二甲双胍经SIRT1/HMGB1通路改善LPS诱导的小鼠小胶质细胞炎症反应

Metformin attenuates LPS⁃induced inflammatory response in mouse microglia via the SIRT1/HMGB1 pathway

摘要

目的 探讨二甲双胍（MET）对脂多糖（LPS）诱导的小鼠小胶质细胞炎症反应的影响及机制。 方法 体外培养小胶质细胞（BV2细胞），分为CON组、LPS组、L-MET组、M-MET组、H-MET组及H-MET+EX527（SIRT1特异性抑制剂）组。CON组细胞不做处理；LPS组以终浓度1 μg/mL LPS孵育24 h；各MET组分别以0.25，1，4 μmol/L二甲双胍孵育12 h，再用LPS刺激24 h；H-MET+EX527组先以50 μmol/L EX527预处理1 h，之后加入4 μmol/L MET孵育12 h再用LPS刺激24 h。CCK-8法检测细胞活力；Griess法检测NO释放量；RT-qPCR和Western blot检测SIRT1、HMGB1、TLR4和NF-κB的mRNA与蛋白表达水平；同时以BV2细胞条件培养基与小鼠神经元细胞（HT22细胞）共培养系统作为实验模型，测定HT22细胞活力以评估MET的间接神经保护作用。 结果 与CON组相比，LPS组NO释放量明显增加（P<0.01），SIRT1表达显著降低（P<0.05），HMGB1、TLR4、NF-κB表达升高（P<0.05），共培养条件下，HT22细胞活力显著下降（P<0.05）。与LPS组相比，各MET组的SIRT1表达均显著升高（P<0.05），而HMGB1、TLR4、NF-κB表达及NO释放均显著降低（P<0.05），且MET浓度越高，作用效果越明显；同时，神经元HT22细胞活力显著提升（P<0.05）。与H-MET组相比，H-MET+EX527组SIRT1表达降低（P<0.05），HMGB1、TLR4、NF-κB表达、NO释放升高（P<0.05），神经元HT22细胞活力回落（P<0.05）。 结论 二甲双胍可能通过调控SIRT1/HMGB1信号传导通路，抑制LPS诱导的BV2细胞活化，从而减轻神经炎症反应。

Abstract

Objective To investigate the effect of metformin（MET） on the inflammatory response induced by lipopolysaccharide（LPS） in mouse microglia（BV2 cells） and explore its underlying mechanism. Methods BV2 cells were cultured in vitro and divided into six groups： CON group， LPS group， L-MET group， M-MET group， H-MET group and H-MET+EX527（a specific SIRT1 inhibitor） group. Cells in CON group were not treated. Cells in LPS group were exposed to LPS at a final concentration of 1 μg/mL for 24 h. Cells in MET groups were incubated with metformin at 0.25， 1 and 4 μmol/L for 12 h， respectively， and then stimulated with LPS for 24 h. Cells in H-MET+EX527 group were pretreated with 50 μmol/L EX527 for 1 h， then incubated with 4 μmol/L MET for 12 h， and then stimulated with LPS for 24 h. CCK-8 method was used to assess cell viability， Griess method was used to measure nitric oxide（NO） release， and RT-qPCR and Western blot were employed to detect the mRNA and protein expression levels of SIRT1， HMGB1， TLR4 and NF-κB. Simultaneously， a co-culture system of BV2 cell-conditioned medium and mouse neuronal cells（HT22 cells） was used as an experimental model， and the viability of HT22 cells was measured to evaluate the indirect neuroprotective effect of MET. Results Compared with CON group， NO release increased in LPS group（P<0.01）， SIRT1 expression was down-regulated（P<0.05）， and expressions of HMGB1， TLR4， and NF-κB were up-regulated（P<0.05）， and viability of HT22 cells decreased under co-culture conditions（P<0.05）. Compared with the LPS group， SIRT1 expression was significantly increased in all MET groups（P<0.05）， whereas the expressions of HMGB1， TLR4 and NF-κB， as well as NO release， were significantly decreased（P<0.05）， with the effects becoming more pronounced at higher MET concentrations. Meanwhile， the viability of HT22 neurons was significantly enhanced（P<0.05）. Compared with the H-MET group， the H-MET+EX527 group showed decreased SIRT1 expression（P<0.05）， elevated expressions of HMGB1， TLR4 and NF-κB， and increased NO release（P<0.05）， along with a decline in HT22 cell viability back to lower levels（P<0.05）. Conclusion Metformin may inhibit LPS-induced BV2 microglial activation and significantly alleviate neuroinflammatory responses through regulation of the SIRT1/HMGB1 signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

