黄芩素延缓衰老的多模型药效学评价及基于网络药理学的机制初探

Multi-model pharmacodynamic evaluation of baicalein in anti-aging and preliminary mechanism exploration based on network pharmacology

摘要

目的 系统评价黄芩素的体外抗氧化活性、模式动物体内活性及细胞水平抗衰老作用，并预测其核心靶点与通路。 方法 采用2，2-二苯基-1-苦基肼（DPPH）和2，2'-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）法测定黄芩素体外抗氧化活性。以秀丽隐杆线虫为模型，设阴性对照组、维生素C阳性对照组及不同浓度黄芩素处理组（10^-8，10^-6，10^-4 mol/L），检测各组线虫寿命、应激耐受、运动能力及产卵量，并测定丙二醛（MDA）和脂褐素水平。构建H₂O₂氧化损伤及UVB光老化HaCaT细胞模型，采用噻唑蓝（MTT）法、2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）荧光探针法、衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色法评估细胞保护作用。运用网络药理学筛选黄芩素与衰老的共同靶点，进行GO与KEGG富集分析，并以分子对接验证核心靶点结合能力。　结果　黄芩素可清除DPPH和ABTS自由基。与阴性对照相比，10^-4 mol/L黄芩素显著延长线虫平均寿命（P<0.001），提高其在热、氧化应激及紫外辐射下的存活率（P<0.01），增强头部摆动与咽部泵动频率（P<0.01），降低MDA含量及脂褐素水平（P<0.01），且不影响产卵量。黄芩素可提高H₂O₂损伤后HaCaT细胞相对存活率（P<0.001），降低ROS水平（P<0.01），并减少UVB诱导的SA-β-gal阳性细胞率（P<0.01）。经筛选获得19个共同靶点，其中核心靶点包括SIRT1、ESR1、MAPK3，富集分析显示这些靶点主要参与VEGF通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药通路及细胞衰老通路。分子对接显示黄芩素与ESR1结合能力最强。　结论　黄芩素在多个层次模型中表现出抗衰老活性，既能延长寿命、增强应激耐受，又能减轻氧化损伤和光老化。网络药理学预测其可能通过SIRT1、ESR1调控VEGF、EGFR及细胞衰老等通路。

Abstract

Objective To systematically evaluate the in vitro antioxidant activity of baicalein， its in vivo efficacy in model animals， and its anti-aging effects at the cellular level， and further predict its core targets and pathways. Methods The in vitro antioxidant activity of baicalein was determined using 2，2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl（DPPH） and 2，2′-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid） diammonium salt（ABTS） radical scavenging assays. Caenorhabditis elegans was used as the model organism. Negative control， vitamin C group， and different baicalein treatment groups（10^-8， 10^-6， and 10^-4 mol/L） were established. The lifespan， stress resistance， locomotor capacity， and brood size were measured， and the levels of malondialdehyde（MDA） and lipofuscin were detected. HaCaT cell models of H₂O₂-induced oxidative damage and UVB-induced photoaging were established， and the protective effects on cells were evaluated using methyl thiazolyl tetrazolium（MTT） assay， DCFH-DA fluorescence probe method， and SA-β-gal staining. Common targets between baicalein and aging were identified via network pharmacology， and analyzed by Gene Ontology（GO） and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） enrichment analyses. The binding affinity of core targets was further validated by molecular docking. Results Baicalein exhibited scavenging activity against DPPH and ABTS free radicals. Compared with the negative control， 10^-4 mol/L baicalein prolonged the mean lifespan of nematodes（P<0.001）， improved their survival rates under heat， oxidative， and ultraviolet stress（P<0.01）， increased the frequencies of head thrashing and pharyngeal pumping（P<0.01）， decreased the level of MDA and lipofuscin（P<0.01）， and had no effect on brood size. Baicalein significantly increased the viability of HaCaT cells after H₂O₂-induced damage（P<0.001）， reduced intracellular ROS level（P<0.01）， and decreased the proportion of SA-β-gal-positive cells induced by UVB irradiation（P<0.01）. A total of 19 common targets were identified， including SIRT1， ESR1， and MAPK3. Enrichment analyses revealed that these targets were primarily involved in VEGF， EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance， and cellular senescence pathways. Molecular docking further indicated that baicalein had the strongest binding affinity to ESR1. Conclusion Baicalein can exhibit anti‑aging activity in multiple models， extending lifespan， enhancing stress tolerance， and alleviating oxidative damage and photoaging. Network pharmacology predicts that baicalein may regulate the VEGF， EGFR， and cellular senescence pathways through SIRT1 and ESR1.

