Spectrin βⅡ通过改善线粒体功能减轻压力超负荷诱导的心力衰竭

Spectrin βⅡ attenuates pressure overload‑induced heart failure by improving mitochondrial function

摘要

目的 探讨血影蛋白βⅡ（Spectrin βⅡ）在压力超负荷诱导心力衰竭中的表达变化、功能作用及潜在分子机制。　方法通过主动脉缩窄术（TAC）构建小鼠压力超负荷心力衰竭模型，术后6周通过Western blot和RT-qPCR检测心肌组织Spectrin βⅡ的蛋白和mRNA表达水平；利用苯肾上腺素（PE）诱导新生小鼠原代心肌细胞肥大模型，刺激48 h后检测心肌细胞中Spectrin βⅡ的蛋白和mRNA表达水平。C57BL/6J小鼠随机分为4组：假手术+空载对照病毒组（sham+Ad-control）、假手术+过表达Spectrin βⅡ组（sham+Ad-βⅡSP）、TAC+空载对照病毒组（TAC+Ad-control）和TAC+过表达Spectrin βⅡ组（TAC+Ad-βⅡSP）。造模前7 d经心肌点注射腺病毒，随后构建TAC模型，术后第6周，超声心动图评估心脏收缩功能，麦胚凝集素（WGA）染色和Masson染色评估小鼠心脏结构变化，RT-qPCR检测心肌肥大标志物［心房利钠肽（ANP）、B型利钠肽（BNP）］和心肌纤维化标志物［Ⅰ型胶原蛋白（COL Ⅰ）、Ⅲ型胶原蛋白（COL Ⅲ）］的mRNA表达水平。将心肌细胞分为4组：PBS+Ad-control组、PBS+Ad-βⅡSP组、PE+Ad-control组和PE+Ad-βⅡSP组。CCK-8法检测细胞活力，ATP检测试剂盒检测细胞ATP含量，利用JC-1染色和MitoSOX染色评估线粒体膜电位和线粒体活性氧（ROS）水平，Western blot检测线粒体动力学相关蛋白［视神经萎缩蛋白1（OPA1）、线粒体融合蛋白1（Mfn1）、线粒体融合蛋白2（Mfn2）及动力相关蛋白1（DRP1）］的蛋白表达水平。 结果 TAC术后6周小鼠心肌组织中Spectrin βⅡ的蛋白和mRNA表达水平降低（均P<0.01）；PE诱导48 h后肥大心肌细胞Spectrin βⅡ的蛋白和mRNA表达也降低（均P<0.01）。与sham+Ad-control组相比，TAC+Ad-control组小鼠心脏收缩功能降低，心肌病理性肥大和心肌纤维化程度加重，心肌肥厚和纤维化标志物mRNA水平升高（均P<0.01）；而sham+Ad-control和sham+Ad-βⅡSP组上述指标无明显差异。与TAC+Ad-control组相比，TAC+Ad-βⅡSP组心脏收缩功能明显改善，心肌病理性肥大和心肌纤维化程度减轻，心肌肥厚和纤维化标志物mRNA水平明显降低（均P<0.01）。与PBS+Ad-control组相比，PE+Ad-control组心肌细胞活力、ATP含量及线粒体膜电位降低，线粒体ROS含量升高，线粒体动力学相关蛋白OPA1、MFN1、MFN2的蛋白表达降低，而DRP1表达升高（均P<0.01）；PBS+Ad-control组与PBS+Ad-βⅡSP组上述指标无明显差异。与PE+Ad-control组相比，PE+Ad-βⅡSP组心肌细胞活力、ATP含量及线粒体膜电位改善，线粒体ROS含量降低，线粒体动力学相关蛋白OPA1、MFN1、MFN2的蛋白表达升高，而DRP1表达降低（均P<0.01）。 结论 心脏压力超负荷可显著下调心肌Spectrin βⅡ的表达；过表达Spectrin βⅡ通过改善线粒体动力学平衡、减轻氧化应激、增强能量代谢，抑制压力超负荷诱导的病理性心肌重塑并改善心脏收缩功能，从而延缓心力衰竭进程。