二甲双胍 / 神经炎症 / 小胶质细胞 / 脂多糖 / SIRT1/HMGB1信号通路

Key words

metformin / neuroinflammation / microglia / lipopolysaccharide / SIRT1/HMGB1 signaling pathway

神经炎症是帕金森病等多种神经系统疾病发生发展的重要病理环节，主要表现为小胶质细胞的过度活化、活性氧（ROS）的大量生成及促炎细胞因子的异常释放^［1，2］。小胶质细胞是中枢神经系统（central nervous system，CNS）内的常驻免疫细胞，静息状态下参与维持神经微环境稳态；受到脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激后可向促炎表型转化，释放TNF-α、IL-1β等炎症介质并放大炎症反应^［3-5］。因此，抑制小胶质细胞过度活化是减轻神经炎症、发挥神经保护作用重要途径。

二甲双胍（metformin，MET）是2型糖尿病的一线治疗药物，近年来被证实具有广谱抗炎活性^［6］。已有研究表明，MET可通过激活单磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）激活的蛋白激酶（AMPK）信号通路，抑制核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）促炎通路异常激活，减少炎症因子释放及活性氧生成；也可通过上调微小RNA-146a（miR-146a）并下调肿瘤坏死因子受体相关因子6（TNF receptor-associated factor 6，TRAF6）、白细胞介素-1受体相关激酶（interleukin-1 receptor-associated kinase，IRAK）和p65等炎症相关分子发挥炎症调控作用^［7，8］。然而，MET对小胶质细胞介导的神经炎症反应及其具体分子机制仍需进一步阐明。

小胶质细胞炎症反应受多条信号通路共同调控，其中高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1 protein，HMGB1）、Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）及NF-κB通路是促进神经炎症发生发展的重要信号轴^［9-15］。沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，SIRT1）可通过去乙酰化调控HMGB1的胞外释放，已有研究表明激活SIRT1能够抑制LPS诱导的小胶质细胞HMGB1释放并减轻炎症反应^{［16，17］}。据此，本研究拟以LPS诱导的BV2小胶质细胞炎症模型为基础，观察不同浓度MET对细胞活力、NO释放及SIRT1、HMGB1、TLR4、NF-κB表达的影响，并结合SIRT1抑制剂EX527和BV2细胞条件培养基-HT22细胞共培养体系，探讨MET是否通过调节SIRT1/HMGB1通路从而抑制LPS诱导的小胶质细胞炎症反应，并间接发挥神经元细胞保护作用。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂

小鼠小胶质细胞（BV2细胞）购自武汉大学中国典型培养物保藏中心；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；胰酶（含0.25％EDTA）、全蛋白提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；CCK-8试剂购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；反转录试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；Griess法检测试剂盒购自上海碧云天生物技术股份有限公司；RNA快速提取试剂盒购自美国聚合物标准品有限公司；HRP标记兔抗小鼠二抗购自美国Abcam公司；抗体GAPDH、HRP标记山羊抗兔二抗购自美国Zenbio公司；抗体SIRT1、HMGB1、NF-κB购自美国MCE公司；抗体TLR4购自美国Santa Cruz公司。