Graphical abstract

关键词

黄芩素 / 抗衰老 / 氧化应激 / 网络药理学 / 分子对接 / 秀丽隐杆线虫

Key words

baicalein / anti-aging / oxidative stress / network pharmacology / molecular docking / Caenorhabditis elegans

衰老是机体随年龄增长而发生的生理功能进行性衰退过程，与多种慢性疾病密切相关^［1］。随着全球人口老龄化加剧，探索安全有效的抗衰老干预策略成为研究热点。现代研究表明，氧化应激是衰老的关键驱动因素，活性氧（reactive oxygen species，ROS）过度积累可引发生物大分子氧化损伤，加速衰老^［2，3］。因此，从天然产物中筛选强效抗氧化活性成分是抗衰老药物研发的重要方向。

黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）为常用清热燥湿药，现代研究证实其具有显著抗氧化、抗炎等药理活性^［4，5］。黄芩素（baicalein）是黄芩的主要活性黄酮类成分，近年研究提示其在神经退行性病变、心血管损伤等衰老相关疾病模型中具有保护作用^［6，7］。且已在多种动物模型中证实其抗衰老效果（如延长寿命、改善认知功能等）^［8-10］，但现有研究多侧重特定模型或单一表型，缺乏多层级生物模型的系统评价，其在衰老相关运动功能衰退及皮肤光老化防护中的作用仍需深入探索。

秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）因其生命周期短、遗传背景清晰，是理想的体内衰老研究模型^{［11，12］}。网络药理学为解析天然产物复杂作用机制提供了系统性视角^［13］。目前，尚无研究将线虫评价、人源细胞功能验证与网络药理学分析相结合，全面评估黄芩素抗衰老活性。基于此，本研究采用秀丽隐杆线虫模型以及H₂O₂、UVB诱导的人永生化角质形成细胞（human immortalized keratinocytes cell， HaCaT）模型，结合网络药理学与分子对接技术，系统评价黄芩素抗衰老活性并预测其作用靶点与通路，为其进一步研究提供实验参考。

1 材料与方法

1.1 生物材料与主要试剂

HaCaT细胞购自北京北纳创联生物技术研究院，野生型秀丽隐杆线虫（N2品系）由厦门大学惠赠，大肠杆菌（Escherichia coli OP50）购自山东中科嘉亿生物工程有限公司，线虫生长培养基（nematode growth medium，NGM）购自山东拓普生物工程有限公司，营养琼脂培养基购自广东环凯微生物科技有限公司，黄芩素（纯度≥98%）购自上海麦克林生化科技有限公司，2，2-二苯基-1-苦基肼（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl， DPPH）和2，2'-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐［2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS］购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒和2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2′，7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）活性氧检测试剂盒购自上海碧云天生物技术股份有限公司，衰老相关β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase，SA-β-gal）染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。

营养琼脂培养基、营养肉汤培养基及NGM培养基均参照产品说明书进行配制。黄芩素储备液（0.1 mol/L）通过精密称取54.05 mg黄芩素粉末，以含2%二甲基亚砜（DMSO）的溶液溶解并定容制得，4 ℃避光保存。

1.2 大肠杆菌OP50的复苏与纯化

将冻存的OP50菌株于37 ℃水浴中快速解冻，吸取适量菌液接种于营养肉汤培养基中，37 ℃、200 r/min振荡培养12 h。超净工作台中，将复苏菌液于固体营养琼脂平板上划线分离纯化，37 ℃培养过夜。挑取形态饱满的单菌落，接种于新鲜液体培养基中扩大培养，以获得纯化菌种，4 ℃保存备用。