Abstract

Objective To investigate the expression changes， function and potential molecular mechanism of Spectrin βⅡ in pressure overload-induced heart failure. Methods A mouse model of pressure overload-induced heart failure was established by transverse aortic constriction（TAC）， and the protein and mRNA expression levels of Spectrin βⅡ in myocardial tissue were detected 6 weeks after TAC surgery by Western blot and RT-qPCR， respectively. A cardiomyocyte hypertrophy model was induced by phenylephrine（PE） in neonatal mouse primary cardiomyocytes， and the protein and mRNA expression levels of Spectrin βⅡ in cardiomyocytes were also examined at 48 h after PE stimulation. C57BL/6J mice were randomly divided into four groups： sham operation+empty vector adenovirus group（sham+Ad-control）， sham operation+Spectrin βⅡ overexpression group（sham+Ad-βⅡSP）， TAC+empty vector adenovirus group（TAC+Ad-control） and TAC+Spectrin βⅡ overexpression group（TAC+Ad-βⅡSP）. Adenovirus was injected into myocardium at 7 d before modeling， and then TAC model was constructed. At 6 week after TAC， cardiac systolic function was evaluated by echocardiography， cardiac structural changes were evaluated by wheat germ agglutinin（WGA） staining and Masson staining， and the mRNA expressions of myocardial hypertrophy markers［atrial natriuretic peptide（ANP）， B-type natriuretic peptide（BNP）］， and myocardial fibrosis markers［type Ⅰ collagen（COL Ⅰ）， type Ⅲ collagen（COL Ⅲ）］ were detected by RT-qPCR. Cardiomyocytes were divided into four groups： PBS+Ad-control group， PBS+Ad-βⅡSP group， PE+Ad-control group and PE+Ad-βⅡSP group. Cell viability was detected by CCK-8 assay， intracellular ATP content was detected by a ATP detection kit， mitochondrial membrane potential and mitochondrial reactive oxygen species（ROS） levels were evaluated by JC-1 staining and MitoSOX staining， and the protein expressions of mitochondrial dynamics-related proteins ［optic atrophy 1（OPA1）， mitofusin 1（Mfn1）， Mfn2 and dynamin-related protein 1（DRP1）］ were detected by Western blot. Results Both protein and mRNA expression levels of Spectrin βⅡ were significantly decreased in myocardial tissues after TAC and PE-induced hypertrophic cardiomyocytes（all P<0.01）. Compared with sham+Ad-control group， the mice in TAC+Ad-control group exhibited impaired cardiac systolic function， aggravated pathological myocardial hypertrophy and fibrosis， and elevated mRNA levels of hypertrophy and fibrosis markers（all P<0.01）； while there were no significant differences in the above indexes between sham+Ad-control group and sham+Ad-βⅡSP group. Compared with TAC+Ad-control group， the cardiac systolic function was significantly improved in TAC+Ad-βⅡSP group， pathological hypertrophy and fibrosis were attenuated， and mRNA levels of hypertrophic and fibrotic markers decreased（all P<0.01）. Compared with PBS+Ad-control group， cardiomyocyte viability， ATP content and mitochondrial membrane potential were decreased， mitochondrial ROS content was increased， the protein expressions of OPA1， Mfn1 and Mfn2 were decreased， and DRP1 expression was increased in PE+Ad-control group（all P<0.01）； there were no significant differences in the above indexes between PBS+Ad-control group and PBS+Ad-βⅡSP group. Compared with PE+Ad-control group， cardiomyocyte viability， ATP content and mitochondrial membrane potential were improved， mitochondrial ROS content was decreased， the protein expressions of OPA1， Mfn1 and Mfn2 were increased， and DRP1 expression was decreased in PE+Ad-βⅡSP group（all P<0.01）. Conclusion Cardiac pressure overload can significantly down-regulate myocardial Spectrin βⅡ expression. Overexpression of Spectrin βⅡ can attenuate pressure overload-induced pathological cardiac remodeling and improve cardiac systolic function by improving mitochondrial dynamics balance， reducing oxidative stress and enhancing energy metabolism， thereby delaying the progression of heart failure.

