淮河沉积物来源黄柄曲霉BMC⁃28次级代谢产物分离鉴定及其抗氧化活性

Isolation， identification and antioxidant activity of secondary metabolites from Aspergillus flavipes BMC⁃28 derived from Huaihe River sediment

摘要

目的 对淮河沉积物来源真菌Aspergillus flavipes BMC⁃28的次级代谢产物进行分离鉴定，并评价其抗氧化活性。 方法 采用正反相硅胶柱等多种色谱技术分离纯化得到单体化合物。结合核磁共振（NMR）、质谱（MS）等波谱技术对化合物进行结构鉴定。运用1，1⁃Diphenyl⁃2⁃picrylhydrazyl（DPPH）法评估单体化合物体外抗氧化活性。　结果　从菌株Aspergillus flavipes BMC⁃28糙米发酵物中共分离鉴定出15个已知化合物，分别为硫赭曲菌素（1），2-（3'-羟基-4'-甲氧羰基-5'-甲基苯氧基）-4-羟基-6-甲氧基苯甲酸（2），methyl chloroasterrate（3），曲地酸（4），monomethylosoic acid（5），iizukine B（6），epicoccone（7），epicoccolide B（8），N⁃benzoylphenylalaninyl⁃N⁃benzoylphenylalaninate（9），大黄素甲醚（10），（2E，2'E）-3，3'-（6，6'-二羟基联苯-3， 3'-二基）二丙烯酸（11），auranticin A（12），2，6-二羟基-3，4-二甲基苯甲酸（13），4-甲基苔黑酚（14），4，5，6-三甲基-1，3-苯二酚（15）。其中化合物11和12为首次从Aspergillus属真菌中分离得到。体外抗氧化活性结果表明，化合物6、7和8清除DPPH自由基能力较强，半数抑制浓度（IC₅₀）在1.53~3.68 μmol/L范围内，显著优于阳性对照维生素C。构效关系分析表明，分子中多个酚羟基取代是化合物表现强抗氧化活性的重要结构特征。　结论　本研究从淮河沉积物来源真菌Aspergillus flavipes BMC⁃28中成功分离鉴定出15个已知化合物，其中，化合物6、7、8具有强抗氧化活性且显著优于维生素C，化合物11和12为该属首次报道，这为天然抗氧化先导化合物的深入研究以及后续对淡水真菌资源的开发应用提供了理论基础和科学依据。

Abstract

Objective To isolate and identify the secondary metabolites of the fungus Aspergillus flavipes BMC-28 derived from Huaihe River sediment， and evaluate their antioxidant activity. Methods The monomeric compounds were separated and purified by multiple chromatographic techniques such as normal and reversed-phase silica gel column chromatography. The structural identification of the compounds was performed by spectroscopic techniques such as nuclear magnetic resonance（NMR） and mass spectrometry（MS）. The antioxidant activities of the identified compounds were evaluated using the 1， 1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH） method. Results Fifteen known compounds were isolated and identified from the rice fermentation culture of Aspergillus flavipes BMC-28， including sulochrin（1）， 2-（3'-hydroxy-2'-（methoxycarbonyl）-5'-methylphenoxy）-4-hydroxy-6-methoxybenzoic acid（2）， methyl chloroasterrate（3）， asterric acid（4）， monomethylosoic acid（5）， iizukine B（6）， epicoccone（7）， epicoccolide B（8）， N-benzoylphenylalaninyl-N-benzoylphenylalaninate（9）， questin（10），（2E，2'E）-［6，6'-dihydroxy［1，1'-biphenyl］-3，3'-diyl］bis［prop-2-enoic acid］（11）， auranticin A（12）， 2，6-Dihydroxy-3，4-dimethylbenzoic acid（13）， 4-Methylorcinol（14）， 4，5，6-Trimethylbenzene-1，3-diol（15）. Among them， compounds 11 and 12 were isolated from the genus Aspergillus for the first time. The in vitro antioxidant experiment results revealed that compounds 6， 7 and 8 exhibited strong DPPH radical scavenging activity with half-maximal inhibitory concentration（IC₅₀） of 1.53-3.68 μmol/L， significantly superior to the positive control vitamin C. Structure-activity relationship analysis results indicated that the presence of multiple phenolic hydroxyl substitutions in the molecular structure was an important structural feature for compound to exhibit strong antioxidant activity. Conclusion Fifteen known compounds are successfully isolated and identified from Aspergillus flavipes BMC-28 derived from Huaihe River sediment， among which compounds 6， 7， and 8 possess strong antioxidant activity， significantly superior to vitamin C， and compounds 11， 12 are reported for the first time. This study provides a theoretical basis and scientific reference for the further study of natural antioxidant lead compounds and the subsequent development and utilization of freshwater fungal resources.

