基于蛋白质组学解析PMA与TCM诱导中性粒细胞胞外捕获网的蛋白组分及分子通路差异

Differences in protein components and molecular pathways of neutrophil extracellular traps induced by PMA and TCM based on proteomics

摘要

目的 基于蛋白质组学技术比较不同诱导条件下中性粒细胞胞外捕获网（NETs）的异同，阐明其共性核心机制与特异性调控通路，为精准靶向肿瘤相关NETs提供实验依据。 方法 分离BALB/c小鼠骨髓中性粒细胞，分别以佛波酯（PMA）、肿瘤培养上清（TCM）诱导NETs形成，采用免疫荧光染色验证NETs生成；通过非靶向定量蛋白质组学检测蛋白表达谱；运用生物信息学分析差异蛋白/共同蛋白的亚细胞定位、GO注释、KEGG通路富集及蛋白互作网络分析。 结果 PMA和TCM均可成功诱导NETs；两组共鉴定出8 966种共同蛋白，富含组蛋白、中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）、髓过氧化物酶（MPO）等经典NETs标志物，定位于细胞质与细胞膜，主导基础代谢、物质转运与结构组装。两组差异蛋白共2 765种，PMA-NETs高表达蛋白聚焦氧化磷酸化、活性氧（ROS）生成、吞噬体通路；而TCM-NETs高表达蛋白富集细胞周期、DNA修复、代谢重塑、补体凝血及肿瘤相关炎症通路。 结论 PMA与TCM诱导的NETs共享保守核心蛋白与基础通路，同时又有明显的诱导条件特异性，二者同中有异；TCM诱导的NETs呈现出更贴近肿瘤微环境的表型倾向。这为区分经典化学诱导型NETs与肿瘤相关NETs的分子特征、开发针对性的靶向策略提供了理论依据。

Abstract

Objective To compare the differences and similarities of neutrophil extracellular traps（NETs） under various induction conditions based on proteomic techniques， and elucidate their core common mechanisms and specific regulatory pathways for providing experimental evidence in the precise targeting of tumor-associated NETs. Methods Bone marrow neutrophils were isolated from BALB/c mice and induced to form NETs using phorbol 12-myristate 13-acetate（PMA） or tumor cell-conditioned medium（TCM）. NETs were verified by immunofluorescence staining. Protein expression profiles were detected using untargeted quantitative proteomics. Bioinformatics analyses were performed to assess the subcellular localization， Gene Ontology（GO） functional enrichment， Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） pathway enrichment and protein-protein interaction network analysis of common proteins and differential proteins. Results Both PMA and TCM successfully induced NETs. A total of 8 966 common proteins were identified in both two groups， including classical NET markers such as histone， neutrophil elastase（NE）， and myeloperoxidase（MPO）. These proteins were primarily localized in the cytoplasm and cell membrane， and involved in basic metabolism， substance transport， and structural assembly. A total of 2 765 differential proteins were identified between the two groups. Proteins up-regulated in PMA-induced NETs were enriched in oxidative phosphorylation， reactive oxygen species production， and phagosome pathways. Proteins up-regulated in TCM-induced NETs were enriched in cell cycle regulation， DNA repair， metabolic reprogramming， complement-coagulation cascades， and tumor-associated inflammatory pathways. Conclusion PMA- and TCM-induced NETs share conserved core proteins and basic pathways while exhibiting significant stimulus-specific features， presenting a "conserved yet distinct" profile. TCM-induced NETs tend to develop an adaptive phenotype tailored to the tumor microenvironment. This study provides a theoretical basis for distinguishing the molecular characteristics of classical chemical-induced NETs from tumor-associated NETs and developing targeted therapeutic strategies.

Graphical abstract

关键词

中性粒细胞胞外捕获网 / 肿瘤上清 / 肿瘤微环境 / 佛波酯 / 蛋白质组学 / NETosis

Key words

neutrophil extracellular traps / tumor cell culture supernatant / tumor microenvironment / phorbol 12-myristate 13-acetate / proteomics / NETosis

中性粒细胞是先天免疫的核心效应细胞，受刺激后释放解聚染色质与颗粒蛋白形成胞外网状结构，即中性粒细胞胞外捕获网（neutrophil extracellular traps， NETs），该过程被称NETosis^［1］。NETs参与炎症与抗感染调控，在肿瘤中发挥重要作用。肿瘤微环境中中性粒细胞浸润增加，NETs异常形成与降解失衡可促进免疫逃逸、侵袭转移及化疗抵抗，使其成为肿瘤诊疗的潜在靶点^［2-4］。