Graphical abstract

关键词

血影蛋白βⅡ / 心力衰竭 / 压力超负荷 / 线粒体功能 / 心肌肥厚

Key words

Spectrin βⅡ / heart failure / pressure overload / mitochondrial function / myocardial hypertrophy

心力衰竭是多种心血管疾病进展的终末阶段，具有高发病率、高病死率、高致残率的特点^［1］。我国心力衰竭患者出院后1年及3年全因死亡率分别高达13.7%和28.2%，已成为我国重要的公共卫生负担^［2］。心肌肥厚和心肌纤维化是心力衰竭的核心病理改变^［3］。在压力超负荷及心肌缺血等病理刺激下，心肌细胞发生病理性肥大、间质胶原异常沉积，导致心脏收缩与舒张功能障碍，最终进展为心力衰竭^［4，5］。目前心力衰竭治疗手段有限，多以缓解症状为主，缺乏靶向逆转心肌重塑的有效策略^［6］。因此，深入探索病理性心肌重塑的分子机制并寻找新的干预靶点，对心力衰竭防治具有重要科学价值和临床意义。

线粒体不仅提供心肌细胞90%以上的三磷酸腺苷（ATP），还参与维持细胞内钙稳态、生成活性氧（ROS）及调控细胞凋亡等关键生理与病理过程^［7］。在压力超负荷等病理刺激下，线粒体功能发生严重紊乱，表现为动力学失衡（融合/分裂异常）、ATP合成减少、膜电位降低以及ROS过量产生^［8，9］。这些功能障碍导致心肌细胞能量代谢异常与氧化应激，进而诱发心肌细胞肥大，并促进心肌纤维化，最终加速心力衰竭的进展^［10］。因此，靶向改善线粒体功能、维持线粒体稳态，已成为心力衰竭防治的新策略。

血影蛋白βⅡ（Spectrin βⅡ），由SPTBN1基因编码，是一种广泛表达的细胞骨架蛋白，作为非红细胞血影蛋白的主要亚型，参与细胞骨架构建、膜蛋白定位及信号转导等多种生物学过程^［11-13］。近年来研究发现，Spectrin βⅡ在心脏组织中高表达，参与心脏发育、心律失常调控及缺血性心肌损伤修复等过程^［14-16］。本课题组前期研究发现Spectrin βⅡ是维持心肌线粒体结构与功能的关键骨架元件，可调控线粒体复合体Ⅰ活性，减轻缺血再灌注损伤^［17］。然而，Spectrin βⅡ在非缺血性心脏病，尤其是压力超负荷所致的心力衰竭中的作用及调控机制尚不清楚。

因此，本研究提出假说：Spectrin βⅡ可能通过维持线粒体稳态从而延缓心力衰竭的进展。为验证这一假说，本研究利用主动脉缩窄术构建小鼠压力超负荷心力衰竭在体模型，结合体内外功能实验系统评估Spectrin βⅡ的表达变化，并通过腺病毒实现其过表达，明确其对心功能、心肌纤维化及线粒体功能的影响，为心力衰竭的防治提供新的理论依据和潜在干预靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物

成年C57BL/6J小鼠（8~10周）及C57BL/6新生乳鼠（1~3 d）均购自空军军医大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK（陕）2024-003。本实验所涉及实验动物设计和方案均获得空军军医大学动物伦理委员会的批准（伦理批准号：20250190）。动物饲养在SPF级环境中，饲养环境温度控制在24~26 ℃，相对湿度40%~60%，12 h/12 h的明暗循环，期间动物均自由进食小鼠饲料和饮水。

1.2 主要试剂和仪器

1.2.1 主要试剂

过表达Spectrin βⅡ的腺病毒（Ad-βⅡSP）、空载对照腺病毒（Ad-control）均购自上海吉凯基因生物技术有限公司。PBS溶液、青链霉素混合液和DMEM培养基均购自西安米鼠生物科技有限公司。苯肾上腺素（Phenylephrine，PE，货号：S161304）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。胎牛血清（货号：A5256701）及Ⅱ型胶原酶（货号：17101015）均购自美国Gibco公司。ATP检测试剂盒（货号：S0027）、CCK-8检测试剂盒（货号：C0037）及JC-1染色试剂盒（货号：C2003S）均购自碧云天生物技术有限公司。MitoSOX试剂盒（货号：M36008）购自美国Invitrogen公司。抗Spectrin βⅡ（货号：19722-1-AP）、DRP1（货号：12957-1-AP）、OPA1（货号：27733-1-AP）、MFN1（货号：13798-1-AP）、MFN2（货号：12186-1-AP）和HSP90（货号：13171-1-AP）一抗均购自武汉三鹰生物技术有限公司，HRP标记二抗购自西安壮志生物科技有限公司。RT-qPCR检测相关引物由西安擎科有限公司设计并合成。TRIzol™（货号：15596018CN）购自美国Invitrogen公司，PrimeScript™逆转录试剂盒（货号：TCH013）和TB Green^® Premix DimerEraser™（货号：RR091Q）均购自北京宝日医生物技术有限公司。

