circR⁃6041对阴道润滑障碍的影响及其机制

Effect of circR⁃6041 on vaginal lubrication disorder and its underlying mechanism

摘要

目的 基于MAPK/ERK信号通路探索circR-6041在阴道上皮功能障碍中的作用机制。 方法 建立circR-6041过表达的VK2/E6E7细胞模型，采用划痕实验、Transwell实验和CCK-8检测细胞迁移和增殖能力。转录组测序分析circR-6041过表达后差异表达基因（DEGs），KEGG富集分析DEGs的富集通路，采用Western blot检测MAPK/ERK信号通路关键蛋白的表达水平。 结果 过表达circR-6041显著增强VK2/E6E7细胞迁移能力（P<0.05），但不影响增殖（P>0.05）。转录组和KEGG富集分析显示，circR-6041过表达组与对照组的差异基因显著富集于MAPK、PI3K-Akt等信号通路以及细胞外基质、紧密连接等细胞组分。Western blot结果显示，过表达circR-6041后，p-MEK1和p-ERK1/2蛋白表达增加（P<0.05），而总蛋白水平无明显变化，p-MEK1/MEK1和p-ERK1/2/ERK1/2比值升高（P<0.05）。 结论 circR-6041在阴道润滑障碍（LD）患者阴道上皮中表达上调，可能通过激活MAPK/ERK信号通路促进细胞迁移，参与LD的病理过程。

Abstract

Objective To investigate the role and mechanism of circR-6041 in vaginal epithelial dysfunction based on the MAPK/ERK signaling pathway. Methods A VK2/E6E7 cell model overexpressing circR-6041 was established. Cell migration， invasion， and proliferation capabilities were assessed using wound healing assay， Transwell assay， and CCK-8 assay， respectively. Differentially expressed genes（DEGs） were screened after circR-6041 overexpression by transcriptomic sequencing（RNA-seq）， and DEGs were analyzed by KEGG. Western blot was employed to detect the expressions of key proteins in the MAPK/ERK signaling pathway. Results Overexpression of circR-6041 significantly enhanced the migration ability of VK2/E6E7 cells（P<0.05）， but did not affect the proliferation（P>0.05）. Transcriptomic and KEGG enrichment analyses revealed that DEGs between circR-6041 overexpression group and control group were significantly enriched in signaling pathways such as MAPK and PI3K-Akt， and cellular components such as extracellular matrix（ECM） and tight junctions. Western blot results demonstrated that circR-6041 overexpression up-regulated the protein expressions of p-MEK1 and p-ERK1/2（P<0.05）， total protein levels remained unchanged， and the ratios of p-MEK1/MEK1 and p-ERK1/2/ERK1/2 significantly increased（P<0.05）. Conclusion circR-6041 is up-regulated in the vaginal epithelium of patients with lubrication disorders（LD）， and circR-6041 can participate in the pathological process of LD by promoting cell migration via the activation of MAPK/ERK signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

circR-6041 / 阴道润滑障碍 / 细胞迁移 / MAPK3/ERK信号通路 / 阴道上皮细胞 / 环状RNA

Key words

circR-6041 / vaginal lubrication disorders / cell migration / MAPK3/ERK signaling pathway / vaginal epithelial cells / circular RNA

女性性功能障碍（female sexual dysfunction， FSD）全球发生率达25%~63%，在我国约为37.6%^［1］，其中阴道润滑障碍（lubrication disorders，LD）是最常见的类型，占比高达97.9%^［2］。其生理机制主要涉及性刺激下阴道血管内皮功能和阴道上皮层的完整性。现有研究多聚焦于内分泌紊乱等引起血管内皮血流动力学改变及黏膜下毛细血管液体渗出，及宫颈、腺体分泌黏液的过程^［3，4］，但是对阴道上皮层的主动作用认识不足。阴道上皮由基底层、上基底层和角化层组成，是一种复层扁平上皮。阴道上皮作为液体渗出的最终通道，其结构与功能的完整性直接影响润滑效率。在正常生理状态下，上皮细胞的适度迁移是维持上皮组织结构重塑及细胞间连接动态平衡的关键过程^［5，6］。值得注意的是，细胞迁移需维持在适度水平，若细胞迁移异常，则可能引起上皮细胞结构紊乱、细胞-细胞连接破坏^［7，8］，进而干扰上皮屏障功能和血管通透性调节。这表明，阴道上皮细胞迁移能力的改变可能是导致组织屏障功能异常和润滑障碍的重要病理基础。因此，探讨阴道上皮细胞迁移的调控机制，对于理解LD的发病机制具有重要意义。