Graphical abstract

关键词

淮河 / 淡水真菌 / 黄柄曲霉 / 次级代谢产物 / 抗氧化活性

Key words

Huaihe River / freshwater fungi / Aspergillus flavipes / secondary metabolites / antioxidant activity

活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）是一类由氧分子代谢衍生、具有高反应活性的含氧分子^［1］，在细胞信号传导、免疫防御等过程中发挥重要作用^［2］。当ROS的产生超过抗氧化防御机制的能力时，会引起机体氧化应激反应，造成细胞膜、蛋白质、DNA、脂质的损伤，从而导致各种疾病^［3，4］。在食品方面，自由基会加速油脂酸败，使食品变质^［5］。抗氧化剂能够中和过量ROS、维持氧化还原平衡，在治疗心血管、神经退行性等疾病以及食品保鲜方面具有重要作用^［6］。然而，化学合成类抗氧化剂存在口服生物利用度低、治疗窗窄、潜在毒性等问题，因此植物、微生物来源的天然抗氧化剂成为抗氧化剂研发的重要发展方向^［7，8］。

曲霉（Aspergillus）是一种分布广泛的真菌，能够合成结构多样、活性显著的次级代谢产物。截至2022年，已从该属的发酵产物中分离鉴定出3 100余个化合物，包括生物碱、醌类、聚酮、多肽、萜类等，具有显著的抗氧化、抗菌、抗肿瘤等生物活性^［9］。例如，Yang等^［10］从深海沉积物来源的Aspergillus versicolor SH0105中分离出aspermutarubrol/violaceol-I，DPPH自由基清除率IC₅₀为34.1 μmol/L；袁媛等^［11］从海绵来源真菌Aspergillus sp. SCSIO 41018中分离出的3，4-二羟基苯乙酸、3，4-二羟基苯甲酸，DPPH自由基清除率IC₅₀分别为4.69 μg/mL、10.36 μg/mL，表现出显著抗氧化活性。因此，曲霉属真菌是开发新型天然抗氧化剂的重要微生物来源之一。

淡水真菌是指生活在淡水环境包括水体、沉积物，部分或整个生命周期依赖淡水的真菌，在淡水生态系统中发挥着驱动物质循环、维持生态平衡的功能^［12］。淡水真菌作为一类特殊生境的微生物，长期处于低营养、高渗透压的环境中，进化出了独特的代谢机制以适应环境，其产生的次级代谢产物往往结构新颖、活性显著^［13］。例如：Ebada等^［14］从淡水沉积物来源的Penicillium sp. S1a1中分离出新型去氢萘型聚酮类化合物tanzawaic acid Z₁，DPPH自由基清除的IC₅₀为2.8 μmol/L，活性优于阳性对照槲皮素。

淮河作为我国重要的淡水生态系统之一，其生境复杂、地域特色鲜明，蕴含着丰富且独特的真菌资源，但迄今为止，针对淮河流域Aspergillus flavipes真菌次级代谢产物的系统研究仍较为匮乏。为此，本研究以淮河沉积物来源真菌Aspergillus flavipes BMC-28为研究对象，拟采用多种色谱分离技术对其次级代谢产物进行系统的分离纯化，结合核磁共振（NMR）、质谱（MS）等波谱学方法鉴定化合物结构，并运用DPPH法评价单体化合物的体外抗氧化活性，从而寻找具有显著抗氧化活性的天然产物，为天然抗氧化剂的开发应用提供候选，同时为淮河流域淡水真菌资源的深度利用奠定科学基础。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

糙米（五常市兴旺米业有限公司）；乙腈、甲醇（色谱级，安徽天地高纯溶剂有限公司）；石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇（分析纯，上海泰坦科技股份有限公司）；三氟乙酸（分析纯，上海麦克林生化科技股份有限公司）；氘代二甲基亚砜（DMSO-d₆ ）、氘代氯仿（上海泰坦科技有限公司）；MH肉汤（青岛高科技工业园海博生物技术有限公司）；DPPH（上海泰坦科技股份有限公司）；维生素C（上海泰坦科技股份有限公司）；柱层析硅胶（200~300目，青岛海洋化工厂分厂）。

蒸汽灭菌锅（SW-CJ-2FD，江苏苏净集团有限公司）；高效液相色谱仪（SPD-16，日本SHIMADZU公司）；半制备高效液相色谱仪（Waters2535，Waters科技有限公司）；手提紫外灯（WFP-204B，上海驰唐实业有限公司）；冷冻干燥机（Alpha 2-4 LDplus，德国CHRIST公司）；核磁共振波谱仪（Bruker-DRX500，德国Bruker公司），生化培养箱（SPX-150B-Z，上海博讯实业有限公司），超净工作台（苏州市志达净化设备有限公司）；质谱仪（Q Exactive，美国Thermo Scientific公司）；离心机（5415D，德国Eppendorf公司）；恒温振荡器（IS-RDS6，美国惊骐有限公司）；多功能酶标仪（Synergy HT，美国BioTek仪器有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株来源