1.2.2 主要仪器

小动物呼吸机（型号：Matrx VMR3000）购自美国Matrx公司。小鼠心脏超声系统（型号：Vevo 2100）购自飞依诺科技有限公司。凝胶成像系统（型号：ChemiDoc XRS+）和酶标仪（型号：iMark）均购自美国Bio-Rad公司。流式细胞仪（型号：Attune NxT）购自美国Invitrogen公司。荧光定量PCR仪（型号：7500）购自美国Applied Biosystems公司。

1.3 心肌点注射腺病毒

8~10周龄C57BL/6J小鼠经3%异氟烷诱导麻醉后固定，消毒后开胸暴露心脏。使用微量注射器将30 µL腺病毒溶液分别注射至左心室前壁、后壁及侧壁的3个位点，病毒滴度为1×10¹² copies/mL。术后逐层缝合，于术后第7天进行后续相关实验。

1.4 实验动物造模和分组

通过主动脉缩窄术（transverse aortic constriction，TAC）构建小鼠压力超负荷小鼠心力衰竭模型。将小鼠随机分为sham组和TAC组。小鼠经3%异氟烷吸入麻醉后仰卧固定于手术台，沿胸骨正中剪开，显露胸腺并拨开后暴露主动脉弓。使用4-0尼龙线绕过主动脉弓并与27G针头结扎，随后轻柔抽出针头造成缩窄，随即缝合胸骨与皮肤。sham组小鼠没有结扎主动脉弓，其余操作均与TAC组小鼠相同。术后6周行超声心动图评估心功能并取材。

1.5 新生小鼠原代心肌细胞的分离、培养及分组处理

取出生1~3 d新生乳鼠，酒精消毒后开胸取心脏，将心室组织剪碎，置于含1 mg/mL Ⅱ型胶原酶的消化液中，分次消化，加入含10% FBS的DMEM培养基终止消化，经差速贴壁2 h，弃掉贴壁的成纤维细胞，收集悬浮的心肌细胞，将心肌细胞培养48 h后于倒置显微镜下观察到同步搏动，即视为原代心肌细胞提取成功，用于后续实验。

为观察Spectrin βⅡ在PE诱导的心肌细胞肥厚中的表达变化，将细胞分为2组：control组和PE组。PE组培养基加入PE刺激，使其终浓度为50 μmol/L，48 h后收集细胞；control组培养基加入等量PBS，48 h后收集细胞。为观察过表达Spectrin βⅡ对PE诱导的心肌细胞肥厚的影响，将细胞分为4组：PBS+Ad-control组、PBS+Ad-βⅡSP组、PE+Ad-control组和PE+Ad-βⅡSP组。PBS+Ad-control组和PBS+Ad-βⅡSP组心肌细胞分别转染空载对照腺病毒或过表达Spectrin βⅡ腺病毒（MOI=50）后8 h换液，给予PBS处理48 h后收集细胞；PE+Ad-control组及PE+Ad-βⅡSP组心肌细胞分别在相应病毒转染后8 h换液，再给予PE刺激处理48 h后收集细胞。

1.6 超声心动图检测小鼠心功能

提前一天对小鼠胸前区域进行脱毛预处理。将小鼠经3%异氟烷吸入麻醉，仰卧固定于超声工作台上，使用超声探头在短轴切面获取M-mode心动图，并利用Vevo超声图像分析系统测定左心室射血分数（LVEF）、左心室缩短分数（LVFS）、左心室收缩末期内径（LVESD）及左心室舒张末期内径（LVEDD）。

