基于非靶向代谢组学的黄芪等级划分及其与优形优质的关联性

Grade classification and its correlation with quality superiority of Astragali Radix based on untargeted metabolomics

摘要

目的 探索不同质量等级黄芪之间的差异代谢物及其与性状特征关系。 方法 收集不同批次黄芪饮片，根据产地、直径、气味等划分质量等级。采用HPLC法检测黄芪甲苷及毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量，色谱柱均采用C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），色谱条件依次为乙腈-水（32∶68）及乙腈-0.2%甲酸梯度洗脱。采用LC-MS技术，通过非靶向代谢组学方法分析不同等级黄芪差异代谢物。采用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）等多元统计方法筛选不同等级黄芪饮片间的差异代谢物。结合HMDB、MassBank、LipidMaps、mzCloud、KEGG及自建标准品数据库进行代谢物定性鉴定，并进一步解析其关键代谢通路。 结果 依据直径、豆腥味、产地等将常用黄芪饮片分为3个等级。等级1（HQ1）黄芪甲苷量0.051%~0.132%、毛蕊异黄酮0.034%~0.049%；等级2（HQ2）两成分含量分别为0.039%~0.042%、0.023%~0.036%；等级3（HQ3）含量分别降至0.022%~0.033%、0.006%~0.026%。不同等级黄芪检测总代谢物均为4 718种；HQ1与HQ2、HQ1与HQ3、HQ2与HQ3比较，分别筛选出差异代谢物289种（上调106种、下调183种）、311种（上调176种、下调135种）、329种（上调219种、下调110种）。KEGG通路富集分析显示，3个等级黄芪差异代谢物显著富集于氨基酸代谢、黄酮类化合物生物合成及脂质代谢通路。 结论 黄芪饮片品质等级与黄芪甲苷、毛蕊异黄酮含量正相关，等级降低成分含量显著下降；总代谢物种类基本一致，但含量差异显著；差异代谢物富集于氨基酸代谢、黄酮类化合物生物合成等通路，其差异化调控是品质分化的核心代谢基础。

Abstract

Objective To explore differential metabolites among Astragali Radix of different quality grades and their correlations with morphological characteristics. Methods Astragali Radix slices from different batches were collected and graded according to their origin， diameter， odor， and other characteristics. The contents of astragaloside Ⅳ and calycosin-7-O-glucoside were determined by HPLC. A C₁₈ column（250 mm×4.6 mm， 5 μm） was used， with isocratic elution using acetonitrile-water（32∶68） or gradient elution using acetonitrile-0.2% formic acid as the chromatographic conditions for the two analytes， respectively. LC-MS combined with an untargeted metabolomics method was applied to profile differential metabolites in Astragali Radix slices of different quality grades. Multivariate statistical methods， including principal component analysis（PCA） and orthogonal partial least squares discriminant analysis（OPLS‑DA）， were employed to screen differential metabolites among Astragali Radix pieces of different grades. Metabolites were qualitatively identified by searching against the HMDB， MassBank， LipidMaps， mzCloud， KEGG database and an in‑house standard database， and the key metabolic pathways were further analyzed. Results According to the diameter， bean-like odor， places of region and other indexes， the commonly used Astragali Radix herbal pieces were divided into three grades. For grade 1（HQ1）， the content was 0.051%-0.132% for astragaloside Ⅳ and 0.034%-0.049% for calycosin-7-O-glucoside； the contents in grade 2（HQ2） were 0.039%-0.042% and 0.023%-0.036%， respectively； the contents in grade 3（HQ3） decreased to 0.022%-0.033% and 0.006%- 0.026%， respectively. A total of 4 718 metabolites were identified in all grades. A total of 289 differential metabolites（106 up-regulated and 183 down-regulated） were screened between HQ1 and HQ2， and 311（176 up-regulated and 135 down-regulated） between HQ1 and HQ3， and 329（219 up-regulated and 110 down-regulated） between HQ2 and HQ3 were screened. KEGG pathway enrichment analysis showed that the differential metabolites from the three grades were significantly enriched in amino acid metabolism， flavonoid biosynthesis， and lipid metabolism pathways. Conclusion The quality grade of Astragali Radix slices is positively correlated with the contents of astragaloside Ⅳ and calycosin， and the contents of these components decrease significantly as the grade decreases. The types of total metabolites are basically consistent， but their contents show significant differences. The differential metabolites are significantly enriched in the pathways of amino acid metabolism， and flavonoid biosynthesis. The differential regulation of these pathways constitutes the core metabolic basis for quality differentiation.