环状RNA（circRNA）因闭环结构具有高度稳定性，可通过miRNA海绵机制^［9-13］或与蛋白质结合^［14］调节基因表达。现有研究发现，circRNA在组织发育、细胞迁移及细胞外基质重塑中发挥重要调控作用^［15-17］，值得注意的是，circRNA的失调可导致细胞迁移异常，可引起上皮完整性破坏和组织屏障功能障碍，进而参与先兆子痫^［18］、肺纤维化^［19］等疾病的发生发展。前期我们通过高通量测序对LD患者阴道上皮组织中的circRNA表达谱进行分析，发现circR-6041在LD患者中显著上调^［20］，并且生物信息学分析显示circR-6041与MAPK/ERK信号通路富集相关，而该通路在上皮细胞迁移调控中发挥重要作用^［21］。这些结果提示circR-6041可能参与LD的病理过程。

为深入探究circR-6041在LD中的生物学功能，本研究建立了circR-6041过表达的VK2/E6E7细胞模型，通过体外功能实验探讨circR-6041对阴道上皮细胞迁移及MAPK/ERK通路的影响及机制，为未来开发基于上皮细胞的LD治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

1.1.1 主要试剂与材料

永生化人阴道上皮细胞VK2/E67（货号：GNHu75）购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。Keratinocyte-SFM培养基（货号：17005042）、0.25%胰蛋白酶-EDTA（货号：25200114）均购自Gibco公司。TRIzol试剂（Invitrogen， 15596026CN）；RNeasy Mini试剂盒（Qiagen， 74104）；RNase-free DNaseⅠ、HiScript Ⅱ Q RT SuperMix、SYBR Green染料（均为Vazyme 公司，货号分别为：EN401、R223-01、Q321-02）；RNase R（MCE， HY-KE7055）。慢病毒载体LV5-circR-6041为Genepharma公司定制生产；聚布雷烯（Polybrene，货号：HY-112735）、嘌呤霉素（Puromycin，货号：HY-B1743）均购自MCE公司；Transwell小室（8 μm）（BD，354480）；Matrigel基质胶（BD，356234）；CCK-8试剂盒（碧云天，C0038）；4%多聚甲醛（PFA）、0.1%结晶紫染色液均购自Solarbio公司。RIPA裂解液（货号：P0013B）、BCA蛋白定量试剂盒（货号：P0398S）、ECL化学发光试剂（货号：P0018S）均购自碧云天公司；PVDF膜（Roche，3010400001）。抗体MEK1（#9124）、ERK1/2（#9102）、p-MEK1（#2338）、p-ERK1/2（#4370）、GAPDH（#2118）均购自Cell Signaling Technology（CST）公司；HRP标记羊抗兔IgG购自Abcam公司（ab205718）。

1.1.2 主要实验仪器

实时荧光定量PCR仪（ABI 7500，美国Thermo Fisher Scientific公司）；多功能酶标仪（Infinite 200 Pro，瑞士Tecan公司）；倒置荧光显微镜（IX71，日本Olympus公司）；化学发光成像采集系统（T5200，Tano公司）。

1.2 VK2细胞培养

永生化人阴道上皮细胞VK2/E6E7是由HPV-16 E6和E7基因转染正常阴道上皮细胞建立。将VK2/E6E7细胞在Keratinocyte-SFM培养基（含10% FBS和2%青霉素-链霉素）中培养，37 ℃、5% CO₂条件下常规培养。当细胞融合度达80%~90%时，用0.25%胰蛋白酶-EDTA进行传代。所有实验使用对数生长期细胞。