发酵菌株来自安徽省淮河流域蚌埠段（117°23′56″-117°24′56″E，32°53′2″-32°56′29″N）沉底泥沙样本中，由蚌埠医科大学朱美林副教授提供，通过ITS序列对比分析，发现该菌株与Aspergillus flavipes（GenBank No.OR520169.1）具有99.49%的相似度。结合该菌株的形态学特征分析，菌丝体呈淡黄色，菌落边缘光滑，后期菌落逐渐被白色绒毛覆盖，培养基被浸染成淡黄色，确认该菌株为Aspergillus flavipes。该菌株采用甘油管保藏，置于-20 ℃低温冰箱中保藏，存放于蚌埠医科大学药学院。

1.2.2 菌株发酵

将保藏的菌株Aspergillus flavipes BMC-28接种在PDA平板上复苏，于28 ℃培养5~6 d，待其长满平板，从未污染的平板中刮取孢子接种于1 000 mL装有糙米培养基的锥形瓶中，在上述培养条件下培养，30 d后获得发酵产物。

1.2.3 提取与分离

发酵完毕后，将无杂菌污染的发酵产物合并，用甲醇浸提3次后蒸干，蒸干后的浸提物用水复溶，加乙酸乙酯萃取3次，合并所有乙酸乙酯萃取液，旋干，得到发酵粗提物15 g。粗提物用甲醇和二氯甲烷混合溶剂溶解后，加硅胶拌样后旋干，过200~300目筛，经反相硅胶柱层析分离（甲醇-水，V/V，10∶90、30∶70、50∶50、70∶30、90∶10、100∶0）梯度洗脱，得到7个馏分（Fr.1~7）。Fr.1馏分用反相柱层析分离（乙腈-水，V/V，15∶85、30∶50、50∶50、100∶0）梯度洗脱，分离得到亚馏分Fr.1-1和Fr.1-3。Fr.1-1在半制备液相色谱上（36%乙腈）制备，得到化合物11（10 mg，t_R=13 min）；Fr.1-3经半制备液相色谱（40%乙腈）制备，得到化合物13（10 mg，t_R=13 min）。Fr.5经反相柱层析（乙腈-水，V/V，1∶100、1∶50、1∶10、1∶1）梯度洗脱，得到亚馏分Fr.5-1和Fr.5-3。Fr.5-1经半制备液相色谱（38%乙腈）制备，得到化合物14（7 mg，t_R=15 min）；Fr.5-3经半制备液相色谱（45%乙腈）制备，得到化合物15（17 mg，t_R=14 min）。Fr.7经反相柱层析（乙腈-水，V/V，1∶100、1∶50、1∶10、1∶1）梯度洗脱，得到亚馏分Fr.7-1。Fr.7-1经半制备液相色谱（74%乙腈）制备，得到化合物9（9 mg，t_R=14 min）。Fr.4经正相柱层析（石油醚-乙酸乙酯，V/V，10∶1、5∶1、3∶1、2∶1、1∶1）洗脱，得到Fr.4-9、Fr.4-11、Fr.4-14三个亚馏分。Fr.4-11经半制备液相色谱（46%乙腈）制备，得到化合物8（13.4 mg，t_R=17 min）和化合物5（5.3 mg，t_R=19 min）；Fr.4-14经正相柱层析（二氯甲烷-甲醇，V/V，100∶1、50∶1、25∶1、10∶1、1∶1）梯度洗脱，得到Fr.4-14-11，再经半制备液相色谱（23%乙腈）制备，得到化合物7（14.6 mg，t_R=13 min）；Fr.4-9经半制备液相色谱（61%乙腈）制备，得到化合物2（9.2 mg，t_R=11 min）、化合物4（12.4 mg，t_R 13 min）、化合物3（19.1mg，t_R 14 min）、化合物12（15.3 mg，t_R=15 min）。Fr.6经正相柱层析（二氯甲烷-甲醇，V/V，100∶1、50∶1、25∶1、10∶1、1∶1）梯度洗脱，得到Fr.6-10。Fr.6-10再经正相柱层析（石油醚-乙酸乙酯，V/V，100∶1、50∶1、25∶1、10∶1、1∶1）梯度洗脱，得到Fr.6-10-3、Fr.6-10-6两个亚馏分。Fr.6-10-3经半制备液相色谱（53%乙腈）制备，得到化合物6（12.3 mg，t_R=13 min）；Fr.6-10-6经半制备液相色谱（61%乙腈）制备得到化合物1（11.5 mg，t_R=12 min）和化合物10（9.0 mg，t_R=14 min）。