1.3 秀丽隐杆线虫的培养与同期化

将纯化后的OP50菌液培养至对数生长期，取适量涂布于NGM平板中央，37 ℃培养12 h。冻存的线虫在室温解冻，挑取至上述平板表面，20 ℃恒温培养约48 h，待其复苏并产卵后，转移至新平板进行扩繁。同期化：参照文献［14］的方法并稍作改进。收集培养2 d的成年线虫，用M9缓冲液冲洗，加入等体积的裂解液（含次氯酸钠及NaOH），剧烈振荡2 min以溶解虫体，释放虫卵。以5 500 r/min离心1 min收集虫卵，用M9缓冲液重复洗涤3次以彻底去除裂解液。将获得的同步化L1期幼虫接种至涂布有OP50的NGM平板上，20 ℃培养至青年成虫（L4期）用于后续实验。

1.4 DPPH和ABTS法测定黄芩素体外自由基清除能力

DPPH自由基清除实验：参照文献［15］的方法。精确称取DPPH试剂，用无水乙醇配制成0.2 mmol/L的储备液。将黄芩素用无水乙醇稀释成系列浓度梯度（10^-10，10^-9，10^-8，10^-7，10^-6，10^-5，10^-4，10^-3，10^-2 mol/L），以等浓度梯度的维生素C溶液作为阳性对照。取100 μL不同浓度的黄芩素或维生素C溶液与900 μL DPPH溶液混合，室温避光反应30 min，于517 nm波长下测定其吸光度值。

ABTS自由基清除实验参照文献［15］的方法。将7.4 mmol/L ABTS溶液与2.6 mmol/L过硫酸钾溶液等体积混合，室温避光静置12~16 h，生成ABTS储备液。临用前，用无水乙醇将其稀释至734 nm波长下的吸光度值为0.70±0.02，即为ABTS⁺工作液。后续操作同DPPH法，测定波长为734 nm。自由基清除率计算公式为：清除率（%）=［1-（OD_样品/OD_对照）］×100%。

1.5 线虫生存曲线与寿命评估

参照文献［16］的方法，将同期化后的L4期线虫随机分组，分别转移至含有10^-8，10^-6，10^-4 mol/L黄芩素的NGM平板，并设置阴性对照组（含2% DMSO）和维生素C组（含20 mg/L维生素C，作为阳性对照）。每组设置3个平行重复，每个平板30条线虫。实验期间，每24 h将存活的线虫转移至新鲜对应的平板，并记录存活线虫数量，直至全部死亡。

1.6 应激胁迫下的线虫存活率分析

热应激实验：参照文献［17］的方法，将经药物处理48 h的线虫转移至新鲜NGM平板，待线虫适应10 min后置于35 ℃恒温培养箱中，每隔1 h记录一次存活线虫数量，直至全部死亡。每组设置3个平行重复，每个平板30条线虫。

氧化应激实验：参照文献［17］的方法。制备含3% H₂O₂的NGM平板。将经不同浓度黄芩素处理48 h的线虫转移至应激平板，持续暴露于H₂O₂应激条件下，每隔1 h记录一次存活线虫数量，直至全部死亡。每组设置3个平行重复，每个平板30条线虫。

紫外应激实验：将药物处理后的线虫置于新鲜NGM平板，经紫外线老化灯（UVB，280~320 nm，辐射剂量1 000 J/cm²）照射2 h，立即转移至正常平板恢复培养，每隔1 h记录一次存活线虫数量，直至全部死亡^［17］。每组设置3个平行重复，每个平板30条线虫。

1.7 线虫运动行为学记录

参照文献［18］的方法，将单条线虫转移至新鲜NGM平板不含菌的区域，适应1 min，立即开始记录其在30 s内的头部摆动次数，结果以次/30 s表示。在同一实验中，记录线虫10 s内的咽部泵动次数，结果以次/10 s表示。

1.8 线虫繁殖力与产卵统计

参照文献［18］的方法，将经药物处理的L4期单条线虫转移至新鲜平板，每24 h更换1次平板，直至其停止产卵。将有虫卵的平板于20 ℃培养24 h，立即开始计数孵出的幼虫数量，以此作为该线虫24 h内的产卵量，并计算总产卵量。

1.9 氧化损伤标志物检测

MDA含量测定：取各组（分组同1.5）处理5 d的线虫约300条，收集并匀浆后，严格按照丙二醛检测试剂盒说明书进行操作，测定线虫体内的丙二醛含量。

脂褐素测定：参照文献［18］的方法，取处理10 d的成年线虫，用0.2%叠氮化钠麻醉后，置于2%琼脂糖垫片上。在激发光365 nm、发射光420 nm条件下，使用荧光正置显微镜拍摄线虫肠道自发荧光图像，并采用Image J软件定量分析荧光强度。

