慢性束缚应激诱导IBS⁃D小鼠结肠组织的转录组学分析及关键通路筛选

Transcriptomic analysis of colon tissue from chronic restraint stress-induced IBS⁃D mouse model and screening of key pathways

摘要

目的 筛选慢性束缚应激诱导的腹泻型肠易激综合征（IBS-D）模型小鼠结肠组织中与肠道通透性增高和内脏高敏感相关的关键基因及通路。 方法 将12只C57BL/6雄性小鼠随机分为对照组与模型组（各6只）。模型组予慢性束缚应激构建IBS-D模型，每日束缚2 h，连续12 d；对照组不予任何干预，正常饲养。评估两组小鼠体质量变化；采用梯度结直肠扩张（依次给予0.2，0.3，0.4 mL生理盐水）计算腹壁撤退反射（AWR）评分评估内脏敏感性；以异硫氰酸荧光素标记葡聚糖（FITC-dextran）灌胃后4 h采血，并检测血清荧光强度评估肠道通透性。对小鼠结肠组织进行RNA-seq测序（Illumina NovaSeq平台），以|log₂FC|>1且P<0.05筛选差异基因（DEGs），并采用GO、KEGG及Reactome数据库进行功能富集分析。 结果 两组小鼠基线体质量差异无统计学意义［（22.98±1.66）g vs （23.53±1.15）g，P>0.05］。模型组小鼠体质量净增量显著低于对照组［（0.10±0.75）g vs （1.70±0.64）g，P<0.05］。在0.2 mL和0.3 mL生理盐水扩张刺激下，模型组AWR评分均显著高于对照组（P<0.001）；模型组血清FITC-dextran浓度高于对照组（P<0.01）。转录组测序共鉴定出273个DEGs，其中显著上调基因97个，显著下调基因176个。GO富集分析显示，DEGs主要富集于免疫应答、抗原识别及细胞外区域相关功能；KEGG富集分析提示其参与肠道屏障维持与内脏感觉信号传递；Reactome分析表明DEGs在免疫受体激活及钙信号传导通路中显著富集。 结论 慢性束缚应激IBS-D模型小鼠结肠转录组发生显著改变，这些改变可能通过激活肠道免疫炎症反应、破坏黏液屏障完整性和增强内脏感觉神经传导，进而参与IBS-D的发病机制。

Abstract

Objective To screen key genes and pathways associated with increased intestinal permeability and visceral hypersensitivity in the colon tissue of chronic restraint stress-induced mouse model of diarrhea-predominant irritable bowel syndrome（IBS-D）. Methods Twelve male C57BL/6 mice were randomly divided into control group and model group（n=6 each）. The mice in model group were subjected to chronic restraint stress for 2 h per day over 12 consecutive days to establish the IBS-D model， while the mice in control group received no intervention and were raised under normal conditions. Body weight changes were evaluated in both groups. Visceral sensitivity was assessed by the abdominal withdrawal reflex（AWR） score in response to graded colorectal distension after sequential administration of 0.2， 0.3， and 0.4 mL of normal saline. Intestinal permeability was evaluated by measuring serum fluorescence intensity at 4 h after gavage of fluorescein isothiocyanate-labeled dextran（FITC-dextran）. RNA-seq was performed on mouse colon tissues using the Illumina NovaSeq platform. Differentially expressed genes（DEGs） were screened using a cutoff of |log₂FC|>1 and P<0.05， and analyzed using GO， KEGG， and Reactome databases. Results There was no significant difference in baseline body weight of mice between the two groups ［（22.98±1.66）g vs （23.53±1.15）g， P>0.05］. The net body weight gain in model group was significantly lower than that in control group ［（0.10±0.75）g vs （1.70±0.64）g， P<0.05］. Under colorectal distension with 0.2 mL and 0.3 mL of saline， AWR scores were significantly higher in the model group than in the control group （both P<0.001）. Furthermore， the serum FITC-dextran concentration in model group was significantly elevated compared with control group（P<0.01）. RNA-seq identified 273 DEGs， including 97 significantly up-regulated genes and 176 significantly down-regulated genes. GO enrichment results showed that the DEGs were mainly enriched in functions related to immune response， antigen recognition， and the extracellular region. KEGG enrichment results suggested they were involved in intestinal barrier maintenance and visceral sensory signaling. Reactome analysis showed that DEGs were significantly enriched in immune receptor activation and calcium signaling pathways. Conclusion Chronic restraint stress induced significant transcriptional changes in the colonic transcriptome of IBS-D model mice. These changes may contribute to the pathogenesis of IBS-D by activating intestinal immune inflammatory responses， disrupting mucus barrier integrity， and enhancing visceral sensory neural transmission.