1.3 RNA提取及RT-qPCR分析

收集对数生长期VK2/E6E7细胞，采用TRIzol试剂与RNeasy Mini试剂盒联合提取总RNA，并使用RNase-free DNase I去除基因组DNA污染。为验证circRNA的环状结构，取部分总RNA与RNase R（3 U）混合，于37 ℃孵育30 min进行消化处理。随后，利用HiScript Ⅱ Q RT SuperMix试剂盒将1 μg总RNA（含RNase R处理组与未处理对照组）逆转录合成cDNA。RT-qPCR在Applied Biosystems ViiA 7系统上进行，采用SYBR Green染料法。针对目标circRNA hsa_circ_0001485（来源于MAP3K1基因，Chr5：56，864，733-56，865，977），设计特异性跨越反向剪接位点（BSJ）的发散引物进行扩增。PCR反应程序设定为：95 ℃ 10 min；随后95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，共40个循环；反应结束后进行60~95 ℃熔解曲线分析。以GAPDH为内参基因，采用2^-ΔΔCt 法计算相对表达量。PCR产物经Sanger测序确认反向剪接位点序列。RNase R消化实验结果表明，目标circRNA在消化后的保留率>80%，而线性RNA降解显著（残留<20%），充分证实了该RNA分子的环状结构特征。

1.4 circR-6041慢病毒载体构建与细胞转染

过表达慢病毒载体LV5-circR-6041含circR-6041全长环化序列及侧翼Alu重复序列。病毒滴度为10⁸~10⁹ TU/mL。VK2/E6E7细胞以5×10⁴细胞/孔接种，用MOI=20的慢病毒感染（含Polybrene），更换培养基后用2 μg/mL嘌呤霉素筛选7~10 d获得稳定细胞株。实验分为过表达组（OE）和空载体对照组（NC）。通过GFP荧光显微镜观察评估转染效率（≥80%）。

1.5 转录组测序数据获取与生物信息学分析

本研究引用的前期转录组测序数据^［20］来源于对6例LD患者及6例正常对照阴道上皮组织的检测。对测序得到的原始数据（Raw Data）进行如下生物信息学分析：首先，使用FastQC软件进行质控，并利用Trimmomatic剔除接头及低质量Reads获取有效数据（Clean Data）。采用HISAT2软件将Clean Data比对至参考基因组。利用featureCounts对基因表达量进行定量。最后，使用DESeq2 R包进行差异表达基因（DEGs）筛选，筛选标准设定为：|log₂（fold change，FC）|>1且P<0.05。

1.6 差异表达分析

基因表达丰度采用RSEM软件（v1.3.3）进行定量，表达水平以TPM（transcripts per million）值表示。使用DESeq 2软件包（v1.34.0）基于负二项分布模型鉴定circR-6041过表达组（OE）与空载体对照组（NC）之间DEGs。筛选标准为：|log₂FC|≥1且FDR≤0.05（Benjamini-Hochberg校正）。采用ggplot2包绘制火山图，pheatmap包绘制DEGs表达谱层次聚类热图。

1.7 差异基因的功能富集分析

使用clusterProfiler包（v4.2.0）进行GO和KEGG富集分析。采用超几何检验，Benjamini-Hochberg法校正，P_adjusted<0.05为显著性阈值。对转录组DEGs、circR-6041过表达细胞DEGs及circRNA宿主基因分别进行分析，展示前25个显著富集条目。

1.8 划痕实验检测细胞迁移能力

将稳定转染的VK2/E6E7细胞（OE组和NC组）以（2~5）×10⁵细胞/孔接种于12孔板，培养至90%~95%融合度。用无菌枪头垂直划出直线，PBS洗涤后加入无血清培养基。在0，2，4，6 h于倒置显微镜下拍照。使用Image J软件测量划痕宽度，计算划痕愈合率［=（初始划痕面积-指定时间点划痕面积）/初始划痕面积×100%］。