1.10 HaCaT细胞损伤模型的构建及细胞活力与ROS水平检测

HaCaT细胞于含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。具体分组为：空白组（正常细胞，不进行H₂O₂与药物干预）、模型组（加H₂O₂，不进行药物干预）及黄芩素给药组（加H₂O₂，并进行不同浓度黄芩素干预）。建立H₂O₂诱导的氧化损伤模型，通过MTT法检测不同浓度（分别为10^-10，10^-9，10^-8，10^-7，10^-6，10^-5 mol/L）黄芩素预处理对细胞相对存活率的影响，并用DCFH-DA探针检测细胞内ROS水平^［15］。

1.11 HaCaT细胞光老化模型的构建及细胞活力与SA-β-gal染色阳性率检测

将HaCaT成纤维细胞接种到6孔板（每孔5×10⁵个细胞），设立空白组（正常细胞，不进行UVB照射与药物干预）、模型组（进行90 mJ/cm² UVB照射，不进行药物干预）及黄芩素给药组（接受90 mJ/cm² UVB照射与不同浓度黄芩素干预）。黄芩素给药组在进行UVB照射之前，细胞先用不同浓度黄芩素（10^-10，10^-9，10^-8，10^-7，10^-6，10^-5 mol/L）预处理1 h。对照组不进行UVB照射，仅加入等量DMEM培养基，其余处理均与黄芩素给药组相同。UVB照射后，采用MTT法检测细胞存活率；另取细胞用PBS洗涤2次，置于含新鲜血清的培养基中维持24 h，然后按照试剂盒说明书对衰老相关的SA-β-gal活性进行染色。在显微镜下观察计数衰老细胞（蓝色染色）的数量^［15］。

1.12 网络药理学预测抗衰老靶点与通路

靶点获取：通过SwissTargetPrediction数据库（http：//swisstargetprediction.ch/）预测黄芩素的潜在作用靶点。从GeneCards数据库中，以“Aging”为关键词检索人类衰老相关靶点。

核心靶点筛选与PPI网络构建：将上述获得的黄芩素靶点与衰老相关靶点取交集，获得共同作用靶点。将共同靶点导入STRING数据库（v 11.5），设定物种为“Homo sapiens”，最低互作置信度设为0.70，隐藏游离蛋白，构建蛋白互作网络（protein-protein interaction， PPI）。随后，使用Cytoscape软件（v 3.9.1）进行可视化与拓扑属性分析，采用MCODE插件进行子网络聚类分析，筛选核心靶点。

基因本体论（Gene Ontology，GO）与京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG）富集分析：将共同靶点提交至DAVID数据库（https：//davidbioinformatics.nih.gov/）进行GO功能注释和KEGG通路富集分析。设定P<0.05为显著性阈值，筛选显著富集的条目，并使用微生信在线平台（https：//www.bioinformatics.com.cn/）进行可视化，具体包括GO富集分析的气泡图以及KEGG通路富集分析的气泡图。

1.13 分子对接模拟黄芩素-靶蛋白结合亲和力

从蛋白质结构数据库［Research Collaboratory for Structural Bioinformatics-Protein Data Bank（RCSB PDB），https：//www.rcsb.org/］下载核心靶点蛋白的晶体结构。使用PyMOL软件去除水分子和原配体，使用AutoDockTools-1.5.7软件对蛋白质和黄芩素分子加氢、计算电荷等预处理。采用AutoDock Vina完成分子对接，采用Maestro及PyMOL软件可视化对接结果。

1.14 统计学分析

所有实验均独立重复3次以上。采用GraphPad Prism 9.5.1软件进行数据处理、图表绘制及统计学分析。DPPH和ABTS自由基清除实验中，各浓度梯度之间的剂量-效应趋势采用线性趋势检验评价。多组间总体差异比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）；若总体差异具有统计学意义，进一步采用Dunnett's检验进行各浓度组与相应对照组之间的两两比较。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 黄芩素对DPPH和ABTS自由基的清除作用