1.2.4 抗氧化活性研究

采用DPPH法^{［15，16］}测定化合物1~15体外抗氧化活性。首先用无水乙醇将各待测样品配制成浓度为100 μmol/L的母液，再按倍比稀释法配制成一系列不同浓度的待测样品溶液（50.0，25.0，12.5，6.25，3.12，1.56 μmol/L）。取不同浓度的待测样品溶液50 μL和DPPH自由基溶液（0.1 μmol/L，无水乙醇配制）50 μL于96孔板中，37 ℃下避光反应30 min，在最大吸收波长517 nm处用酶标仪测定吸光度，记为A₁。同时设置样品参比组：不加DPPH自由基溶液，由不同浓度的样品与等体积的无水乙醇组成，测得的吸光度记为A₂；空白对照组：不加样品，由DPPH无水乙醇溶液与等体积无水乙醇组成，测得的吸光度记为A₀。实验重复3次，阳性对照为维生素C。按照公式采用Excel软件计算DPPH自由基清除率：DPPH自由基清除率=［1-（A₁-A₂）/A₀］×100%，然后运用GraphPad Prism软件拟合曲线计算IC₅₀值。

2 结果

通过多种色谱技术从菌株Aspergillus flavipes BMC-28糙米发酵物中分离得到15个化合物，结合核磁共振（包括¹H NMR和¹³C NMR）与质谱（MS）等波谱学方法鉴定其结构，分别为硫赭曲菌素（1），2-（3'-羟基-4'-甲氧羰基-5'-甲基苯氧基）-4-羟基- 6-甲氧基苯甲酸（2），methyl chloroasterrate（3），曲地酸（4），monomethylosoic acid（5），iizukine B（6），epicoccone（7），epicoccolide B（8），N-benzoylphenylalaninyl-N-benzoylphenylalaninate（9），大黄素甲醚（10），（2E，2'E）-3，3'-（6，6'-二羟基联苯-3，3'-二基）二丙烯酸（11），auranticin A（12），2，6-二羟基-3，4-二甲基苯甲酸（13），4-甲基苔黑酚（14），4，5，6-三甲基-1，3-苯二酚（15），化学结构如图1所示。

2.1 结构鉴定

化合物1：白色粉末状，MS m/z 333.10 ［M+H］⁺，分子式为C₁₇H₁₆O₇，不饱和度为10。¹H NMR（600 MHz，DMSO-d₆ ） δ_H 6.68（d，J=2.1 Hz，1H，H-3），6.90（d，J=2.1 Hz，1H，H-5），6.08（s，2H，H-13，H-15），3.64（s，3H，H-7），3.63（s，3H，H-9），2.15（s，3H，H-17），9.98（s，1H，4-OH），11.43（s，2H，12，16-OH）； ¹³C NMR（151 MHz，DMSO‑ d₆ ） δ_C 199.6（C-10），165.6（C-8），161.7（C-12，C-16），158.1（C-4），147.4（C-14），127.9（C-6），126.2（C-1），109.1（C-11），107.6（C-13，C-15），107.2（C-5），103.4（C-3），56.0（C-7），52.1（C-9），21.6（C-17）。将¹H NMR和¹³C NMR数据与文献［17］比对，故确定该化合物为硫赭曲菌素（sulochrin）。

化合物2：淡黄色粉末，MS m/z 349.09 ［M+H］⁺，分子式为C₁₇H₁₆O₈，不饱和度为10。¹H NMR（600 MHz，DMSO-d₆ ） δ_H 6.73（d，J=2.7 Hz，1H，H-3），6.68（s，1H，H-5），6.29（s，1H，H-4'），5.68（s，1H，H-6'），3.75（s，3H，H-9'），3.65（s，3H，H-7），2.05（s，3H，H-7'），10.12（s，1H，4-OH），9.77（s，1H，3'-OH）； ¹³C NMR（151 MHz，DMSO‑d₆ ） δ_C 167.3（C-8'），166.7（C-8），156.8（C-3'），154.9（C-4），153.1（C-6），141.3（C-5'），133.7（C-1），109.3（C-4'），107.5（C-3），106.9（C-2'），56.0（C-7），51.9（C-9'），21.4（C-7'）。将¹H NMR和¹³C NMR数据与文献［18］比对，故确定该化合物为2-（3'-羟基-4'-甲氧羰基-5'-甲基苯氧基）-4-羟基-6-甲氧基苯甲酸。