1.2 细胞培养

将BV2细胞接种于培养瓶中，采用含10%胎牛血清（FBS）和青霉素-链霉素双抗的高糖DMEM培养基作为完全培养基，37 ℃、5% CO₂常规培养。

1.3 MET、LPS和EX527浓度筛选

为确定后续实验使用的药物安全浓度范围，避免细胞毒性对实验结果产生干扰，采用CCK-8法分别检测MET、LPS及EX527（SIRT1特异性抑制剂）对BV2细胞活力的影响，将对数生长期BV2细胞以2×10⁴个/mL的密度接种于96孔板（每孔100 μL），37 ℃、5% CO₂培养24 h至细胞贴壁，分别加入MET（0，0.1，1，2，4，8，16 μmol/L）、LPS（0，0.125，0.25，0.5，1，2，4 μg/mL）、EX527（0，25，50，100，200，400 μmol/L）孵育24 h，每组设3个复孔。加入CCK-8试剂10 μL，37 ℃孵育1 h，按CCK-8试剂盒说明书操作，检测不同浓度MET、LPS、EX527对BV2细胞活力的影响。

1.4 体外BV2细胞处理

将对数生长期BV2细胞以2.5×10⁵个/mL接种于24孔板（每孔400 μL）培养至贴壁，分为CON组、LPS组、L-MET组（低剂量MET）、M-MET组（中剂量MET）、H-MET组（高剂量MET）及H-MET+EX527组6组。CON组用含10%胎牛血清（FBS）和青霉素-链霉素双抗的高糖DMEM完全培养基培养；LPS组以1 μg/mL LPS直接刺激24 h；L-MET组、M-MET组和H-MET组分别以0.25，1，4 μmol/L MET预处理12 h，再加入终浓度1 μg/mL的LPS刺激24 h；H-MET+EX527组先以50 μmol/L SIRT1特异性抑制剂EX527预处理1 h，然后依次加入4 μmol/L MET孵育12 h及1 μg/mL LPS刺激24 h。

1.5 Griess法检测细胞培养上清液中NO水平

将BV2细胞按照1.4中提到的分组（除H-MET+EX527组）及处理进行培养后，收集各组细胞培养上清液，按照Griess法检测试剂盒说明，测定细胞上清液中NO水平。

1.6 RT-PCR法检测SIRT1、HMGB1、TLR-4、NF-κB mRNA的表达

将BV2细胞接种于12孔板（每孔1mL），按照1.4中提到的分组（除H-MET+EX527组）及处理进行培养后，收取各组细胞沉淀，用RNA快速提取试剂盒提取总RNA。以总RNA为模板，逆转录法合成cDNA，用SYBR Green荧光染料法进行实时定量PCR，以GAPDH作为内参基因校正样本间差异，每个样品设置3个复孔。PCR扩增条件为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共40个循环。采用2⁻ ^ΔΔCt 法计算各目标基因的相对表达量。引物序列见表1。

1.7 Western Blot法检测SIRT1、HMGB1、TLR-4、NF-κB蛋白的表达

将BV2细胞接种于6孔板（每孔2mL），按照1.4中提到的分组及处理进行培养后，收取各组细胞沉淀，用预冷PBS洗2次，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液提取总蛋白。BCA法定量蛋白，100 ℃加热10 min变性。10%SDS-PAGE凝胶120 V恒压电泳55 min，200 mA恒流半干转90 min至PVDF膜。TBST洗膜3次，5%脱脂奶粉室温封闭1 h。分别加入一抗GAPDH（1∶1 000）、SIRT1（1∶1 000）、HMGB1（1∶1 000）、TLR4（1∶1 000）、NF-κB（1∶500），4 ℃孵育过夜，TBST洗3次，加HRP标记二抗（1∶10 000）37 ℃孵育1 h。TBST洗后滴加ECL显影液，成像系统采集条带，Image J测定各样品蛋白相对表达量。

1.8 统计学分析

计量资料以均数±标准差（X±S）表示，实验数据均采用GraphPad Prism 9.0软件进行统计处理与图表绘制。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），进一步两组间比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度MET、LPS、EX527的筛选结果

MET浓度筛选结果显示，0~8 μmol/L浓度范围内的MET对BV2细胞存活率无明显影响；当MET浓度升高至16 μmol/L时，细胞增殖受到抑制（P<0.05）。LPS浓度筛选结果显示，0~2 μg/mL LPS作用后，BV2细胞活力无明显变化，未表现出明显细胞毒性；而4 μg/mL LPS可抑制细胞增殖（P<0.05）。EX527浓度筛选结果显示，0~100 μmol/L EX527对BV2细胞活力无明显影响，无明显细胞毒性；当EX527浓度达到200，400 μmol/L时，细胞增殖被显著抑制（P<0.01，见图1）。因此，本研究选取0.25，1，4 μmol/L MET，1 μg/mL LPS，50 μmol/L EX527作为后续研究的药物浓度。