Graphical abstract

关键词

黄芪 / 非靶向代谢组学 / 优形优质 / 黄芪甲苷 / 毛蕊异黄酮

Key words

Astragali Radix / untargeted metabolomics / quality superiority associated with grade / astragaloside Ⅳ / calycosin

山西作为我国“北药”核心产区，中药材资源优势显著，种植规模超300万亩，已形成太行山、太岳山等五大道地中药材优势产业带^［1］。“山西黄芪”作为标志性品种，入选“十大晋药”，造就了条长顺直、色泽黄亮、粉性充足、绵性突出的优良外观，富含黄芪甲苷、黄芪多糖等成分^［2］。近年来，黄芪在临床医疗与保健养生领域的应用愈发广泛，市场需求持续走高，但优良品种短缺导致的品质参差不齐问题日益凸显，给黄芪的等级评定与质量管控带来严峻挑战^［3］。传统等级划分依赖老药工经验鉴别，仅通过外观性状评判品质，难以客观建立“形”与“质”的对应关系^［4］；TLC、HPLC等常规检测技术虽能定量分析少数指标成分，却存在检测成本高、耗时久、成分覆盖范围有限等短板，常因单一成分含量波动误判整体品质，无法满足等级划分的全面性与精准性需求^［5］。此前相关研究多聚焦个别成分或某类总提物的含量对比，未能从整体层面揭示不同等级黄芪的化学成分差异^［6］，难以构建“优形”与“优质”的科学关联，亟需建立一套基于整体代谢特征的等级评价体系。

非靶向代谢组学技术可全面捕获生物体内代谢物信息，结合UPLC-Q-TOF/MS联用技术的高分辨、快速分析、广覆盖等优势^［7］，为破解黄芪等级划分难题提供了可靠技术支撑。本研究以黄芪饮片为对象，依据外观性状差异划分不同等级，采用UPLC-MS非靶向代谢组学技术系统检测分析各等级黄芪的代谢物组成^［8］；运用主成分分析、正交偏最小二乘判别分析等多元统计方法筛选等级特异性代谢标志物^［9，10］，明确各等级黄芪的核心代谢差异；进一步探究外观性状（优形）与代谢组特征（优质）的内在关联，构建科学关联性模型，阐明“形质相符”的化学基础，从而为建立客观、精准的黄芪等级划分标准提供理论依据与技术支持，以弥补传统经验鉴别与常规指标检测的局限性，为黄芪质量分级与临床合理用药提供科学支撑。

1 仪器与试药

Orbitrap Exploris 120型质谱仪（德国Thermo公司）；Vanquish型超高效液相色谱仪（德国Thermo公司）；Agilent 1260 Infinity Ⅱ型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；黄芪甲苷（中国药品生物制品检定所，批号：110781-200613）；毛蕊异黄酮葡萄糖苷（中国药品生物制品检定所，批号：111530-201007）；乙腈（德国Thermo公司，批号：75-05-8）；甲酸（中国上海梯希爱化成工业发展有限公司，批号：64-18-6）；甲酸铵（美国西格玛奥德里奇公司，批号：540-69-2）。黄芪饮片均购自安徽亳州中药饮片市场，所有药材基源及性状特征均由山西省中医院主任药师王世伟鉴定，黄芪Astragali Radix样品（见表1）。