在体外诱导NETs生成的模型中，PMA作为经典的化学诱导剂，诱导效率高、重复性好，但是与体内复杂的病理环境存在差距^［5］。而TCM中包含细胞因子、趋化因子、外泌体及代谢产物等多种复杂成分，用来模拟肿瘤微环境对中性粒细胞的多重刺激，更贴近体内的生理病理状态^［6］。目前，这两种诱导方式生成的NETs在蛋白组分、分子通路及功能表型尚不明确，而这正是连接基础研究与临床转化的关键地方。本研究通过蛋白质组学与生物信息学分析，系统比较PMA-NETs与TCM-NETs的蛋白表达谱，分析共同核心蛋白与差异蛋白、亚细胞定位及功能通路，揭示NETosis的保守性与环境依赖性，为筛选特异性的肿瘤相关NETs标志物、开发精准治疗策略提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞培养

采用小鼠肝癌细胞系Hepa1-6，购于武汉普诺赛生命科技有限公司（货号：CL-0105），培养条件：DMEM+10% FBS+1% P/S，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中。从小鼠骨髓分离的原代中性粒细胞培养于RPIM1640+10% FBS+1% P/S。

1.1.2 实验动物

6~8周龄、SPF级、BALB/c雄鼠，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，所有动物实验过程已获得西安交通大学医学部生物医学伦理委员会批准（伦理编号：XJTUAE2024-1438）。

1.1.3 试剂

小鼠中性粒细胞分选试剂盒EasySep™ Mouse Neutrophil Enrichment Kit（Stemcell-19762）购买于STEMCELL公司。抗体MPO（A1374）购自ABclonal，高糖细胞培养基DMEM（10-013-CVRC）和RPMI1640（10-040-CVRC）购买于Corning公司，血清（A5256701）购自于Gibco公司。

1.2 实验方法

1.2.1 肿瘤上清的收集

生长状态良好的Hepa1-6细胞，培养48 h后收集上清，离心，用于TCM组诱导中性粒细胞产生NETs。

1.2.2 中性粒细胞分离、纯化

小鼠处死，分离股骨和肱骨，减去骨头两端，用1 mL注射器将股骨和胫骨的骨髓细胞冲洗到EasySep™ Buffer中；70 μm筛网过滤，300g离心10 min，得到单细胞悬液。按照中性粒细胞分选试剂盒操作流程进行中性粒细胞纯化：加FCR Blocker，转至新的流式管中；加入Enrichment Cocktail，4 ℃孵育15 min；EasySep™ Buffer加满样品管清洗细胞，300g离心10 min；弃上清，EasySep™ Buffer将细胞重悬；向样品中加入Biotin Selection Cocktail，4 ℃孵育15 min；再加入磁珠，4 ℃孵育10 min；添加EasySep™ Buffer，将试管放入磁铁中并孵育3 min，将富集的细胞悬浮液倒入新的试管，计数。

1.2.3 诱导中性粒细胞形成NETs

分选出的中性粒细胞分为2组，每组3个重复：佛波酯（PMA）诱导组（500 nmol/L PMA+RPIM1640培养基+5%FBS+P/S）和TCM诱导组（TCM+5%FBS+P/S）。4 h后，吸掉上清，加入预冷的PBS反复吹打，转移至离心管。4 ℃，400g离心5 min，取上清至新的离心管，4 ℃，18 000g，离心15 min，得到的白色沉淀用PBS重悬，送公司测序。

1.2.4 免疫荧光检测NETs形成

多聚赖氨酸包被后的盖玻片和12孔板37 ℃过夜，吸去多聚赖氨酸，灭菌水洗3次，超净台风干。分选后的中性粒细胞加至12孔板，分别加PMA和TCM刺激4 h，弃上清，PBS洗一次；4%多聚甲醛固定15 min， PBS洗1次；0.3% Triton-X100通透10 min，PBS洗一次；5% BSA封闭30 min；1∶200的稀释比例孵MPO抗体（ABclonal，货号A1374），4 ℃过夜；PBS洗3次，1∶200的比例稀释荧光二抗（proteintech，货号SA00013-3），室温孵育1 h；PBS清洗，DAPI染色5 min，镜下观察，拍照。