随着黄芩素浓度从10^-10 mol/L增至10^-2 mol/L，其对DPPH（F_（8，9）=838.9，P<0.001）和ABTS（F_（8，9）=268.1，P<0.001）自由基的清除率均显著提升，呈现出浓度依赖性趋势（见图1）。在最高测试浓度下，对DPPH自由基的清除率达到91.54%，与维生素C组（93.47%）效果相当；对ABTS自由基的清除效果亦与维生素C相近。黄芩素对DPPH和ABTS自由基的IC₅₀值分别为2.36 µg/mL和2.64 µg/mL。维生素C的抗氧化活性略强，对DPPH和ABTS自由基的IC₅₀分别为1.41 µg/mL和1.05 µg/mL（见图1）。

2.2 黄芩素对线虫寿命的影响

与阴性对照组相比，各浓度黄芩素处理组的生存曲线均明显右移。在实验第10天，阴性对照组存活率下降至47.55%，而10^-4，10^-6，10^-8 mol/L黄芩素处理组的存活率分别保持在84.78%，79.12%，61.76%，较阴性对照组分别提高了78.29%，66.39%，29.88%，差异均具有统计学意义（P<0.01，见图2）。

寿命统计分析结果显示，与阴性对照相比，各浓度（10^-8，10^-⁶，10^-4 mol/L）黄芩素及维生素C（20 mg/L）处理均显著延长线虫平均寿命（P<0.05）。其中，10^-4 mol/L黄芩素处理组线虫的平均寿命高于维生素C组，差异具有统计学意义（P<0.05）；10^-6 mol/L黄芩素组与维生素C组效果相当（见图2）。

2.3 黄芩素对线虫抗应激能力的影响

在35 ℃热应激实验中，相对于阴性对照组，黄芩素组线虫存活率均有所提升，线虫的寿命延长，其中10^-4 mol/L黄芩素组平均寿命较阴性对照组显著延长（P<0.001，见图3）。在3% H₂O₂氧化应激实验中，连续暴露4 h，阴性对照组存活率极低，相对于阴性对照组，黄芩素组线虫存活率同样提高，线虫的寿命延长，其中10^-4 mol/L黄芩素组平均寿命较阴性对照组显著延长（P<0.01，见图3）。在紫外应激实验中，相对于阴性对照组，黄芩素组线虫存活率同样提高，线虫的寿命延长，其中10^-4 mol/L黄芩素组线虫平均寿命较阴性对照组显著延长（P<0.001，见图3）。

2.4 黄芩素处理对线虫运动功能的影响

在头部摆动频率方面，10^-4 mol/L黄芩素组头部摆动频率显著高于阴性对照组（P<0.01）；10^-6 mol/L和10^-8 mol/L处理组与阴性对照组比较，差异均无统计学意义（见图4）。

在吞咽频率方面，10^-4 mol/L黄芩素组吞咽频率显著高于阴性对照组（P<0.01），10^-6 mol/L黄芩素组吞咽频率也高于阴性对照组（P<0.05）；10^-8 mol/L黄芩素组与阴性对照组相比，差异无统计学意义（见图4）。

在产卵量方面，10^-4，10^-6，10^-8 mol/L黄芩素组产卵量与阴性对照组比较，差异均无统计学意义（见图4）。

2.5 黄芩素处理对线虫体内MDA及脂褐素水平的影响

10^-4 mol/L黄芩素组丙二醛含量显著低于阴性对照组（P<0.01）；10^-6 mol/L组丙二醛含量也低于阴性对照组（P<0.05）；10^-8 mol/L处理组与阴性对照组比较，差异无统计学意义（见图5）。

10^-4 mol/L黄芩素组荧光强度显著低于阴性对照组（P<0.001）；10^-6 mol/L和10^-8 mol/L处理组荧光强度亦低于阴性对照组（P<0.01）。维生素C组荧光强度同样低于阴性对照组（P<0.01，见图5）。

2.6 不同浓度黄芩素对H₂O₂诱导的HaCaT细胞氧化损伤的影响

经H₂O₂处理后，模型组HaCaT细胞相对存活率显著低于空白组（P<0.05）。与H₂O₂模型组相比，10^-10，10^-9，10^-8，10^-7，10^-6，10^-5 mol/L黄芩素组细胞相对存活率均显著升高（P<0.05），其中10^-5 mol/L黄芩素组相对存活率最高（见图6A）。