1.9 Transwell法检测细胞迁移能力

采用24孔Transwell小室（8 μm孔径）进行细胞迁移实验。将转染后的细胞（OE或NC）重悬于无血清培养基中，接种1×10⁴个至未包被Matrigel的上室内，下室加入含10% FBS的培养基作为化学引诱剂。37 ℃培养24 h后，用棉签轻轻擦除上室未迁移的细胞，4%多聚甲醛（PFA）固定，0.1%结晶紫染色。于显微镜下随机选取5~10个视野，使用ImageJ软件计数穿膜的迁移细胞数量，每组设3个复孔。

1.10 CCK-8实验检测细胞增殖能力

稳定转染的VK2/E6E7细胞（OE组和NC组）以5×10³细胞/孔接种于96孔板。在37 ℃、5% CO₂培养0，24，48，72，96 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育2 h。使用酶标仪检测450 nm波长吸光度值（OD₄₅₀），绘制细胞生长曲线。

1.11 Western blot检测MAPK/ERK信号通路蛋白表达

RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法定量。30 μg蛋白经10% SDS-PAGE分离，转至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭后，加入一抗（MEK1、ERK1/2、p-MEK1、p-ERK1/2、GAPDH，均按1∶1 000稀释）4 ℃孵育过夜，二抗（HRP标记的山羊抗兔IgG，1∶1 000稀释）室温孵育1 h。ECL显影，化学发光成像系统采集，ImageJ分析灰度值。

1.12 统计分析

采用GraphPad Prism 6.0进行统计分析。对计量资料进行Shapiro-Wilk检验，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（X±S）表示，组间差异分析采用Student t检验（方差齐）或Welch t检验（方差不齐）；不符合正态分布的计量资料以中位数和四分位数间距［M（P₂₅，P₇₅）］表示，组间比较采用非参数检验（Mann-Whitney U检验）。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 circR-6041过表达细胞模型的构建与验证

qRT-PCR结果显示，与NC组相比，OE组circR-6041的相对表达量显著上调（P<0.001，见图1）。证实circR-6041过表达细胞模型构建成功，可用于后续功能与机制研究。

2.2 circR-6041过表达对VK2/E6E7细胞增殖的影响

CCK-8法结果显示，OE组和NC组细胞OD_{450 nm}值均随培养时间增加而上升，但两组间各时间点细胞活力均无显著差异（P>0.05，见图2）。证实circR-6041过表达不影响VK2/E6E7细胞增殖。

2.3 circR-6041过表达促进VK2/E6E7细胞迁移

划痕实验和Transwell迁移实验结果显示，OE组细胞划痕闭合速度和Transwell迁移细胞数均显著高于NC组（P<0.05，见图3），表明circR-6041过表达能够显著促进阴道上皮细胞迁移。

2.4 转录组测序与通路富集分析

转录组分析显示OE组与NC组的DEGs涉及多个功能类别。KEGG富集分析表明差异基因显著富集于MAPK、PI3K-Akt、Ras等信号通路（见图4），GO分析揭示其在转录因子活性、细胞外基质、紧密连接和转录调控中富集（见图5）。综上提示circR-6041通过MAPK/ERK通路调控细胞迁移。基于此，后续采用细胞功能实验和Western blot检测MAPK关键分子（MEK1、ERK1/2）的表达和磷酸化水平进行验证。

2.5 circR-6041过表达激活MAPK/ERK信号通路关键蛋白的验证

Western blot检测结果显示，OE组与NC组间MEK1和ERK1/2总蛋白表达无差异（P>0.05），但OE组p-MEK1和p-ERK1/2蛋白含量显著升高（P<0.05），p-MEK1/MEK1和p-ERK1/2/ERK1/2比值也显著升高（P<0.05，见图6）。提示circR-6041可能通过激活MAPK/ERK信号通路促进阴道上皮细胞迁移。