化合物3：褐色固体，MS m/z 382.04 ［M+H］⁺，分子式为C₁₇H₁₅O₈Cl，不饱和度为10。¹H NMR（600 MHz，DMSO‑d₆ ） δ_H 6.80（s，1H，H-3），6.79（s，1H，H-5），3.69（s，3H，H-7），3.62（s，3H，H-9'），5.88（s，1H，H-6'），2.16（s，3H，H-7'），9.92（s，1H，4-OH）； ¹³C NMR（151 MHz，DMSO‑d₆ ） δ_C 133.7（C-1），125.2（C-2），107.6（C-3），155.2（C-4），105.0（C-5），153.1（C-6），56.1（C-7），164.8（C-8），157.2（C-1'），104.3（C-2'），156.6（C-3'），106.0（C-4'），141.3（C-5'），113.3（C-6'），20.4（C-7'），170.7（C-8'），52.0（C-9'）。将¹H NMR和¹³C NMR数据与文献［19，20］比对，故确定该化合物为methyl chloroasterrate。

化合物4：淡黄色固体，MS m/z 348.09 ［M+H］⁺，分子式为C₁₇H₁₆O₈，不饱和度为10。¹H NMR（600 MHz，DMSO‑d₆ ） δ_H 6.78（s，1H，H-3），6.78（s，1H，H-5），3.70（s，3H，H-7），3.62（s，3H，H-9），5.66（s，1H，H-4'），6.33（s，1H，H-6'），2.07（s，3H，H-7'），9.86（s，1H，4-OH）； ¹³C NMR（151 MHz，DMSO‑d₆ ） δ_C 133.9（C-1），125.3（C-2），107.5（C-3），155.0（C-4），104.7（C-5），153.3（C-6），56.0（C-7），165.0（C-8），51.9（C-9），158.5（C-2'），103.9（C-3'），159.9（C-4'），109.9（C-5'），143.2（C-6'），104.9（C-8'），21.4（C-7'），170.2（C-8'）。将¹H NMR和¹³C NMR数据与文献［20，21］比对，故确定该化合物为曲地酸（asterric acid）。

化合物5：黄色油状，MS m/z 334.08 ［M+H］⁺，分子式为C₁₆H₁₄O₈，不饱和度为10。¹H NMR（600 MHz，DMSO‑d₆ ） δ_H 6.79（d，J=3.0 Hz，1H，H-3），6.73（d，J=3.1 Hz，1H，H-5），3.68（s，3H，H-7），5.68（s，1H，H-4'），6.32（s，1H，H-6'），2.07（s，3H，H-7'）； ¹³C NMR（151 MHz，DMSO‑d₆ ） δ_C 133.8（C-1），126.6（C-2），107.8（C-3），154.9（C-4），104.5（C-5），153.1（C-6），56.0（C-7），166.0（C-8），158.8（C-2'），103.3（C-3'），160.6（C-4'），109.9（C-5'），143.6（C-6'），104.8（C-8'），21.4（C-7'），170.5（C-8'）。将¹H NMR和¹³C NMR数据与文献［21］比对，故确定该化合物为monomethylosoic acid。

化合物6：红色油状，MS m/z 288.18 ［M+H］⁺，分子式为C₁₇H₂₀O₄，不饱和度为8。¹H NMR（600 MHz，DMSO-d₆ ） δ_H 6.17（s，1H，H-5），1.89（s，3H，H-7），2.04（s，3H，H-8），3.74（s，2H，H-9），6.33（s，1H，H-5'），2.13（s，3H，H-7'），1.91（s，3H，H-8'），8.13（s，1H，2-OH），8.97（s，1H，6-OH），8.90（s，1H，4'-OH），10.11（s，1H，6'-OH）； ¹³C NMR（151 MHz，DMSO-d₆ ） δ_C 112.9（C-1），153.7（C-2），110.7（C-3），134（C-4），108（C-5），152.2（C-6），11.3（C-7），19.5（C-8），19.1（C-9），115.6（C-1'），137.7（C-2'），114.5（C-3'），153.3（C-4'），99.5（C-5'），151.1（C-6'），15.7（C-7'），11.5（C-8'）。将¹H NMR和¹³C NMR数据与文献［19］比对，故确定该化合物为iizukine B。

化合物7：浅褐色固体，MS m/z 196.03 ［M+H］⁺，分子式为C₉H₈O₅，不饱和度为6。¹H NMR（600 MHz，DMSO‑d₆ ） δ_H 5.08（s，2H，H-3），2.33（s，3H，H-8），9.14（s，1H，4-OH），9.14（s，1H，6-OH）； ¹³C NMR（151 MHz，DMSO‑d₆ ） δ_C 171.3（C-1），66.3（C-3），126.2（C-3a），139.8（C-4），136.8（C-5），144.9（C-6），115.9（C-7），112.4（C-7a），9.4（C-8）。将¹H NMR和¹³C NMR数据与文献［22］比对，故确定该化合物为epicoccone。