1.2.5 蛋白质组学分析

由上海拜谱生物科技有限公司进行DIA（data independent acquisition）定量蛋白质组学分析。实验流程包括：①样品制备与质检，提取蛋白后BCA法测定蛋白浓度；②酶解肽段，取适量蛋白进行FASP酶解，酶解后进行肽段浓度测定；③DIA质谱数据采集，取适量肽段使用Vanquish Neo UHPLC system， operated Neo UHPLC色谱系统（Thermo Scientific）进行色谱分离，肽段分离后用Orbitrap Astral质谱仪（Thermo Scientific）进行DIA质谱分析，肽段质量误差的阈值设为±10 ppm，搜库的阈值Peptide FDR≤0.01和Protein FDR≤0.01作为筛选标准；④DIA数据分析，所得的原始质谱文件导入DIA-NN软件，使用Q≤0.01为筛选参数，进行DIA质谱数据的数据库检索及蛋白DIA定量分析。所用的数据库为uniprotkb-Mus musculus（Mouse）［10090］- 87434-20240725.fasta（https：//www.uniprot.org/taxonomy/10090）。为保证后续分析的有效性，我们对蛋白质组学原始数据进行严格的质量控制。采用Pearson相关性分析评估组内生物学重复样本表达一致性，验证实验重复性；使用中位数归一化对数据进行标准化校正；确保鉴定的蛋白在对应组别中50%以上无缺失值，并对剩余的缺失值进行数据填充，填充值为归一化后所有有效数据值中最小值的一半。完成质控与数据校正后，再开展后续生物信息学分析，确保所有分析结果真实可靠。

1.2.6 生物信息学分析

差异蛋白的鉴定以|log₂差异倍数（FC）|≥1.5且校正后P<0.05作为筛选标准。采用GO（Gene Onto⁃logy）数据库对相关蛋白进行分类注释，包括生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和细胞组分（cellular component，CC）三方面；根据GO数据库的细胞组分分析，注释和统计蛋白亚细胞定位的情况；采用KEGG数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）对相关蛋白涉及的信号通路进行富集分析。

基于STRING数据库获取差异蛋白的相互作用关系，构建差异蛋白全局互作网络，用Pagerank算法计算各节点的全局重要性评分，筛选前50个节点，构建核心调控网络。采用Cytoscape软件的cose力导向算法对蛋白互作网络完成结果可视化。

2 结果

2.1 PMA与TCM均成功诱导NETs形成

免疫荧光实验结果表明，在PMA与TCM两种诱导条件下，均出现典型的MPO与DAPI共定位的网状结构（见图1），证明PMA与TCM均可诱导NETs的形成。

2.2 NETs的测序数据质控评估

对两组NETs的蛋白进行BCA蛋白浓度定量，结果表明，TCM诱导组的NETs浓度低于PMA诱导组（见表1）。DIA定量蛋白质组学分析结果表明PMA诱导组鉴定得到蛋白共9 757种，TCM诱导组共有9 852种蛋白（见表2）。除此之外，为确保蛋白质组学的数据质量，本研究对样本进行了表达分布和相关性分析。小提琴图显示，所有样本的蛋白表达强度分布一致（见图2A），表明蛋白提取和质谱采集过程可靠。样本相关性分析结果表明，组内生物学重复的相关系数均>0.9，重复性良好，而组间相关性低于组内水平，说明存在生物学差异（见图2B）。综上，蛋白质组学数据质量良好，组内重复性高，组间差异明显，可用于后续差异蛋白筛选及功能富集分析。