Graphical abstract

关键词

腹泻型肠易激综合征 / 慢性束缚应激 / 肠道通透性 / 内脏高敏感 / 转录组测序

Key words

diarrhea-predominant irritable bowel syndrome / chronic restraint stress / intestinal permeability / visceral hypersensitivity / transcriptomic sequencing

肠易激综合征（irritable bowel syndrome， IBS）是一种以反复腹痛、腹胀伴排便习惯改变为特征的常见功能性胃肠病^［1］。基于罗马Ⅳ诊断标准，IBS包含腹泻型（IBS-D）、便秘型、混合型、未定型4种亚型。一项覆盖52个国家、基于罗马Ⅲ和Ⅳ标准的Meta分析显示，全球IBS整体患病率为14.1%，IBS-D亚型占全部IBS患者的26.5%^［2］。中国为IBS高患病率地区，人群整体患病率5.0%，且IBS-D是中国人群的主要亚型^［3］。尽管IBS-D的病理机制尚未完全阐明，但内脏高敏感性与肠道屏障功能障碍被认为是其核心病理生理特征^［4-6］。

鉴于在人体中深入探究IBS-D发病机制存在伦理和技术上的局限，构建能模拟IBS-D核心特征的动物模型至关重要。在IBS-D动物模型中，慢性束缚应激模型因具有独特优势而被广泛应用^［7，8］。该模型操作简便、造模周期可控，且能精准模拟临床中与IBS-D发病密切相关的心理应激因素。更为关键的是，该模型能有效诱导小鼠出现肠道通透性增加和内脏高敏感性，与临床IBS-D患者的病理表现高度一致，为后续机制研究提供了可靠的动物实验基础。

随着转录组学技术的发展，RNA测序（RNA sequencing，RNA-seq）为系统解析IBS-D分子机制提供了可能^［9］。本研究通过构建束缚应激IBS-D小鼠模型，结合表型验证与结肠组织RNA-seq分析，借助基因本体论（Gene Ontology，GO）、京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）及Reactome等多维功能富集分析，筛选与肠道通透性及内脏高敏感相关的差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）及通路，从分子层面阐明IBS的发病机制，为后续靶向治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本研究选用12只6~8周龄、体质量20~22 g的SPF级C57BL/6雄性小鼠，饲养于标准SPF级环境中：环境温度控制在20~22 ℃，相对湿度维持于50%~70%，遵循12 h光照/12 h黑暗的昼夜节律，小鼠自由进食饮水，饲料及饮用水均经标准化灭菌处理。本动物实验方案已通过空军军医大学实验动物科技伦理委员会审批（伦理批准文号：20260100），所有动物操作均严格遵循《实验动物福利伦理审查指南》相关规定。

1.2 主要试剂

异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖（fluorescein isothiocyanate-dextran， FITC-dextran），分子量4 kDa，货号FD4，购于美国Sigma-Aldrich公司。

1.3 实验分组与模型建立

小鼠先进行为期1周的适应性饲养，随后被随机分为两组，即对照组与模型组（n=6）。模型组采用束缚应激法构建IBS-D模型：选用与小鼠体重适配的50 mL透明试管，内填无菌脱脂棉以限制小鼠活动；每日上午9：00-11：00于清醒状态下束缚2 h，连续干预12 d^{［10，11］}，束缚期间禁食禁水，束缚结束后将小鼠放回原饲养笼，自由进食饮水。对照组常规饲养，不施加任何干预。

1.4 模型评估

1.4.1 小鼠体质量增长监测

分别于造模后第0，3，6，9，12天称量两组小鼠体质量，以第0天体质量为初始体质量，计算各时间点的体质量变化量（各时间点体质量-初始体质量），绘制变化曲线以评估体质量变化趋势。

1.4.2 结直肠扩张法联合腹壁撤退反射（abdominal withdrawal reflex，AWR）评分评估内脏敏感性

采用结直肠扩张法评估内脏敏感性。将外径2.0 mm的可扩张气囊经肛门插入结直肠（距肛门约1 cm），分别注入0.2，0.3，0.4 mL生理盐水进行梯度扩张刺激，同步记录AWR评分，评分采用0~4分制：0分，无行为反应；1分，头部轻微动作或静止不动；2分，腹壁肌肉轻微收缩；3分，腹壁强烈收缩或腹部抬起；4分，骨盆抬起或身体弓起。分数越高，提示内脏高敏感性越强^［12］。