化合物8：黑褐色固体，MS m/z 358.06 ［M+H］⁺，分子式为C₁₈H₁₄O₈，不饱和度为12。¹H NMR（600 MHz，DMSO‑d₆ ） δ_H 7.46（s，1H，H-3），10.41（s，1H，H-8），9.48（s，1H，H-15），2.01（s，3H，H-16），2.58（s，3H，H-17）； ¹³C NMR（151 MHz，DMSO‑d₆ ） δ_C 151.6（C-2），108.9（C-3），122.9（C-3a），117.1（C-4a），127.5（C-5），140.9（C-6），136.6（C-7），142.4（C-7a），190.1（C-8），124.9（C-9），112.6（C-10），118.7（C-11），132.7（C-12），151.5（C-13），150.2（C-14），194.7（C-15），12.7（C-16），11.0（C-17）。将¹H NMR和¹³C NMR数据与文献［22］比对，故确定该化合物为epicoccolide B。

化合物9：白色粉末状，MS m/z 506.15 ［M+H］⁺，分子式为C₃₂H₃₀O₄N₂，不饱和度为19。{[\alpha ]}_D^{\mathrm{25}}=-16.8（CHCl₃，c 1.0 mg/mL）；¹H NMR（600 MHz，CDCl₃） δ_H 4.06（dd，J=11.4，4.3 Hz，1H，H-1），4.57（dd，J=11.4，3.4 Hz，1H，H-1），4.65（m，1H，H-2），2.92（dd，J=13.8，8.3 Hz，1H，H-3），3.02（dd，J=13.7，6.5 Hz，1H，H-3），7.23-7.28（H-5/9），7.23-7.28（H-6/8），7.23-7.28（H-7），7.68（d，J=7.7 Hz，2H，H-12/16），7.41（t，J=7.6 Hz，2H，H-13/15），7.53（t，J=7.4 Hz，1H，H-14），4.94（q，J=6.7 Hz，1H，H-2'），3.24（dd，J=13.9，7.0 Hz，1H，H-3'），3.32（dd，J=13.9，6.5 Hz，1H，H-3'），7.23-7.28（H-5'/9'），7.23-7.28（H-6'/8'），7.23-7.28（H-7'），7.73（d，J=7.7 Hz，2H，H-12'/16'），7.34（d，J=7.4 Hz，2H，H-13'/15'），7.46（d，J=7.4 Hz，1H，H-14'），6.64（d，J=6.6 Hz，1H，N-Ha），6.71（d，J=8.4 Hz，1H，N-Hb）；¹³C NMR（151 MHz，CDCl₃） δ_C 66.4（C-1），51.3（C-2），38.3（C-3），138.2（C-4），130.3（C-5/9），129.7（C-6/8），127.8（C-7），168.4（C-10），135.2（C-11），128.1（C-12/16），129.9（C-13/15），133.0（C-14），172.9（C-1'），55.5（C-2'），38.5（C-3'），136.8（C-4'），130.2（C-5'/9'），129.7（C-6'/8'），128.4（C-7'），168.2（C-10'），134.3（C-11'），128.1（C-12'/16'），129.4（C-13'/15'），132.4（C-14'）。将¹H NMR和¹³C NMR数据与文献［23］比对，故确定该化合物为N-benzoylphenylalaninyl-N-benzoylphenylalaninate。

化合物10：黄色粉末，MS m/z 284.09 ［M+H］⁺，分子式为C₁₆H₁₂O₅，不饱和度为11。¹H NMR（600 MHz，DMSO‑d₆ ） δ_H 7.12（s，1H，H-2），7.43（s，1H，H-4），7.20（s，1H，H-5），6.84（s，1H，H-7），3.90（s，3H，H-11），2.39（s，3H，H-12），13.27（s，1H，1-OH）； ¹³C NMR（151 MHz，DMSO‑d₆ ） δ_C 161.7（C-1），124.2（C-2），146.6（C-3），119.1（C-4），132.1（C-4a），107.2（C-5），105.0（C-7），163.5（C-8），186.2（C-9），114.4（C-9a），182.4（C-10），136.8（C-10a），56.3（C-11），21.4（C-12）。将¹H NMR和¹³C NMR数据与文献［24］比对，故确定该化合物为大黄素甲醚（questin）。