2.3 PMA-NETs和TCM-NETs的差异蛋白及通路富集分析

2.3.1 PMA-NETs和TCM-NETs差异蛋白分析

为分析PMA与TCM诱导形成NETs的蛋白谱，我们进行了非靶向蛋白质组学与生物信息学分析。结果显示，选择|log₂FC|≥1.5且校正后P<0.05作为筛选标准，两组显著差异的蛋白有2 765种，而无显著差异的蛋白有7 133种（占总蛋白72.07%）；与PMA-NETs相比，TCM-NETs中上调蛋白1 572种（占总蛋白的15.88%），下调蛋白1 193种（12.05%）（见图3A）；选取总表达量位于前30位差异蛋白绘制雷达图（见图3B）。为了直观展示PMA和TCM诱导形成的NETs在蛋白表达的整体差异，对蛋白进行聚类分析并绘制热图，结果显示，两种诱导条件下形成的NETs有明显的表达差异，可划分为两大功能模块：①TCM-NETs高表达蛋白：热图上半部分的蛋白在TCM组中呈高表达，在PMA组中呈低表达；②PMA-NETs高表达蛋白：热图下半部分的蛋白在PMA组呈高表达，TCM组中呈低表达（见图3C）。为进一步挖掘PMA-NETs和TCM-NETs的差异蛋白的分子基础，根据蛋白的总表达量由高到低选取了前50种蛋白（Top50）进行聚类分析，整合了表达量、差异倍数（log₂FC）和显著性（-log₁₀P）信息，同样分为两大模块：①PMA-NETs高表达的蛋白组，包括NADPH氧化酶亚基（Cybb、Cyba）与髓过氧化物酶（Mpo）等氧化应激相关蛋白，符合经典ROS依赖型NETosis机制；②TCM-NETs高表达的蛋白组，多为代谢与离子/分子稳态相关蛋白（Trap1、H1f3）和抗菌抗炎相关蛋白（Prg2、Ltf、Lcn2、C3等），提示TCM诱导的NETs可能更侧重炎症与免疫防御功能（见图3D）。

2.3.2 PMA-NETs和TCM-NETs差异蛋白亚细胞定位与通路富集分析

首先对PMA-NETs组中高表达的蛋白进行分析。为明确其空间功能分布，通过GO数据库的细胞组分分析对差异蛋白进行了亚细胞定位的注释和统计，结果表明该组蛋白主要位于细胞质（32.68%）与细胞膜（29.37%），细胞器（如内质网、线粒体及高尔基体）为次要富集区域，细胞外区域、溶酶体、过氧化物酶体及中心体、核膜等占比均<5%（见图4A）。GO分析表明，BP中细胞过程、定位、运输显著富集；MF富集表明，结合功能与催化活性为最突出的分子功能，其中包括：蛋白质结合、离子结合、转运活性及水解酶活性等（见图4B）。KEGG通路富集最显著的是代谢通路（如氧化磷酸化、甘油磷脂代谢及整体的代谢通路）；其次是吞噬体、溶酶体、过氧化物酶体、内吞作用，提示胞内降解、ROS清除与过氧化物酶体代谢是维持细胞稳态的关键环节；内质网蛋白加工显著富集，说明蛋白质合成、折叠与分泌是膜蛋白与分泌蛋白功能实现的核心保障；还涉及Rap1、cGMP-PKG等信号通路（见图4C）。上述结果表明，PMA-NETs高表达的蛋白主要通过调控基础代谢、囊泡运输及蛋白加工过程参与细胞功能调控。

接着分析TCM-NETs高表达蛋白的亚细胞定位，结果表明该组蛋白也主要位于细胞质（39%）与细胞膜（22.69%），细胞外区域、线粒体及核仁相关蛋白占比也有显著升高（见图4D）。GO富集分析显示，BP中最显著富集的是细胞过程与代谢过程；MF中最显著富集的是结合功能、催化活性及核苷酸结合相关（见图4E）。KEGG通路富集分析结果显示：细胞周期、p53信号通路、铁死亡和黏着斑显著富集，同时核糖体生物发生、DNA复制与修复、辅因子合成及脂质代谢等通路高度富集（见图4F）。上述结果表明，TCM-NETs高表达蛋白主要参与调控细胞周期、DNA修复与核糖体合成及代谢过程。

2.4 PMA-NETs和TCM-NETs的共同蛋白及通路富集分析

2.4.1　PMA-NETs和TCM-NETs的共同蛋白分析将PMA诱导组和TCM诱导组中测出的所有蛋白取交集，发现共同蛋白有8 966种，均富含经典NETs标志物，包括核心组蛋白（H2A，H2B，H3，H4）、NE、MPO、组织蛋白酶G（CTSG）以及防御素等。

亚细胞定位结果显示，共同表达蛋白主要分布于细胞质（38.89%）和细胞膜（24.35%），此外线粒体、内质网、高尔基体及胞外区域相关蛋白也有较高占比（见图5A）。GO富集分析显示，BP层面显著富集于代谢过程（包括大分子代谢过程和蛋白质代谢）、细胞过程、细胞组织/组分生物发生；MF层面，最显著富集的是结合功能和催化活性（见图5B）。KEGG通路富集分析结果中，代谢通路富集最显著，是所有条目中基因数量最多的（n=1 071）。碳代谢和辅因子生物合成，进一步说明能量代谢和基础物质合成是核心功能之一，这与GO分析中“代谢过程”的结论相互印证（见图5C）。上述结果表明，PMA与TCM诱导的NETs共享以细胞骨架重塑、内膜系统功能及基础代谢为核心的分子特征。