2 方法与结果

2.1 黄芪甲苷含量测定

2.1.1 色谱条件

参考2025版药典方法，色谱柱选用Wondasil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-水（32∶68）为流动相；蒸发光散射检测器检测。流速1.0 mL/min；柱温25 ℃；进样量10 μL。结果显示，黄芪饮片供试品与黄芪甲苷对照品在相同的保留时间处出现特征色谱峰（见图1）。

2.1.2 供试品溶液制备

准确称取约1.0 g黄芪药材粉末，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，加热回流4 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.1.3 对照品溶液制备

取适量对照品，以甲醇溶解于容量瓶中，配制成0.052 4 mg/mL的溶液。用微孔滤膜滤过，即得。

2.1.4 不同等级黄芪中黄芪甲苷含量

不同等级黄芪核心指标成分含量测定结果显示：1级（HQ1）黄芪中黄芪甲苷含量范围为0.051%~0.132%，处于最高水平；2级（HQ2）黄芪中黄芪甲苷含量出现明显回落，降至0.039%~0.042%；3级（HQ3）黄芪中黄芪甲苷含量进一步降低，仅为0.022%~0.033%，整体呈现出指标成分含量随黄芪品质等级降低而显著递减的趋势（见表2）。

2.2 毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定

2.2.1 色谱条件

参考2025版药典方法，色谱柱选用Wondasil ODS C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈为流动相A₁，以0.2%甲酸溶液为流动相B₁，梯度洗脱（0~20 min，流动相A₁由20%线性递增至40%；20~30 min，流动相A₁维持40%等度洗脱）；检测波长为260 nm。流速1.0 mL/min，柱温25 ℃，进样量10 μL。结果显示，黄芪饮片供试品与毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品在相同的保留时间处出现特征色谱峰（见图2）。

2.2.2 供试品溶液制备

准确称取约1.0 g黄芪药材粉末，置具塞锥形瓶中，精密加入含4%浓氨试液的80%甲醇溶液（取浓氨试液4 mL，加80%甲醇至100 mL，摇匀）50 mL，密塞，称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用含4%浓氨试液的80%甲醇溶液补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，蒸干，残渣用80%甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加80%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 对照品溶液制备

取适量对照品，以甲醇溶解于容量瓶中，配制成0.099 6 mg/mL的溶液。用微孔滤膜滤过，即得。

2.2.4 不同等级黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量差异

1级（HQ1）黄芪中毛蕊异黄酮含量为0.034%~ 0.049%；2级（HQ2）黄芪中毛蕊异黄酮含量0.023%~0.036%；3级（HQ3）黄芪中毛蕊异黄酮含量跌至0.006%~0.026%（见表2）。

2.3 不同等级黄芪的非靶向代谢组学分析

采用3个等级黄芪，每个等级取3个样品，共9个样品进行非靶向代谢组学比较分析。

2.3.1 色谱条件

UPLC流动相：Thermo Vanquish（Thermo Fisher Scientific， USA）超高效液相系统，使用ACQUITY UPLC® HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 µm）（Waters， Milford， MA， USA）色谱柱，流速0.3 mL/min，柱温40 ℃，进样量2 μL。正离子模式，流动相为0.1%甲酸乙腈（B₂）和0.1%甲酸水（A₂），梯度洗脱程序为：0~1 min，10% B₂；1~5 min，10%~98% B₂；5~6.5 min，98% B₂；6.5~6.6 min，98%~10% B₂；6.6~8 min，10% B₂。负离子模式，流动相为乙腈（B₃）和5 mmol/L甲酸铵水（A₃），梯度洗脱程序为：0~1 min，10% B₃；1~5 min，10%~98% B₃；5~6.5 min，98% B₃；6.5~6.6 min，98%~10% B₃；6.6~8 min，10% B₃。