1.7 Western blot检测Spectrin βⅡ、DRP1、OPA1、MFN1和MFN2的蛋白表达

组织或细胞经预冷RIPA裂解液冰上裂解30 min，4 ℃ 12 000g高速离心15 min，取裂解上清经过BCA法定量蛋白。取等量蛋白样品经95 ℃变性10 min后，进行SDS-PAGE电泳分离并湿法转至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，加一抗（HSP90、Spectrin βⅡ、DRP1、OPA1、MFN1和MFN2，均1∶1 000稀释）4 ℃孵育过夜。PBST洗膜后孵育HRP标记二抗（1∶5 000稀释）1 h，ECL化学发光显影，以HSP90为内参。

1.8 RT-qPCR检测Spectrin βⅡ、ANP、BNP、COLⅠ和COL Ⅲ的mRNA表达水平

采用TRIzol提取心脏组织或细胞的总RNA，取1 μg RNA，经清除基因组DNA处理后逆转录得到cDNA。通过TB Green^® Premix DimerEraser™在荧光定量PCR仪上进行扩增，以β-actin为内参进行相对定量分析。引物序列见表1。

1.9 CCK-8检测心肌细胞活力

经PE处理后，用含10% CCK-8溶液的新鲜培养基继续孵育原代心肌细胞2 h，酶标仪450 nm处检测吸光度，计算细胞活力，细胞活力（%）=［（实验组OD值-空白孔OD值）/（对照组OD值-空白孔OD值）］×100%，实验独立重复3次。

1.10 JC-1染色和MitoSOX染色分别检测线粒体膜电位与线粒体ROS含量

收集处理后的心肌细胞，经胰酶消化并离心后，分别重悬于JC-1和MitoSOX染色工作液中，严格避光条件下孵育20 min（JC-1）或10 min（MitoSOX），期间间断吹打以防细胞聚集。孵育结束后，用PBS洗涤细胞3次，重悬为单细胞悬液后分别上机，采用流式细胞仪对应通道检测荧光强度。

1.11 ATP检测试剂盒法测定细胞ATP含量

将处理后的心肌细胞用预冷PBS洗涤后，加入裂解液于冰上裂解10 min，4 ℃ 12 000g离心5 min后取上清；按照碧云天ATP检测试剂盒说明书，将上清与ATP检测工作液等体积混合，室温避光反应5 min，使用化学发光仪检测发光值。通过BCA法测定各样品的蛋白浓度，以蛋白浓度进行归一化处理，并将各组数据相对于PBS+Ad-control组（100%）进行标准化，以百分比形式表示为相对ATP含量。

1.12 WGA染色和Masson染色检测小鼠心脏组织结构变化

小鼠心脏组织经4%多聚甲醛固定、石蜡包埋后，于最大横切面切取5 μm切片，脱蜡至水。WGA染色经封闭后滴加6 μg/mL WGA工作液室温避光孵育30 min，DAPI复染后荧光显微镜观察，ImageJ定量心肌细胞横截面积以评估心肌肥大程度。Masson染色经天青石蓝、苏木素、磷钼酸及苯胺蓝依次染色，光学显微镜下观察，ImageJ定量胶原纤维面积以评估心肌纤维化程度。

1.13 统计学分析

使用GraphPad Prism 8.0进行统计学分析。计量数据以均数±标准差（X±S）表示，两组间数据分析用两独立样本t检验，多组数据的统计分析先应用单因素方差分析，再采用Tukey检验进行多重比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Spectrin βⅡ在压力超负荷诱导小鼠心肌组织中低表达

Western blot和RT-qPCR结果显示，与sham组相比，TAC组小鼠在TAC术后6周心肌组织中Spectrin βⅡ蛋白及mRNA水平均显著降低（均P<0.01，见图1）。

2.2 Spectrin βⅡ在PE诱导的心肌细胞肥大中的表达

Western blot和RT-qPCR结果显示，与PBS组相比，PE组心肌细胞在PE刺激48 h后Spectrin βⅡ蛋白及mRNA水平均显著降低（均P<0.01，见图2）。