3 讨论

LD作为FSD中最常见的类型，其发病机制尚未完全阐明，严重制约临床诊疗水平的提升。既往对LD发病机制的研究多局限于激素水平或神经血管因素等方面的讨论，本团队前期通过circRNA高通量测序发现，circR-6041在LD患者阴道上皮组织中显著上调^［20］，提示circR-6041可能参与LD的病理进程。为了探究circR-6041对LD发病机制的影响，本研究利用目前阴道上皮相关研究中被广泛应用的体外模型VK2/E6E7细胞，通过划痕实验与Transwell实验研究过表达circR-6041对VK2/E6E7细胞的迁移能力的影响，结果显示，过表达circR-6041显著增强VK2/E6E7细胞的迁移能力，而CCK-8实验结果显示其对细胞增殖无明显影响，证实其促迁移作用的特异性。正常生理状态下，阴道润滑主要依赖于性刺激时黏膜下层毛细血管液体通过上皮层渗出^［3，4］。阴道上皮的完整性是实现液体渗出的结构基础，故我们推测上皮细胞的异常迁移可能参与了阴道黏膜屏障的病理性重构，从而在一定程度上干扰了正常的液体渗出过程。

MAPK/ERK信号通路是调控细胞增殖、分化、迁移和凋亡的关键通路之一^{［21，22］}，通路激活的关键标志是MEK1和ERK1/2的磷酸化增强^［23］，该通路在肿瘤侵袭、组织修复等领域的促迁移作用已有广泛报道。本研究结果显示，过表达circR-6041的VK2/E6E7细胞的差异基因显著富集于MAPK信号通路等经典信号转导通路。Western blot结果显示，circR-6041过表达显著提高了p-MEK1和p-ERK1/2的水平，而MEK1和ERK1/2总蛋白水平无显著变化，证实circR-6041可能通过促进MEK1和ERK1/2磷酸化激活MAPK/ERK信号通路。已有研究表明ERK1/2磷酸化后激活下游转录因子（如c-Fos、c-Jun），进而调控基质金属蛋白酶（MMPs）、整合素等迁移相关基因的表达^{［24，25］}。该通路还可通过调控细胞骨架重组和细胞黏附连接等过程影响迁移能力^{［26，27］}。本研究的GO富集结果也显示，circR-6041过表达导致细胞外基质和紧密连接相关基因表达改变，这与MAPK/ERK通路下游效应一致，进一步证实了circR-6041通过激活该通路调控阴道上皮细胞迁移的机制。circR-6041调控MAPK/ERK通路的具体方式可能作为miRNA海绵或与RNA结合蛋白相互作用调控上游信号分子，这些机制有待进一步研究验证。

综上所述，本研究不仅在LD患者阴道上皮组织中发现了circR-6041的异常高表达，更重要的是近一步阐明了circR-6041通过激活MAPK/ERK信号通路增强阴道上皮细胞迁移能力的机制。这一发现明确了“circR-6041/MAPK/ERK”调控轴在LD发生过程中的关键作用，也提出了“异常circRNA介导的上皮细胞过度迁移可能是导致阴道黏膜屏障受损及组织重塑的关键驱动力”这一观点。circR-6041的高表达有望成为评估LD病理变化的潜在分子标志物，为未来开发针对性的治疗靶点提供了重要的理论依据。但本研究存在一定的局限性。首先，本文的功能验证主要依赖于VK2/E6E7这一HPV永生化细胞系，该细胞的生物学特性与原代阴道上皮细胞存在差异，可能在一定程度上影响了基因表达模式的准确性。其次，本研究尚未涉及体内动物实验，缺乏circR-6041调控对阴道组织液渗出和生理功能直接影响的在体证据。此外，本研究虽然明确了circR-6041对MAPK/ERK通路的关键激活作用，但其是否通过作为ceRNA竞争性结合特定miRNA的具体机制路径，目前尚未完全阐明。基于上述结论，后续研究将采用原代阴道上皮细胞及构建动物模型，进一步验证circR-6041在生理状态下的调控作用。同时，结合多中心临床大样本评估circR-6041在LD诊疗中的实际应用价值。在机制方面，未来将利用生物信息学预测与分子互作实验（如RIP、双荧光素酶报告实验等）深入解析circR-6041介导的ceRNA网络，以期发现更多上游调控因子和下游效应分子，从而为LD的靶向药物研发提供更坚实的基础。

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基金资助

江苏省卫生健康委医学科研项目(M2021015)