2.3.2 高分辨质谱采集参数与离子化条件

质谱分析采用Thermo Orbitrap Exploris 120质谱仪（Thermo Fisher Scientific， USA），配备电喷雾离子源（ESI）。数据采集采用正、负离子模式分别进行，具体参数如下：正离子喷雾电压为3.50 kV，负离子喷雾电压为-2.50 kV，鞘气40 arb，辅助气10 arb。毛细管温度325 ℃，以分辨率60 000进行一级全扫描，一级离子扫描范围m/z 100~1 000，并采用HCD进行二级裂解，碰撞能量为30%，二级分辨率为15 000，采集信号前离子进行碎裂，同时采用动态排除去除无必要的MS/MS信息。在上述质谱条件下获得的总离子流图可有效反映黄芪饮片中代谢物的整体离子响应与分布特征（见图3）。

2.3.3 代谢物的提取

精确称量适量样本于2 mL离心管中，加入600 µL甲醇含2-氯-L-苯丙氨酸（4 ppm），涡旋振荡30 s；加入钢珠，放入组织研磨器中，55 Hz研磨60 s；室温超声15 min；12 000 r/min 4 ℃离心10 min，取上清液过0.22 μm膜过滤，过滤液加入到检测瓶中，用于LC-MS检测。

2.3.4 主成分分析（PCA）

原始质谱下机文件经Proteowizard软件包（v3.0.8789）的MSConvert工具转换为mzXML格式，再通过R XCMS软件包（v3.12.0）以bw=2、ppm=15、peakwidth=c（5，30）、mzwid=0.015、mzdiff=0.01及method="centWave"为参数完成峰检测、过滤与对齐，生成代谢物定量列表，随后采用总峰面积归一化矫正数据以消除系统误差。利用R软件包Ropls对归一化后数据进行主成分分析（PCA），实现样本集整体分布与组间差异趋势的初步可视化评估。

PCA结果显示，3个不同质量等级（HQ1、HQ2、HQ3）的黄芪样本在正、负离子模式下均呈现明显的组间分离（见图4），提示其代谢物组成存在等级差异性。

2.3.5 正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）

在PCA分析基础上，继续采用R软件包Ropls对归一化处理后的代谢组数据进行偏最小二乘判别分析（PLS-DA）及正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），通过降维建模进一步挖掘不同等级黄芪样本间的代谢差异模式，提升组间判别效果。

正、负离子模式下的OPLS-DA分析显示，各等级比较组模型均具有良好的拟合度和预测能力（见图5）。负离子模式下，HQ1 vs HQ2、HQ1 vs HQ3、HQ2 vs HQ3的R²X分别为0.619，0.814，0.802，R²Y均>0.990，Q²为0.543~0.741；正离子模式下，R²X为0.598~0.801，R²Y均>0.993，Q²为0.500~0.775。所有比较组R²Y均接近1且Q²>0.5，提示模型稳定可靠。

2.3.6 一级差异代谢物分析

2.3.6.1 一级差异代谢物筛选

代谢物定性依托HMDB^［11］、massbank^［12］、LipidMaps^［13］、mzcloud^［14］、KEGG^［15］及诺米代谢自建标准品库，设定质量偏差阈值ppm<15开展搜库鉴定；结合一级质谱母离子质荷比、离子加合形式推定代谢物分子式，比对数据库完成物质注释，构建黄芪代谢物数据集。组间代谢物差异分析采用统计学检验，以VIP≥1为阈值筛选差异代谢物，统计结果见表3。

2.3.6.2 一级差异代谢物热图

基于一级差异代谢物筛选结果（VIP≥1，P<0.05），采用R语言Pheatmap程序包对差异代谢物定量矩阵进行行标准化（Z-score Scale）处理，以消除不同代谢物间的量纲差异，随后对样本与代谢物进行双向层次聚类分析，绘制聚类热图，结果显示，不同等级黄芪样本在正、负离子模式下均呈现组内紧密聚类、组间清晰分离的趋势（见图6），表明其代谢谱存在显著差异。三组两两对比中，上调（红色）与下调（蓝色）代谢物模块界限分明，且等级跨度越大（如HQ1 vs HQ3），颜色差异越显著，提示代谢物表达差异随等级升高而加剧。