化合物11：白色粉末，MS m/z 326.09 ［M+H］⁺，分子式为C₁₈H₁₄O₆，不饱和度为12。¹H NMR（600 MHz，DMSO‑d₆ ） δ_H 7.44（s，1H，H-2a），7.55-7.49（m，1H，H-5a），6.92（d，J=8.4 Hz，1H，H-6a），7.55-7.49（m，1H，H-7a），6.31（d，J=15.9 Hz，1H，H-8a），9.87（s，1H，4a-OH），12.11（s，1H，9a-OH），7.44（s，1H，H-2b），7.55-7.49（m，1H，H-5b），6.92（d，J=8.4 Hz，1H，H-6b），7.55-7.49（m，1H，H-7b），6.31（d，J=15.9 Hz，1H，H-8b），9.87（s，1H，4b-OH），12.11（s，1H，9b-OH）； ¹³C NMR（151 MHz，DMSO‑d₆ ） δ_C 125.7（C-1a），128.7（C-2a），125.0（C-3a），157.2（C-4a），116.0（C-5a），132.0（C-6a），144.3（C-7a），115.4（C-8a），167.9（C-9a），125.7（C-1b），128.7（C-2b），125.0（C-3b），157.2（C-4b），116.0（C-5b），132.0（C-6b），144.3（C-7b），115.4（C-8b），167.9（C-9b）。将¹H NMR和¹³C NMR数据与文献［25］比对，故确定该化合物为（2E，2'E）-3，3'-（6，6'-二羟基联苯-3，3'-二基）二丙烯酸（（2E，2'E）-［6，6'-dihydroxy［1，1'-biphenyl］-3，3'-diyl］bis［prop-2-enoic acid］）。

化合物12：淡黄色粉末状，MS m/z 455.17 ［M+H］⁺，分子式为C₂₅H₂₆O₈，不饱和度为13。¹H NMR（600 MHz，DMSO‑d₆ ） δ_H 6.62（s，1H，H-2），6.55（s，1H，H-7），5.55（q，J=6.8，1.4 Hz，1H，H-2'），5.58（1H，H-2″），4.49（s，2H，4-CH₂-O），3.78（s，3H，8-OMe），2.24（s，3H，9-Me），2.24（s，3H，4″-Me），1.76（d，J=6.8 Hz，3H，H-3'），2.08（br s，3H，H-4'）；¹³C NMR（151 MHz，DMSO‑d₆ ） δ_C 148.73（C-1），113.17（C-2），161.17（C-3），119.14（C-4），162.34（C-4a），142.79（C-5a），136.37（C-6），108.20（C-7），154.73（C-8），116.84（C-9），143.24（C-9a），163.38（C-11），110.92（C-11a），52.65（4-CH₂-O），56.47（8-OMe），9.72（9-Me），133.66（C-1'），126.30（C-2'），18.08（C-3'），14.26（C-4'），156.34（C-1″），119.85（C-2″），167.16（C-3″），20.42（C-4″）。将¹H NMR和¹³C NMR数据与文献［26］比对，故确定该化合物为auranticin A。

化合物13：无色油状，MS m/z 182.05 ［M+H］⁺，分子式为C₉H₁₀O₄，不饱和度为5。¹H NMR（600 MHz，DMSO‑d₆ ） δ_H 6.23（s，1H，H-5），12.05（s，1H，H-7），1.97（s，3H，H-8），2.28（s，3H，H-9），9.82（s，1H，2-OH）； ¹³C NMR（151 MHz，DMSO‑d₆ ） δ_C 99.9（C-1），158.7（C-2），114.6（C-3），138.4（C-4），108.8（C-5），158.5（C-6），172.4（C-7），11.3（C-8），17.9（C-9）。将¹H NMR和¹³C NMR数据与文献［27］比对，故确定该化合物为2，6-二羟基-3，4-二甲基苯甲酸（2，6-Dihydroxy-3，4-dimethylbenzoic acid）。

化合物14：白色固体，MS m/z 138.07 ［M+H］⁺，分子式为C₈H₁₀O₂，不饱和度为4。¹H NMR（600 MHz，DMSO‑d₆ ） δ_H 6.12（s，1H，H-2），6.03（s，1H，H-6），1.90（s，3H，H-7），2.06（s，3H，H-8），8.75（s，1H，1-OH），8.90（s，1H，3-OH）； ¹³C NMR（151 MHz，DMSO‑d₆ ） δ_C 155.0（C-1），100.0（C-2），155.6（C-3），112.4（C-4），137.5（C-5），107.8（C-6），10.8（C-7），20.0（C-8）。将¹H NMR和¹³C NMR数据与文献［28］比对，故确定该化合物为4-甲基苔黑酚（4-Methylorcinol）。

化合物15：白色固体，MS m/z 152.09 ［M+H］⁺，分子式为C₉H₁₂O₂，不饱和度为4。¹H NMR（600 MHz，DMSO‑d₆ ） δ_H 6.22（s，1H，H-6），1.95（s，3H，H-7），2.03（s，3H，H-8），1.95（s，3H，H-9），8.66（s，1H，1-OH），8.66（s，1H，5-OH），其核磁数据与化合物14类似。根据图谱信息及查阅文献［29］确定化合物15为4，5，6-三甲基-1，3-苯二酚（4，5，6-Trimethylbenzene-1，3-diol）。