2.4.2 PMA-NETs和TCM-NETs的高丰度共同蛋白分析

把PMA和TCM两组的共同蛋白按表达量进行高低排序，分别取两组表达前1 000的高丰度蛋白，取交集，得到共同蛋白794种，然后进行亚细胞定位及通路富集分析。亚细胞定位结果表明这些高表达蛋白主要定位在细胞质与细胞膜，同时线粒体、内质网、高尔基体及细胞外区域占比较高（见图6A）。GO富集分析结果表明，BP中蛋白显著富集于代谢过程、细胞组分/组织及生物发生相关；MF则主要富集于结合活性及催化活性（见图6B）。KEGG通路富集分析显示，高表达蛋白显著富集于细胞骨架调控通路、核糖体与内质网蛋白加工通路及碳代谢等（见图6C）。上述结果表明，细胞骨架重塑、蛋白合成加工及能量代谢是NETs形成过程中最核心的分子事件。

2.5 差异蛋白互作网络（PPI）分析

基于STRING数据库的蛋白质相互作用网络分析，结合pagerank算法挑选前50个顶点构建了互作网络，结果表明：PMA-NETs高表达蛋白（绿色节点）主要集中于炎症（Tnf、Il1b）、整合素（Itgam、Itgb2）及吞噬囊泡运输（Lamp1、Rab7）模块，这与经典氧化应激依赖型NETosis的分子特征相一致；而TCM-NETs高表达蛋白（红色节点）则以细胞周期调控（Plk1、Cdk1、Aurka）和核糖体生物发生（Rps11、Nop56）为核心，同时伴有代谢重塑与免疫炎症蛋白的活化，呈现出更贴近肿瘤微环境的表型倾向（见图7）。

3 讨论

中性粒细胞是机体抵御外源病原体入侵的第一道防线，其释放NETs的功能已成为近年来的研究热点。NETs的形成是先天免疫应答的关键过程，广泛参与机体感染、炎症及肿瘤发生发展的生理病理过程^［7］。目前，体外诱导NETs的方法主要包括：①化学诱导剂如PMA、离子霉素等；②病原体/微生物相关刺激；③细胞因子/炎症介质等；④纳米颗粒与晶体，例如疏水性纳米颗粒、多聚赖氨酸涂层和胆固醇晶体等^［8-10］。既往研究多采用PMA等强效化学诱导剂，该方法效率高、重复性好，但单一化学剂刺激方式与体内复杂的病理生理环境存在差异。为突破这一局限，近年研究者致力于开发更具生理相关性的诱导模型，例如利用TNF-α或LT-α等多种炎症因子的组合，在离体全血中模拟脓毒症等病理状态下的NETs形成过程，能更好地反映中性粒细胞在复杂生理环境下的反应，对于药物筛选和机制研究具有更高价值^{［11，12］}。

TCM中含有丰富且复杂的生物活性成分，包括多种细胞因子、趋化因子、外泌体及代谢产物等多种复杂成分^{［13，14］}，可精准模拟肿瘤肿瘤微环境特征。如TCM中的IL-8、TNF-α以及IL-6、血管内皮生长因子-A（VEGF-A）和表皮生长因子（EGF）等可通过调控相关信号通路，参与诱导NETs^［15］。现阶段研究已证实PMA与TCM均可成功诱导NETs形成，但其背后的分子机制、NETs的蛋白组成及其功能特性是否存在差异，目前尚不清楚。而阐明上述差异，是解析体外实验结果与临床病理特征关联性的关键。基于此，本研究的核心科学问题在于：PMA与TCM诱导的NETs在蛋白质组学层面上有何共性及特异性？