2.3.6.3 一级差异代谢物火山图

火山图直观显示，在正、负离子模式下，不同等级黄芪两两对比均存在大量显著差异代谢物，上调与下调代谢物分别清晰分布于两侧。HQ1与HQ2比较共获得差异代谢物1 243种，其中上调510种、下调733种；HQ1与HQ3比较共1 290种，上调797种、下调493种；HQ2与HQ3比较共1 319种，上调923种、下调396种，组间代谢谱区分度显著（见图7）。

2.3.7 次级差异代谢物分析

2.3.7.1 次级差异代谢物筛选

对定量列表中含有二级质谱信息的代谢物，将其碎片离子、保留时间等信息与HMDB、MassBank、LipidMaps、mzCloud、KEGG及诺米代谢自建标准品库进行匹配比对，以ppm<15为质量偏差阈值完成次级结构水平的精准定性鉴定。本次检测共鉴定到代谢物4 718个，从中选取经二级质谱确证的代谢物，结合一级差异分析结果，以VIP>1且P<0.05为筛选阈值进行差异代谢物筛选，差异代谢物统计结果见表4。其中，HQ1与HQ3组间差异最为显著，该对比组的差异代谢物具体见表5。

2.3.7.2 次级差异代谢物热图

采用R Pheatmap程序包对次级差异代谢物矩阵数据进行数据缩放，并对样本和差异代谢物进行双向聚类，绘制聚类热图，结果显示，各组样本组内聚类紧密、组间分离清晰（见图8）。红色高表达与蓝色低表达模块分界鲜明，提示次级代谢物能体现不同等级黄芪内在质量差异。

2.3.7.3 次级差异代谢物火山图

次级差异代谢物火山图清晰展示了不同等级黄芪两两比较组间代谢物表达的差异分布与变化趋势。HQ1与HQ2、HQ1与HQ3、HQ2与HQ3对比中，显著差异代谢物均呈现明显的离散分布，上调与下调代谢物界限分明（见图9）。整体结果直观反映出次级差异代谢物能精准地区分黄芪质量等级，为后续标志物筛选与通路解析提供了重要依据。

2.3.7.4 KEGG通路富集

为明确不同等级黄芪的代谢差异机制，分别对HQ1 vs HQ2、HQ1 vs HQ3、HQ2 vs HQ3的差异代谢物进行KEGG通路富集分析，结果如下：

（1）HQ1 vs HQ2间差异代谢物主要富集于苯丙素生物合成（biosynthesis of phenylpropanoids）、类黄酮生物合成（flavonoid biosynthesis）等通路（见图10）。其中，苯丙素生物合成通路的影响因子及显著性水平均处于较高区间，提示该通路可能是驱动HQ1与HQ2等级黄芪代谢表型差异的核心通路之一。

（2）HQ1 vs HQ3间差异代谢物的富集通路覆盖酪氨酸代谢（tyrosine metabolism）、半胱氨酸和蛋氨酸代谢（cysteine and methionine metabolism）、类黄酮生物合成等（见图10）。其中，酪氨酸代谢通路的影响因子及显著性水平均表现突出，表明HQ1与HQ3等级黄芪的代谢差异更集中于氨基酸代谢及类黄酮合成相关的生物学过程。

（3）HQ2 vs HQ3 组差异代谢物主要富集于亚油酸代谢（linoleic acid metabolism）、α-亚麻酸代谢（α- linolenic acid metabolism）、类黄酮生物合成等通路（见图10）。脂类代谢相关通路的影响因子值相对显著，提示HQ2与HQ3等级黄芪的代谢差异主要体现在脂类代谢过程的调控差异上。

综上，类黄酮生物合成通路可能是不同等级黄芪差异代谢物共有的核心富集通路，提示该通路是黄芪品质等级差异的关键代谢调控通路；而苯丙素生物合成（HQ1 vs HQ2）、酪氨酸代谢（HQ1 vs HQ3）、亚油酸代谢（HQ2 vs HQ3）等特有富集通路，则体现了不同等级间代谢差异的侧重点，为解析黄芪等级分化的代谢机制提供了靶向方向。