2.2 MET对LPS诱导的BV2细胞形态学改变和NO释放的影响

在高倍显微镜下观察到CON组BV2细胞呈梭形，胞体较小，突起较少，为静息状态特征；LPS组BV2细胞则呈现明显活化形态，胞体增大，突起增多；而L-MET组、M-MET组和H-MET组BV2细胞活化形态均有不同程度改善，表现为胞体缩小、突起减少（见图2）。

NO定量结果进一步表明，与CON组相比，LPS组NO水平显著升高，差异具有统计学意义（P<0.01）；与LPS组相比，H-MET组细胞上清中NO水平显著降低，差异具有统计学意义（P<0.01），而L-MET组和M-MET组与LPS组相比差异无统计学意义。

2.3 MET对LPS诱导的BV2细胞SIRT1/HMGB1通路的影响

与CON组相比，LPS组BV2细胞中HMGB1、TLR4、NF-κB的mRNA及蛋白表达均显著上调（P<0.05），而SIRT1的mRNA及蛋白表达显著下调（P<0.05，见图3、图4）。

与LPS组相比，L-MET组、M-MET组和H-MET组BV2细胞HMGB1、TLR4、NF-κB的mRNA及蛋白表达显著减少（P<0.05），M-MET和H-MET组SIRT1表达显著增加（P<0.05，见图3、图4），表明MET预处理可部分逆转LPS诱导的上述变化。

2.4 SIRT1预抑制后MET对SIRT1/HMGB1/TLR4/NF-κB通路相关蛋白表达的影响

与LPS组相比，L-MET组、M-MET组和H-MET组BV2细胞HMGB1、TLR4、NF-κB的蛋白表达显著减少（P<0.05），SIRT1表达显著增加（P<0.05，见图5）。而采用SIRT1特异性抑制剂EX527干预BV2细胞后结果显示：与H-MET组相比，H-MET+EX527组HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表达均不同程度升高（P<0.01），SIRT1蛋白表达降低（P<0.01，见图5），提示EX527可削弱MET对SIRT1/HMGB1/TLR4/NF-κB相关蛋白表达的调节作用。

2.5 MET对神经炎症反应下HT22细胞的保护作用

CCK-8结果显示，与CON组相比，LPS组HT22细胞活力显著降低（P<0.01）；与LPS组相比，M-MET组和H-MET组HT22细胞活力显著提升（P<0.05）；与H-MET组相比，H-MET+EX527组HT22细胞活力明显下降（P<0.05，见图6），表明MET的神经保护效应被阻断。

3 讨论

小胶质细胞是中枢神经系统重要的免疫效应细胞，其过度活化介导的神经炎症是阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病发生发展的共同病理特征。LPS刺激可诱导小胶质细胞由静息状态转向促炎活化状态，释放NO及多种炎症介质，进而放大炎症级联反应并加重神经元损伤^{［18，19］}。因此，寻找能够抑制小胶质细胞异常活化、减轻炎症反应并保护神经元的药物，对于神经炎症相关疾病的防治具有重要意义。本研究以LPS诱导的BV2小胶质细胞炎症模型为基础，并结合BV2细胞条件培养基与HT22神经元共培养体系，系统观察MET对小胶质细胞炎症反应及间接神经保护作用的影响，为阐明MET的中枢抗炎作用提供了实验依据。

