（见图3D）。这些结果表明，青色模块基因可能有助于HCC的肿瘤进展。

对青色模块进行核心基因筛选分析。分别计算模块内基因的模块成员相关性（MM），即基因表达与模块特征向量的相关性；以及基因显著性（GS），即基因表达与临床特征（癌/癌旁特征向量）的相关性。结果显示，青色模块中MM和GS分数呈显著正相关。同时，以筛选标准|MM|>0.8且|GS|>0.2，从该临床显著模块中最终鉴定出33个高连接度核心基因（见图3B）。

2.4 基于生物信息学分析丁酸盐响应基因在HCC中的表达特征

利用CTD数据库进行基因筛选，寻找与丁酸盐相互作用的基因，并与之前筛选出的33个与HCC组织表型相关的核心基因进行比较。通过韦恩图分析可明确丁酸盐与前期筛选获得的HCC组织表型相关基因的交集，最终从中定位获得4个关键基因：BIRC5、CDC20、KIF20A、CDK1（见图4）。

2.5 丁酸盐与HCC相关基因预后关联分析

基于TCGA数据库和THPA网站分别对HCC相关mRNA基因和蛋白水平进行分析，结果显示，BIRC5、CDC20、KIF20A和CDK1基因在HCC组织中呈高表达（见图5）。此外，进一步的生存分析显示，高表达上述基因的HCC患者预后较差（P<0.05，见图6）。

2.6 BIRC5、CDC20、KIF20A及CDK1蛋白的相互作用

STRING数据库蛋白-蛋白相互作用分析结果显示，BIRC5、CDC20、KIF20A及CDK1蛋白之间存在高度紧密的相互作用网络，所有蛋白两两之间均存在明确的互作关联（见图7），提示四者可形成稳定的功能调控复合体，共同参与肝细胞癌的细胞周期调控和增殖进程。

3 讨论

既往研究证实，丁酸盐作为具备潜在抗癌活性的短链脂肪酸，可通过调控自噬、诱导细胞凋亡，抑制多种肿瘤细胞的增殖与浸润，从而发挥抗肿瘤作用^［3-6］。但其调控HCC发生发展的具体分子机制尚未完全阐明，其关键作用靶点及下游调控通路仍有待进一步挖掘。本研究运用生物信息学方法筛选丁酸盐作用于HCC的核心基因与信号通路，明确丁酸盐可通过调控细胞周期信号通路抑制HCC增殖，初步揭示了其抗HCC的分子作用机制，为深入解析其抗肿瘤作用、挖掘HCC新型治疗靶点提供了新的理论依据与研究方向。

本研究通过数据库挖掘-交集验证策略，精准筛选并锁定BIRC5、CDC20、KIF20A、CDK1为丁酸盐介导抗肝癌效应、调控HCC预后的核心靶基因。TCGA数据库分析证实，这4种基因在肝癌组织中表达显著，其高表达与患者不良预后密切相关，提示均为HCC关键促癌基因，具备临床靶向干预价值。研究表明，BIRC5、CDC20、KIF20A、CDK1基因共同富集于细胞周期信号通路，是介导HCC恶性增殖的核心驱动基因^［11-14］。从分子功能层面分析，CDK1为调控细胞G2/M期转换的核心激酶^［11］；CDC20可激活后期促进复合物，与CDK1协同调控G2/M期细胞周期进程^［12］；BIRC5兼具凋亡抑制与细胞周期调控双重作用，促进肿瘤细胞异常增殖^［13］；KIF20A主要参与有丝分裂纺锤体组装与胞质分裂，维持肿瘤细胞分裂稳态^［14］。综上，4种基因功能相互协同，且存在潜在蛋白相互作用，可共同紊乱肝癌细胞正常周期进程、增强细胞凋亡抵抗，进而推动HCC恶性进展。

综上，丁酸盐可能通过干预CDK1/CDC20驱动G2/M期异常进展—BIRC5抑制凋亡—KIF20A维持有丝分裂稳定性这一关键调控轴，打破HCC细胞周期的有序进程，进而发挥抑制HCC进展的作用，为深入阐释丁酸盐抗HCC的细胞周期调控机制提供了全新的研究方向。但本研究存在一定局限性：一是仅为生物信息学分析，未通过细胞及动物实验验证丁酸盐与上述核心基因的调控关系及具体分子机制，结论尚需实验佐证；二是仅聚焦细胞周期通路，对丁酸盐抗肿瘤的其他潜在机制尚未全面探讨。未来可进一步开展体内外实验，验证丁酸盐对4个核心基因表达及HCC细胞恶性生物学行为的调控作用，并深入解析其调控该细胞周期轴的分子机制，为丁酸盐应用于HCC治疗提供更充分的实验依据。

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基金资助

海军军医大学第一附属医院基础医学研究专项(2023QD09)