ROS检测结果显示，经H₂O₂处理后，模型组细胞内相对ROS水平显著高于空白对照组（P<0.01）。与模型组相比，10^-10，10^-9，10^-8，10^-7，10^-6，10^-5 mol/L黄芩素处理组细胞内相对ROS水平均显著降低（P<0.05或P<0.01，见图6B）。

2.7 黄芩素对UVB诱导HaCaT细胞光损伤的影响

经UVB辐射后，模型组HaCaT细胞相对存活率显著低于空白组（P<0.001），细胞形态出现损伤。与模型组相比，10^-10，10^-9，10^-8，10^-7，10^-6，10^-5 mol/L黄芩素组细胞相对存活率均显著升高（P<0.05），其中10^-8 mol/L黄芩素组存活率最高（见图7A）。β-半乳糖苷酶染色结果显示，黄芩素处理组阳性细胞率低于模型组（见图7B）。

2.8 黄芩素抗衰老作用的靶点与通路分析

通过数据库筛选，获得100个黄芩素潜在作用靶点，与603个衰老相关靶点取交集后，得到19个共同作用靶点（见图8A）。蛋白互作网络分析及共同靶点之间的相互作用关系显示，SIRT1、ESR1、MAPK3、APP、SRC、FYN、PARP1、PTGS2、MAPT、EGFR这10个靶点处于网络核心位置（见图8B、C）。

GO功能富集分析结果显示，这10个核心靶点显著富集于多个功能条目，涵盖生物过程、细胞组分和分子功能。在生物过程方面，靶点主要涉及表皮生长因子受体信号通路、胶原激活的酪氨酸激酶受体信号通路等；细胞组分主要富集于胞质溶胶、受体复合物、质膜等；分子功能主要包括组蛋白H3Y41激酶活性、ATP结合、蛋白质酪氨酸激酶活性等。KEGG通路富集分析显示，这些核心靶点显著富集于多条信号通路，包括VEGF信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药通路、HIF-1信号通路、细胞衰老、长寿调节通路等（见图8D）。

2.9 分子对接验证黄芩素与核心靶点的结合能力

对10个核心靶点进行分子对接，结合能低于-5 kCal/mol的前5个靶点分别是ESR1、MAPK3、APP、EGFR、SRC。黄芩素与ESR1的结合能为-7.27 kCal/mol，与MAPK3、APP、EGFR、SRC的结合能分别为-6.10 kCal/mol、-5.12 kCal/mol、-4.94 kCal/mol、-4.40 kCal/mol。黄芩素与ESR1的相互作用分析显示，其与关键氨基酸残基GLU-353、ARG-394形成氢键，与LEU-387、LEU-346、MET-388等残基形成疏水相互作用（见图9）。

3 讨论

近年来，天然产物在抗衰老领域的研究日益受到关注。本研究以秀丽隐杆线虫整体模型、HaCaT细胞氧化损伤模型与光老化模型为研究体系，结合网络药理学与分子对接技术，从表型观察、功能评价、靶点预测多维度系统探究黄芩素的抗衰老作用及潜在机制。该策略不仅为天然产物抗衰老活性评价及作用机制解析提供了较为完整的研究思路，也为黄芩素在功能性化妆品、皮肤抗衰及健康相关产品中的开发应用提供实验依据。

与传统的单一机制研究不同，本研究中黄芩素延长寿命、增强多重应激抵抗、改善运动功能且不影响生殖的特征，不同于典型抗氧化剂的表型谱，提示其可能通过多靶点协同发挥作用。该特征与黄酮类化合物可通过模拟热量限制效应延缓衰老的报道^{［19，20］}相契合，支持黄芩素可能涉及热量限制相关调控途径。近期发表的文献中DAF-16/FOXO通路研究^［21］亦与本研究的抗逆延寿表型一致，进一步印证了上述可能。在细胞层面，本研究发现黄芩素不仅显著提高了H₂O₂诱导氧化损伤的HaCaT细胞相对存活率，还有效缓解了UVB辐射所致的光老化损伤，表现为细胞活力恢复与衰老标志物β-半乳糖苷酶阳性率下降，这与以往报道的“黄芩素通过抑制ROS-MAPK/NF-κB 轴减轻 UVB 光老化” 的机制相一致^［22］，既验证了本研究细胞实验结果的合理性，也将黄芩素的抗衰老潜力拓展至皮肤光老化这一具体应用场景，为其开发为功能性化妆品或皮肤抗衰原料提供了直接实验支持。