1.4.3 FITC-dextran灌胃法评估肠道通透性

小鼠造模结束后，按0.6 mg/g体质量灌胃给予小鼠60 mg/mL FITC-dextran溶液，灌胃体积V（μL）=小鼠体质量（g）×10 μL/g^［13］。灌胃4 h后，经异氟烷麻醉行心脏穿刺采血，离心分离血清，避光-80 ℃保存待测。高速离心取上清进行检测。每样本设3个复孔，使用荧光酶标仪（激发/发射波长：488 nm/520 nm）检测血清荧光强度。通过FITC-dextran标准品建立浓度梯度标准曲线，计算血清中FITC-dextran浓度。

1.5 RNA⁃seq转录组测序技术分析结肠组织DEGs及功能富集

采集小鼠结肠组织，提取RNA；待质控合格后，构建Illumina测序文库，并在NovaSeq X Plus平台完成测序。原始数据经质控过滤后与参考基因组比对，使用DESeq2软件筛选DEGs［阈值：|log₂（差异倍数，FC）|≥1，P<0.05］。并基于GO、KEGG及Reactome数据库，对DEGs进行功能注释及富集分析。

1.6 统计学分析

统计分析使用SPSS 23.0软件，绘图采用R语言软件。计量资料正态分布时以均数±标准差（X±S）表示并行独立样本t检验；非正态分布时以M（P₂₅，P₇₅）表示，并采用Mann-Whitney U检验；对于不同时间点重复测量的体质量数据，采用重复测量方差分析进行整体比较，若Mauchly球形检验不满足（P<0.05），则采用Greenhouse-Geisser法进行自由度校正。双侧P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 慢性束缚应激对IBS-D模型小鼠体质量、内脏敏感性和肠道通透性的影响

模型组与对照组小鼠基线体质量无差异［（22.98±1.66）g vs（23.53±1.15）g，P>0.05］。模型组小鼠体质量净增显著低于对照组［（0.10±0.75）g vs（1.70±0.64）g，P<0.05］。如图1所示，两组小鼠体质量变化量存在显著差异（F_（1，10）=32.52，P<0.001），且分组与测量时点的交互效应显著（Greenhouse-Geisser校正，F_（4，40）=9.48，P<0.01），提示模型干预会影响小鼠体质量的增长体质量。分别在0.2，0.3，0.4 mL结直肠扩张刺激下，模型组AWR评分均呈现升高趋势。0.2 mL和0.3 mL刺激下，模型组AWR评分显著高于对照组（P<0.001），0.4 mL刺激下两组小鼠AWR评分均达到较高水平，模型组略高于对照组（见图2）。此外，模型组小鼠血清中FITC-dextran的浓度也显著上升（见图3），提示肠道屏障功能受损。

2.2 慢性束缚应激对小鼠结肠组织转录组表达谱的影响

以校正后P<0.05且∣log₂FC∣>1为筛选阈值，对两组样本的转录组数据进行差异表达分析，结果如图4所示。分析结果显示，在检测的所有基因中，共鉴定出273个DEGs，其中，显著上调基因97个，显著下调基因176个。在下调基因中，本研究重点关注两类与肠道黏膜屏障功能密切相关的基因：肠道黏膜中与黏蛋白核心成分（Muc2、Muc4）以及黏液加工与分泌（Agr2、Clca3b、Gsdmc2、Gsdmc3、Gsdmc4、Exph5、Ano7）相关的基因。

2.3 慢性束缚应激对小鼠结肠DEGs的GO功能、KEGG通路及Reactome通路富集结果的影响

对筛选得到的DEGs进行GO功能富集分析，以揭示其核心生物学功能特征。结果表明，DEGs主要富集于免疫激活应答相关的分子功能、生物学过程及细胞组分。具体来说，分子功能上主要富集于免疫球蛋白受体结合、抗原结合等免疫相关结合功能；生物学过程高度聚焦于免疫应答核心通路，包括补体激活经典途径、B细胞受体信号通路、吞噬作用（识别与吞噬）、免疫应答激活及B细胞激活的正调控与整体调控等过程，抗原受体介导的信号通路、细胞识别等免疫相关过程也被显著富集；细胞组分则集中在免疫分子定位与信号传导相关区域，涵盖免疫球蛋白复合物、细胞外区域、质膜外侧、质膜内陷、细胞膜侧面及细胞外间隙等（见图5）。

在KEGG富集分析通路中，与肠道黏膜屏障功能密切相关的通路包括黏蛋白型O-聚糖生物合成、矿物质吸收等；与神经信号调节相关的通路涵盖胆碱能突触、钙信号通路及神经活性配体-受体相互作用等；此外，还涉及α-亚麻酸代谢、胰岛素分泌、胰腺分泌等代谢与内分泌相关通路（见图6）。