2.2 抗氧化活性结果

化合物1~15的DPPH自由基清除能力如图2和表1所示，其中化合物6、7和8表现出强抗氧化活性，其半数抑制率IC₅₀分别为3.68 μmol/L、2.68 μmol/L和1.53 μmol/L，显著优于阳性对照维生素C。化合物12和14表现出中等抗氧化活性，其IC₅₀为9.17 μmol/L和13.66 μmol/L；其余化合物的IC₅₀>100 μmol/L，无明显活性。构效关系分析表明，强活性化合物6、7和8的分子结构中分别含有4个、3个和5个酚羟基，而中等活性的化合物12和14仅含2个酚羟基，无活性化合物所含酚羟基数目多为1~2个或酚羟基被甲氧基等基团取代。

3 讨论

淮河作为我国重要的淡水生态系统之一，其沉积物环境蕴含着独特且尚未被充分开发的真菌资源。本研究对该区域来源真菌Aspergillus flavipes BMC-28的次级代谢产物进行了系统分离与鉴定，共获得15个已知化合物。这些化合物的结构类型涵盖广泛，包括二苯醚类（化合物2~5）、联苯类（化合物1和6）、苯并呋喃类（化合物7和8）、肽类（化合物9）、蒽醌类（化合物10）、苯丙素类（化合物11）、缩酚酸环醚（化合物12），以及苯类衍生物（化合物13~15）。其中，化合物11和12为首次从该种属真菌中分离得到。DPPH自由基清除活性评价表明，化合物6、7和8具有显著抗氧化活性，IC₅₀值为1.53~3.68 μmol/L，显著优于阳性对照维生素C。

据报道，化合物11可从香豆酸经酶氧化后分离得到^［25］；化合物12早期作为缩酚酸类抗菌化合物从红树林来源的真菌Preussia aurantiaca中获得^［26］，并在此后从牡蛎来源的真菌Westerdykella dispersa Ca4-13中分离得到^［30］，但在Aspergillus属中尚未见相关报道。化合物11和12的发现不仅丰富了该属的化学结构数据库，也表明淮河淡水沉积物环境中的Aspergillus flavipes可能具有不同于陆地或海洋来源同种菌株的次级代谢特征。

在DPPH自由基清除活性方面，化合物6、7和8均表现出显著活性，IC₅₀值在1.53~3.68 μmol/L范围内，显著优于阳性对照维生素C。有文献报道化合物6（iizukine B）此前从海岸盐渍土来源真菌Aspergillus iizukae中分离得到，研究主要集中于其细胞毒活性评价^［19］，而对于其抗氧化活性尚无明确报道。本研究首次发现iizukine B也具有较强的DPPH自由基清除能力，为该化合物的生物活性提供了重要补充。构效关系分析显示，化合物6、7和8均含有3个及以上酚羟基取代，这一多酚羟基结构特征与化合物的强抗氧化活性密切相关。苯类衍生物13、14和15的活性相对较弱，进一步印证了酚羟基的数量对清除DPPH自由基能力具有重要影响。这一结果符合酚类化合物通过酚羟基提供氢原子或电子以清除自由基的经典机制^［31］。因此，多酚羟基取代是本研究化合物表现强抗氧化活性的重要结构特征，但活性的强弱还受到酚羟基位置、邻位取代模式及共轭体系等因素的影响。这为多酚类天然产物作为抗氧化先导化合物的开发应用提供了有益的结构信息。

本研究尚存在一定的局限性。首先，抗氧化活性的评估仅采用了DPPH自由基清除法，该方法主要反映化合物通过氢原子转移机制清除自由基的能力，难以全面反映化合物在细胞或生物体内的多层次抗氧化作用。未来研究将进一步采用ABTS自由基清除法、ORAC法、脂质过氧化抑制实验以及细胞水平的抗氧化活性评价（如ROS清除实验、细胞内GSH水平检测）等多种方法进行交叉验证，以全面评估这些化合物的抗氧化潜力。

综上所述，本研究从淮河沉积物真菌Aspergillus flavipes BMC-28中分离鉴定出15个已知化合物，其中2个为属内首次报道。化合物6、7、8具有强DPPH自由基清除活性（IC₅₀ 1.53~3.68 μmol/L），显著优于维生素C。这证实了淮河沉积物来源Aspergillus flavipes作为天然抗氧化剂开发来源的潜力，为淡水真菌次级代谢产物的开发提供了理论基础和科学依据。

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