3 讨论

3.1 不同等级黄芪形质的关联性

山西产一等品HQ1-1（直径1.1 cm）毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量为0.034%，豆腥味较强，与其代谢通路中类黄酮合成途径显著富集相吻合，表明山西道地产区环境更利于黄酮类成分积累。内蒙古产一等品HQ1-2（直径1.2 cm）黄芪甲苷含量更高（0.064%），该成分的合成前体供应与苯丙素生物合成通路密切相关，提示内蒙古产区更易促进萜类与苯丙素代谢协同激活。甘肃产三等品HQ3-1、HQ3-3中黄芪甲苷（0.022%~0.033%）和毛蕊异黄酮葡萄糖苷（0.006%~0.026%）含量均处于最低水平，豆腥味较微弱，这可能与其亚油酸代谢通路活性不足有关，脂类代谢前体缺乏与类黄酮通路下调共同造成成分与感官特征偏弱的现象^［16］。

按等级划分，一等品（HQ1，直径≥1.1 cm）苯丙素与类黄酮通路持续高表达，可为黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷提供充足前体，使二者含量维持在较高范围，同时苯丙素代谢产物参与挥发性物质形成，使豆腥味表现为中高强度，呈现出根条粗壮-代谢旺盛-成分富集-气味明显的协同规律^［17］。二等品（HQ2，直径1.0 cm）类黄酮通路活性有所降低，两种指标成分含量下降，苯丙素通路仍保持基础活性，豆腥味中等。三等品（HQ3，直径≤0.8 cm）关键次生代谢通路活性明显减弱，脂类代谢水平偏低，最终表现为形态偏细-通路活性低-成分含量少-气味淡薄的整体特征^［18］。

由此可见，黄芪产地、性状、感官与成分含量的关联，本质是不同生长条件下代谢通路活性差异的外在体现。优质产区与充分生长周期可有效激活类黄酮、苯丙素等次生代谢途径，实现形态、成分与感官特征的协同优良，为黄芪形质结合的等级评价提供了代谢层面的科学依据。

3.2 研究价值和标准优化

本研究从代谢组学角度验证了现行药典以直径、形态为核心的黄芪分级标准具备科学依据，一等品根条粗壮且指标成分含量更高的结果与传统分级规律高度一致。同时本研究发现，相同直径的黄芪因产地不同，核心代谢通路活性存在明显差异，进而导致有效成分含量显著分化，说明现有等级标准可进一步增加产地溯源与成分含量限值等指标，提高分级准确性。因此，在应用层面，可优先选择山西、内蒙古等道地产区药材，通过优化栽培措施调控关键代谢通路以稳定药材品质，并逐步建立形态规格+感官特征+指标成分+代谢特征的评价体系。

综上，本研究立足代谢组学视角剖析不同等级黄芪内在物质差异，证实传统外观分级标准并非经验性判定，具备扎实的物质基础与生物学依据，厘清了外观性状、产地环境与药效代谢物积累的关联机制。本研究弥补了黄芪药材分级重表型、轻内质的研究短板，为黄芪药材定级规范优化、道地药材提质栽培提供数据支撑。后续可扩大样本来源与数量，结合转录组与代谢组联合解析形质关联的分子机制，并开展药效验证研究，完善等级-品质-功效的关联体系，为黄芪临床用药与产业规范化发展提供支撑；可扩充多环境、多品系试验样本，深挖品质调控核心靶点，耦合药理药效试验开展交叉验证，进一步细化黄芪质量分级细则，助力中药材质控标准化、产业化落地。

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基金资助

国家中医药管理局高水平中医药中药化学重点学科项目(zyyzdxk-2023023)

山西省老中医药专家学术经验继承工作项目(晋卫中医药函【2022】36号)

山西省卫生健康委中医药科研课题(2022ZYYZ024)

山西省卫生健康委科研课题(2025ZD048)