Reactome通路富集分析进一步解析了DEGs参与的具体生物学事件。富集到的通路主要涉及三大类：神经信号调节相关通路包括FCERI介导的钙动员、LAT2/NTAL/LAB在钙动员中的作用，以及FCERI介导的MAPK激活通路；黏膜屏障相关通路涵盖血浆血红素清除、清道夫受体介导的配体结合与摄取；免疫激活相关通路则涉及补体级联激活、B细胞受体信号通路等（见图7）。

3 讨论

本研究发现，慢性束缚应激可显著影响小鼠的体质量增长、内脏敏感性及肠道屏障功能。在体质量方面，模型组小鼠体质量增长量显著低于对照组，且分组与测量时点的交互效应显著，提示应激干预对体质量增长具有时间累积性的抑制作用。在内脏敏感性方面，模型组在0.2 mL和0.3 mL扩张容量下的AWR评分均高于对照组，表明模型组小鼠对结直肠扩张刺激的痛觉反应增强，即存在内脏高敏感；而在0.4 mL高容量刺激下，两组小鼠的AWR评分均达到较高水平，组间差异缩小，提示高强度刺激可能引发了两组小鼠的痛觉反应。在肠道屏障功能方面，模型组小鼠血清中FITC-dextran浓度显著高于对照组，表明肠道通透性增加，屏障功能受损。

本研究通过转录组测序从黏液屏障相关基因表达层面，为IBS-D小鼠肠道屏障受损补充了直接分子证据：在IBS-D小鼠模型中，多个参与肠道黏液屏障形成与调控的关键基因均显著下调。具体而言，编码黏蛋白核心成分的Muc2与Muc4表达降低，其中Muc2是形成肠道保护性黏液凝胶层的主要黏蛋白，Muc4则参与膜结合黏蛋白介导的上皮防御^［14］。此外，一系列与黏液加工及分泌过程密切相关的基因也同步下调，包括负责黏蛋白前体折叠的Agr2、调节黏液释放的Clca3b、参与上皮细胞分泌与焦亡调控的Gsdmc家族（即Gsdmc2、Gsdmc3、Gsdmc4）、影响黏蛋白颗粒胞吐的Exph5，以及钙激活氯离子通道Ano7^［15-17］。上述基因的协同下调，从转录组层面强烈提示IBS-D小鼠存在明显的肠道黏液屏障结构或功能障碍，为该疾病的黏膜保护缺陷机制补充了重要的分子证据。KEGG通路分析显示，DEGs同时富集于“黏蛋白型O-聚糖生物合成”与“矿物质吸收”通路，前者影响黏液蛋白糖基化修饰与稳定性^［18］，后者调控上皮细胞紧密连接与离子转运^［19］，表明束缚应激通过破坏黏液化学屏障与上皮物理屏障的双重机制，加剧肠道通透性异常。

免疫激活是连接肠道屏障损伤与内脏高敏感的关键枢纽^{［20，21］}。GO富集分析显示，DEGs广泛参与免疫应答激活、补体激活、吞噬作用等固有免疫过程，提示肠道存在持续性低度炎症状态。Reactome通路中“FCERI介导的钙动员”显著富集，进一步明确肥大细胞活化在IBS-D中的核心作用。FCERI作为肥大细胞高亲和力受体，其激活可触发组胺、类胰蛋白酶等活性介质释放，既直接破坏上皮紧密连接、加重屏障损伤，又能敏化内脏传入神经末梢、降低兴奋阈值。

此外，神经信号调节紊乱是IBS-D内脏高敏感的重要分子基础^［22］。KEGG分析中“胆碱能突触”与“钙信号通路”的富集特征，提示肠神经系统功能异常是IBS-D的重要发病环节。胆碱能神经作为肠神经系统核心组成，其功能紊乱可直接放大内脏感觉信号传导^［23］；钙信号作为细胞内通用信使，其通路异常参与神经元兴奋性调控、免疫细胞活化等多个环节，与免疫激活、屏障损伤通路交织，导致内脏高敏感性^［24］。

本研究存在以下局限性：第一，样本量（每组n=6）偏小，可能影响统计功效和结果的稳健性；第二，转录组分析仅反映基因表达层面的变化，核心差异基因的功能仍需在蛋白质水平进一步验证；第三，关键基因的因果作用尚需通过基因敲除或过表达等功能实验予以明确；第四，肠道微生物的改变是IBS-D的重要病理机制^［25-27］，但本研究未纳入肠道菌群与宿主的互作分析，未来可结合微生物组学开展更全面的机制探讨。

综上，本研究系统描绘了束缚应激IBS-D模型结肠的转录组分子图谱，证实差异表达基因通过调控免疫应答与肠道功能，共同参与肠道屏障损伤与内脏高敏感的发生，为IBS-D的精准治疗提供了新的实验依据与研究方向。

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基金资助

陕西省创新能力支撑计划项目(2024CX-GXPT-44)