2.3 Spectrin βⅡ过表达对TAC诱导的心脏收缩功能障碍的影响

Western blot和RT-qPCR结果显示，心肌点注射Spectrin βⅡ过表达的腺病毒后，Spectrin βⅡ蛋白表达及mRNA水平显著提高（P<0.01，见图3），表明在体过表达Spectrin βⅡ体系构建成功。TAC术后6周行超声心动图检查，结果显示，sham+Ad-control组和sham+Ad-βⅡSP组小鼠心脏收缩功能无明显差异，主要表现为LVEF、LVFS、LVESD和LVEDD差异无统计学意义（P>0.05）；与sham+Ad-control组相比，TAC+Ad-control组小鼠心脏收缩功能明显降低，主要表现为LVEF和LVFS显著降低（P<0.01），LVESD和LVEDD显著增加（P<0.01）；而与TAC+Ad-control组相比，TAC+Ad-βⅡSP组LVEF和LVFS显著提高，LVESD和LVEDD显著降低（均P<0.01，见图4），提示Spectrin βⅡ过表达可改善TAC诱导的心脏收缩功能障碍。

2.4 过表达心肌Spectrin βⅡ对TAC诱导的心肌肥大和心肌纤维化的影响

sham+Ad-control组与sham+Ad-βⅡSP组之间心肌细胞横截面积、纤维化面积、心肌肥大标志物（ANP和BNP）及心肌纤维化标志物（COLⅠ和COLⅢ）的mRNA水平均无显著差异（P>0.05）。与sham+Ad-control组相比，TAC+Ad-control组小鼠心肌细胞横截面积及纤维化面积明显增加，同时ANP、BNP、COLⅠ、COL Ⅲ的mRNA表达水平显著上调（均P<0.01）；而与TAC+Ad-control组相比，TAC+Ad-βⅡSP组小鼠上述病理改变均明显改善，心肌细胞横截面积和纤维化面积显著减少，相关心脏重塑标志物ANP、BNP、COL Ⅰ、COL Ⅲ的mRNA表达水平显著降低（均P<0.01，见图5）。

2.5 Spectrin βⅡ过表达对心肌细胞活性和ATP含量的影响

Western blot和RT-qPCR结果显示，与Ad-control组比较，Ad-βⅡSP组心肌细胞中Spectrin βⅡ的蛋白和mRNA表达水平显著升高（P<0.01，见图6），提示心肌细胞Spectrin βⅡ过表达模型构建成功。CCK-8实验结果显示，PBS+Ad-control组与PBS+Ad-βⅡSP组心肌细胞活性无明显差异（P>0.05）；与PBS+Ad-control组相比，PE+Ad-control组心肌细胞活性显著降低（P<0.01）；与PE+Ad-control组比较，PE+Ad-βⅡSP组心肌细胞活性显著升高（P<0.01，见图7）。并且相对ATP含量的变化趋势和心肌细胞活性变化趋势一致（P<0.01，见图7）。

2.6 Spectrin βⅡ过表达对PE诱导心肌细胞线粒体膜电位和线粒体ROS的影响

JC-1染色结果显示，PBS+Ad-control组与PBS+Ad-βⅡSP组心肌细胞线粒体膜电位无明显差异（P>0.05）；与PBS+Ad-control组相比，PE+Ad-control组线粒体膜电位显著降低（P<0.01）；而与PE+Ad-control组相比，PE+Ad-βⅡSP组线粒体膜电位显著提高（P<0.01，见图8）。

MitoSOX染色结果显示，PBS+Ad-control组与PBS+Ad-βⅡSP组心肌细胞线粒体ROS含量无明显差异（P>0.05）；与PBS+Ad-control组相比，PE+Ad-control组线粒体ROS含量显著增加（P<0.01）；而与PE+Ad-control组相比，PE+Ad-βⅡSP组线粒体ROS含量显著下降（P<0.01，见图9）。

2.7 Spectrin βⅡ过表达对PE诱导心肌细胞线粒体动力学相关蛋白表达的影响

Western blot结果显示，PBS+Ad-control组与PBS+Ad-βⅡSP组心肌细胞线粒体动力学相关蛋白DRP1、OPA1、MFN1和MFN2表达无明显差异（P>0.05）；与PBS+Ad-control组相比，PE+Ad-control组OPA1、MFN1和MFN2蛋白表达显著降低（P<0.01），DRP1蛋白表达显著升高（P<0.01）；而与PE+Ad-control组相比，PE+Ad-βⅡSP组OPA1、MFN1和MFN2蛋白表达显著升高（P<0.01），DRP1蛋白表达显著降低（P<0.01，见图10）。