在机制探索层面，通过网络药理学与分子对接技术，预测SIRT1和ESR1可能是黄芩素发挥抗衰老作用的潜在靶点。SIRT1作为NAD⁺依赖性去乙酰化酶，参与能量代谢和应激应答，其激活可促进自噬和DNA修复^［23］；ESR1作为核受体超家族成员，除参与生殖调控外，亦在衰老进程中发挥调节作用^［24］。值得注意的是，SIRT1-p53信号轴已被多项研究证实参与天然产物的抗衰老作用^［25］，而黄芩素作为黄芩主要活性成分，其调控SIRT1的潜力亦在部分研究中被提及^［26］，这与本研究的预测结果具有一定一致性，进一步说明靶点预测的科学性。分子对接结果显示，黄芩素与SIRT1和ESR1具有一定的结合潜力，特别是与ESR1的结合能较低，提示其可能具备结合可行性，可为后续靶点验证提供线索。此外，本研究所观察到黄芩素可降低 MDA 含量并减少脂褐素积累，结合线粒体功能失调是衰老的重要驱动因素^［27］，提示其或有助于减轻氧化损伤相关的细胞功能退化。网络药理学预测的VEGF和EGFR等信号通路，可能在维持组织稳态和促进损伤修复中发挥一定作用^［28］，从而在抗氧化基础上参与更广泛的衰老相关生物学过程。从更广视角看，黄芩素所属的黄酮类化合物被认为具有延缓衰老细胞积累、抑制衰老相关分泌表型的作用，可通过多靶点调节衰老微环境^［29］，这也为本研究中黄芩素表现出的多维度抗衰老活性提供了理论依据。

然而，本研究仍存在若干值得深入探讨的局限性。首先，网络药理学预测的核心靶点（如ESR1、SIRT1）及其在黄芩素抗衰中的具体功能角色，尚未通过功能性实验（如基因敲低/敲除、靶点表达或活性检测）在线虫或细胞模型中得到验证，靶点与黄芩素之间的直接作用关系、调控机制仍不明确，这也是本研究最主要的局限。其次，黄芩素在线虫体内的代谢转化及其活性代谢产物的贡献尚未明确，无法确定体内发挥抗衰老作用的具体物质形式，也难以明确黄芩素的体内量效关系。再次，本研究仅采用无脊椎动物（秀丽隐杆线虫）和体外细胞（HaCaT细胞）模型，未涉及哺乳动物衰老模型，研究结果向哺乳动物及临床应用的转化存在不足，无法充分验证黄芩素在体内的安全性和有效性。最后，本研究对黄芩素调控衰老相关通路的具体分子机制探究较浅，未深入分析各靶点、通路之间的相互作用关系，难以完整阐释黄芩素多靶点、多通路的抗衰老机制。

基于本研究结果及存在的局限性，未来研究将重点围绕黄芩素抗衰老相关内容展开，以弥补现有不足、完善研究体系。首先，通过基因沉默、过表达等技术验证ESR1、SIRT1等核心靶点的具体作用，明确其与黄芩素的结合关系及调控机制；其次，探究黄芩素在生物体内的吸收、分布、代谢、排泄特征，确定其体内活性代谢产物及有效作用浓度；同时，构建哺乳动物衰老模型，系统评价其体内抗衰老效果与生物安全性，推动研究成果向实际应用转化；此外，深入分析各靶点与通路的相互作用，明确其多靶点多通路调控的核心机制，并结合其缓解皮肤光老化的结果，开展功能性化妆品相关应用研究。

综上所述，本研究结果提供了黄芩素在秀丽隐杆线虫和HaCaT细胞中具有抗衰老相关活性的系统性证据，并通过网络药理学初步预测了其潜在作用靶点与通路。研究结果为后续开展黄芩素抗衰老机制的深入探索（如靶点验证、动物实验）提供了数据支持与研究方向，也为黄芩素在皮肤抗衰、功能性产品开发等领域的应用提供了理论与实验参考。

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