为此，本研究通过蛋白组学测序技术，系统筛选PMA-NETs与TCM-NETs两组的差异蛋白，进行聚类分析、亚细胞定位、GO功能注释及KEGG通路富集，明确了PMA-NETs与TCM-NETs的高表达蛋白既有空间分布的共性，又存在功能通路的显著差异。两组核心蛋白均定位于细胞质与细胞膜，介导基础的信号传导、物质转运与代谢调控，是中性粒细胞活化、NETs结构组装的共有基础。而两组NETs的调控机制存在显著差异。PMA诱导的NETs高表达Cybb、Cyba、Mpo等氧化应激相关蛋白，Cybb与Cyba组成NADPH氧化酶核心结构，介导活性氧生成，进一步激活氧化磷酸化代谢通路，同时协同MPO参与吞噬体组装与功能活化，这从分子层面衔接了KEGG通路富集结果中的氧化磷酸化与吞噬体通路，构成完整的分子调控链，明确了PMA依靠氧化应激轴介导经典NETosis发生，与以往研究一致^{［16，17］}；TCM模拟肿瘤微环境诱导的NETs高表达Trap1、H1f3等，二者协同调控细胞代谢重塑与基因组稳态，正向驱动细胞周期进程，同时参与激活p53信号通路和DNA复制与修复通路；另外TCM-NETs高表达Prg2、Ltf、Lcn2、C3等炎症及免疫效应蛋白一方面参与肿瘤微环境炎症微环境重塑，另一方面可调控胞内物质转运、辅因子合成、脂质代谢等通路的活化，还可参与核糖体组装与功能调控，促进核糖体生物发生过程，更贴近体内病理状态下NETs的调控特点，体现了肿瘤微环境中NETs的多功能性。

其次，为明确PMA与TCM两种不同刺激方式诱导形成的NETs是否存在保守的核心蛋白，对蛋白质组测得的两组NETs的全部蛋白取交集，发现PMA-NETs与TCM-NETs共享几千种共同表达蛋白，其中包括NETs经典标志物（如核心组蛋白H2A、H2B、H3、H4、NE、MPO等），证实了不同刺激诱导形成的NETs存在高度保守的分子机制。这些共同蛋白负责维持细胞基础代谢、结构稳态与核心功能执行，是NETs得以形成并发挥生物学功能的根本保障，而在前面分析的差异蛋白则体现了不同刺激下NETs的机制特异性与功能异质性，二者结合全面揭示了经典化学刺激与肿瘤微环境刺激下NETosis的共性与个性机制。

本研究通过蛋白质组学全面分析，发现PMA-NETs和TCM-NETs存在“同中有异”的特点，反映了NETosis机制的多样性与环境依赖性，为精准干预不同来源的NETs提供了分子靶点，为开发NETs相关疾病的治疗提供了理论依据。然而，本研究仍存在一定的局限性，首先，本研究采用单一肿瘤细胞系上清构建TCM诱导模型，不同肿瘤细胞的上清可能诱导不同的NETs蛋白表达谱；其次，在后续研究应用时需注意，本研究以PMA和TCM体外诱导获得的NETs相关产物进行组学分析，所得蛋白谱不仅涵盖了NETs自身组分的变化，也混杂了中性粒细胞受刺激后释放的胞外分泌蛋白、少量细胞裂解后的蛋白及背景杂质等多种成分的干扰，结论不完全等同于纯净的NETs组成的特异性改变；同时本研究仅通过生物信息学方法解析了PMA与TCM刺激形成NETs的共同蛋白和差异蛋白及相关通路，未进一步验证其中关键蛋白及通路在NETs形成中的具体作用机制，后续研究可通过Western blot、RT-qPCR等实验，验证核心蛋白及相关通路在NETs形成中的具体机制；最后，本研究为体外实验，所得结果能否反映体内NETs的形成机制，仍需通过动物实验进一步验证，后续可构建动物模型，探究共同蛋白及相关通路在体内NETs形成中的作用，为NETs相关疾病的干预提供更可靠的实验基础。

综上所述，PMA与TCM均可成功诱导NETs形成，两类NETs在蛋白质组分上共享保守核心蛋白与基础通路，又呈现出显著的诱导条件特异性：PMA驱动的是经典的氧化应激依赖型NETosis；而TCM模拟肿瘤微环境，诱导出以代谢重塑、周期调控和免疫炎症为特征的肿瘤相关的NETs。这为精准靶向肿瘤微环境中的NETs提供理论基础与潜在的分子靶点。

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基金资助

陕西省自然科学基础研究计划项目(2019JQ-962)

西安交大基础临床融合项目(YXJLRH2022098)

西安交大二附院自由探索项目［2020YJ（ZYTS）546-03］