3 讨论

心力衰竭是压力超负荷所致心肌病理性重构的终末阶段，心肌肥厚和间质纤维化是其核心病理改变，临床仍缺乏有效的治疗策略^［3，4］。Spectrin βⅡ是心肌高表达的骨架蛋白，课题组前期证实，Spectrin βⅡ在缺血损伤中通过调控线粒体复合体Ⅰ活性发挥保护作用^{［11，17，18］}。但Spectrin βⅡ在压力超负荷所致非缺血性心力衰竭中的表达变化、功能效应及调控机制尚不清楚。本研究系统阐述Spectrin βⅡ在压力超负荷心衰中的作用及线粒体相关调控通路，对寻找新的心肌保护靶点具有重要科学价值。

本研究体内和体外结果一致显示，TAC术后小鼠心肌组织及PE刺激的原代心肌细胞中，Spectrin βⅡ的蛋白和mRNA水平均呈显著下降。前期研究发现，Spectrin βⅡ在缺血再灌注损伤中主要受钙蛋白酶介导的翻译后降解调控，其mRNA水平无明显改变^［17］。而本研究发现，压力超负荷条件下Spectrin βⅡ的蛋白和mRNA同步降低，提示Spectrin βⅡ在不同病理应激下调控模式差异化，而转录抑制是介导Spectrin βⅡ表达下调的重要机制。

病理性心肌肥厚与间质纤维化是压力超负荷心力衰竭的重要病理改变，靶向抑制心肌病理性重塑是延缓心力衰竭进展的关键^［19］。既往研究证实，细胞骨架蛋白参与调控心肌重构进程，其表达异常可直接影响心脏结构与功能稳态^［20］。本研究结果显示，Spectrin βⅡ过表达可显著改善TAC诱导的心脏收缩功能障碍，同时有效抑制TAC诱导的病理性心肌肥大和间质纤维化面积，下调心肌肥厚标志物ANP和BNP及纤维化标志物COLⅠ和COLⅢ的mRNA表达水平。过表达Spectrin βⅡ可显著改善PE诱导的心肌细胞活力和ATP含量的下降。上述结果充分证实，Spectrin βⅡ过表达能显著减轻压力超负荷介导心肌病理性重塑，为心力衰竭抗重塑治疗提供了新的分子靶点。

线粒体动力学失衡、氧化应激增强及ATP耗竭是TAC诱导心肌损伤的核心机制^［21］。课题组前期证实Spectrin βⅡ可直接定位于线粒体，调控线粒体复合体Ⅰ活性^［17］，但其对压力超负荷条件下线粒体动力学的调控作用尚未明确。本研究发现，PE刺激可显著降低线粒体膜电位、增加线粒体ROS水平，同时下调线粒体融合蛋白OPA1、MFN1、MFN2的蛋白表达，上调线粒体分裂蛋白DRP1的蛋白表达；而Spectrin βⅡ过表达可显著逆转上述异常，表现为恢复线粒体膜电位、降低线粒体ROS并恢复线粒体融合-分裂平衡。综上提示Spectrin βⅡ在非缺血性心力衰竭中可通过维持线粒体膜电位、减轻氧化应激、维持线粒体动力学稳态等改善线粒体功能从而发挥心肌保护功能。

本研究也存在一定的局限性：本研究仅采用小鼠TAC模型与体外心肌细胞实验，未在大动物模型及临床心力衰竭样本中验证Spectrin βⅡ的表达及功能，后续将引入大型动物模型，并结合临床样本，进一步验证治疗心力衰竭的临床有效性和安全性；此外，本研究对Spectrin βⅡ上游转录调控因子及下游信号网络的探索尚不深入，后续可以通过转录组、代谢组等技术系统解析其上下游调控通路。

综上所述，本研究系统阐明Spectrin βⅡ在非缺血性心力衰竭中的保护作用：Spectrin βⅡ在TAC诱导的心力衰竭表达降低，而过表达Spectrin βⅡ可通过维持心肌细胞活力、恢复线粒体稳态，显著减轻TAC诱导的心功能障碍和病理性心肌重塑，这为心力衰竭机制研究提供新视角，也为靶向Spectrin βⅡ的治疗策略奠定理论基础。

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基金资助

联勤保障部队第九八九医院院内课题(9892023YNKT-01B)

洛阳市科技计划项目—医疗卫生专项(2401166B)

国家资助博士后研究人员计划项目(GZC20233580)