MET作为2型糖尿病的一线治疗药物，近年来被发现具有调节炎症和保护中枢神经系统的潜在作用^［6］。González等^［20］发现，MET可通过减轻神经炎症、调节小胶质细胞自噬改善糖尿病患者的认知功能；Jin等^［21］证实，MET能够以AMPK依赖性方式抑制核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）相关炎性小体活化及小胶质细胞的激活，发挥神经保护作用；Horiuchi等^［22］报道，MET可直接结合HMGB1蛋白的酸性结构域，抑制LPS激活的BV2小胶质细胞促炎因子释放。与上述研究结果一致，本研究发现LPS刺激后BV2细胞呈明显活化状态，NO释放显著增加，而MET预处理可改善细胞活化形态并降低NO水平，提示MET能够有效抑制LPS诱导的小胶质细胞炎症反应。本研究进一步将这一抗炎效应与SIRT1/HMGB1通路联系起来，使MET抑制小胶质细胞炎症反应的分子机制更加明确。SIRT1是一种依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD⁺）的组蛋白去乙酰化酶，可通过调控靶蛋白乙酰化状态参与炎症、细胞存活和衰老等过程^{［23，24］}。HMGB1作为重要的炎症放大因子，释放至胞外后可结合TLR4并激活NF-κB通路，形成HMGB1/TLR4/NF-κB炎症信号轴，从而促进炎症因子表达和炎症反应持续放大^［8-19］。既往研究提示，LPS可诱导小胶质细胞HMGB1乙酰化及胞外释放，而激活SIRT1能够增强HMGB1去乙酰化并抑制炎症级联反应^{［25，26］}。本研究结果提示，LPS刺激显著下调BV2细胞SIRT1 mRNA及蛋白表达，同时上调HMGB1、TLR4和NF-κB表达；MET预处理可上调SIRT1并抑制HMGB1/TLR4/NF-κB通路相关分子表达。进一步采用SIRT1特异性抑制剂EX527后，MET对HMGB1、TLR4和NF-κB的抑制作用被明显逆转，说明SIRT1激活是MET发挥抗炎作用的重要环节。由此推测，MET可能是通过上调SIRT1，抑制HMGB1介导的TLR4/NF-κB信号激活，从而阻断LPS诱导的小胶质细胞炎症放大过程。

本研究中还从小胶质细胞-神经元相互作用角度验证了MET的间接神经保护作用。结果显示，LPS活化的BV2细胞条件培养基可显著降低HT22神经元细胞活力，而MET预处理BV2细胞后，其条件培养基对HT22细胞活力的损伤作用明显减弱；加入EX527后，MET的保护效应被削弱。这种“间接保护”模式凸显了在治疗神经退行性疾病时，靶向调控小胶质细胞功能的重要性，而非直接干预神经元本身。HMGB1作为关键的炎症放大器，其被有效抑制可能在这一间接保护中扮演了重要角色。近年来研究也证实，调控小胶质细胞M1/M2极化平衡，使其从促炎的M1表型向抗炎、具有修复功能的M2表型转换，是治疗神经炎症性疾病的重要策略^{［27，28］}。本研究虽未直接检测BV2细胞M1/M2表型标志物，但MET所诱导的炎症因子下降和形态学恢复，提示其可能促进了小胶质细胞向更有利于神经保护的状态转化。

本研究仍存在一定局限性。首先，本研究主要采用BV2细胞及HT22细胞体外模型，尚不能完全模拟体内复杂的神经免疫微环境，MET在动物模型中的抗神经炎症作用及安全有效剂量仍需进一步验证。其次，本研究主要检测了SIRT1、HMGB1、TLR4和NF-κB的表达变化，尚未直接检测HMGB1乙酰化水平、胞核/胞质转位及胞外释放情况，也未进一步区分NF-κB活化状态和下游炎症因子谱。今后研究可建立神经炎症或神经退行性疾病动物模型，验证MET在体内对小胶质细胞活化、神经元损伤及行为学改变的影响；并进一步检测HMGB1乙酰化、核质转位及胞外释放，并结合SIRT1过表达或沉默实验，明确MET调控SIRT1/HMGB1/TLR4/NF-κB通路的因果关系。

综上所述，本研究表明MET可通过激活SIRT1并抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信号减轻LPS诱导的BV2小胶质细胞炎症反应，并间接提高HT22神经元细胞活力，为MET用于神经炎症干预提供了实验依据。

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基金资助

陕西省重点研发计划项目(2025SF-YBXM-323)

陕西省重点研发计划项目(2023-YBSF-178)

国家级大学生创新训练计划项目(S202310698207)