亚硫酸钠对与脂肪细胞共培养的肝细胞脂肪代谢的影响

Effect of sodium sulfite on hepatic lipid metabolism in a hepatocyte-adipocyte co-culture system

摘要

目的 探讨亚硫酸钠（Na₂SO₃）是否通过干扰脂肪细胞脂联素分泌进而影响肝细胞的脂肪代谢。 方法 将3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为成熟脂肪细胞。用完全培养基（阴性对照）、不同浓度Na₂SO₃（0.02，0.1，0.5，2.5 mmol/L）和1 mmol/L油酸（OA，阳性对照）处理脂肪细胞、单独培养HepG2细胞和共培养HepG2细胞。采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定脂肪细胞培养上清中游离脂肪酸（FFA）和脂联素含量；采用甘油-3-磷酸氧化酶-过氧化物酶偶联法（GPO-POD）测定甘油三酯（TG）含量；采用免疫印迹法（Western blot）检测TG代谢相关蛋白固醇调节元件结合蛋白-1c（SREBP-1c）、乙酰辅酶Ａ羧化酶（ACC）、脂肪酸合成酶（FASN）、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPKα）、肉碱酯酰转移酶1（CPT-1）的相对表达水平。 结果 与阴性对照相比，Na₂SO₃各处理组脂肪细胞培养上清中FFA含量明显减少（P<0.001），脂联素的含量明显减少（P<0.01）。2.5 mmol/L Na₂SO₃可引起共培养HepG2细胞内TG含量增加（P<0.001）。Western blot结果显示，在单独培养组，与阴性对照相比，各浓度Na₂SO₃处理后，SREBP-1c、p-ACC、AMPKα、CPT-1无明显变化（P>0.05）；2.5 mmol/L Na₂SO₃处理后，ACC和FASN蛋白表达增高（P<0.05）。在共培养组中，与阴性对照相比，各浓度Na₂SO₃处理组ACC和AMPKα的蛋白表达均增高（P<0.05）。 结论 较低剂量Na₂SO₃暴露不会引起肝细胞内TG的增加。较高剂量的Na₂SO₃（2.5 mmol/L）可能通过对脂肪细胞脂联素分泌的抑制作用引起肝细胞中TG明显升高。

Abstract

Objective To investigate whether sodium sulfite（Na₂SO₃） affects lipid metabolism in hepatocytes by interfering with adiponectin secretion from adipocytes. Methods 3T3-L1 preadipocytes were induced to differentiate into mature adipocytes. Adipocytes， HepG2 cells， and their co-cultured cells were treated with complete medium（negative control）， different concentrations of Na₂SO₃（0.02， 0.1， 0.5， 2.5 mmol/L）， and 1 mmol/L oleic acid（OA， positive control）， respectively. The levels of free fatty acid（FFA） and adiponectin in adipocyte culture supernatants were measured using enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）， and triglyceride（TG） content was measured by the glycerol-3-phosphate oxidase-peroxidase（GPO-POD） method. Western blot was used to detect the relative expressions of TG metabolism-related proteins： sterol regulatory element-binding protein-1c（SREBP-1c）， acetyl-CoA carboxylase（ACC）， fatty acid synthase（FASN）， adenosine monophosphate-activated protein kinase（AMPKα）， and carnitine palmitoyltransferase 1（CPT-1）. Results Compared with negative control group， FFA levels in the adipocyte culture supernatant were significantly reduced in all Na₂SO₃ treatment groups（P<0.001）， and adiponectin levels were significantly decreased（P<0.01）. The 2.5 mmol/L Na₂SO₃ caused an increase in TG content in co-cultured HepG2 cells（P<0.001）. In HepG2 cells cultured alone， compared with the negative control， all concentrations of Na₂SO₃ did not significantly alter the expressions of SREBP-1c， p-ACC， AMPKα， and CPT-1（P>0.05）， and 2.5 mmol/L Na₂SO₃ increased ACC and FASN protein expressions（P<0.05）. In the co-cultured HepG2 cells， compared with the negative control， all concentrations of Na₂SO₃ increased protein expressions of ACC and AMPKα（P<0.05）. Conclusion Exposure to low doses of Na₂SO₃ does not increase TG in hepatocytes. High doses of Na₂SO₃（2.5 mmol/L） may significantly elevate TG level in hepatocytes by inhibiting adiponectin secretion from adipocytes.

Graphical abstract

关键词

亚硫酸钠 / 脂肪细胞 / HepG2细胞 / 细胞共培养 / 脂肪酸 / 脂联素 / 甘油三酯

Key words

sodium sulfite / adipocytes / HepG2 cells / cell co-culture / fatty acid / adiponectin / triglyceride

亚硫酸盐是食物加工中广泛使用的添加剂，由于它具有极强的还原性，在食品生产和加工过程中可被用作漂白剂、保鲜剂、稳定剂和抗氧化剂等^［1，2］。二氧化硫进入机体后一部分也可转化为亚硫酸盐。亚硫酸盐在食品生产和加工过程中发挥有益作用，但又对人体健康构成潜在威胁。研究发现亚硫酸盐可引起过敏性休克^［3］，可损伤人体神经系统^［4］、呼吸系统^［5］和内分泌系统^［6］，还可引起肝脏损伤^［7］。

本课题组前期动物实验显示亚硫酸钠（Na₂SO₃）染毒可使小鼠肝细胞内脂滴明显增加，提示亚硫酸盐暴露可能与肝细胞脂肪变性相关^［7］。肝脏脂肪变性的发生可源于肝内因素，也可源于肝外因素。本课题组近些年对Na₂SO₃引起肝细胞脂质代谢障碍的肝内因素进行了研究，结果显示单纯对肝细胞直接染毒，不能引起肝细胞中甘油三酯（TG）的明显积累^［8］，但可促进肝细胞载脂蛋白B100和极低密度脂蛋白（VLDL）的分泌增加^［9］。这提示动物实验中Na₂SO₃暴露后，肝脏脂肪变性的结果可能不是来自Na₂SO₃对肝脏的直接作用，而是另有原因。有研究表明，脂肪组织不仅能储存脂肪，还是一种复杂的内分泌器官，能够分泌脂联素和瘦素等多种细胞因子，对肝脏糖脂代谢发挥重要的调节作用^［10］。因此，我们推测Na₂SO₃可能通过抑制脂肪组织脂联素分泌或者抑制脂肪动员而导致肝细胞脂肪变性。本研究拟在前期研究基础上将脂肪细胞与HepG2细胞共同培养，检测共培养肝细胞内TG变化情况，探讨Na₂SO₃是否通过脂肪细胞的间接作用引起肝细胞脂肪变性，以明确Na₂SO₃暴露引起肝细胞脂肪变性的潜在分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂

小鼠3T3-L1前脂肪细胞（上海弘顺生物科技有限公司）；人肝癌细胞HepG2（中国科学院上海细胞生物研究所）；DMEM高糖培养基（HyClone）；小牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）；Na₂SO₃、油酸（oleic acid，OA）、胰蛋白酶（美国Sigma公司）；地塞米松（Dex）、牛胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（isobutylmethvlxanthine，IBMX）（Sigma-Aldrich）；BCA蛋白定量试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；AMPKα抗体、p-AMPKα抗体、ACC抗体、p-ACC抗体、FASN抗体 （Cell Signaling Technology，Inc.）；CPT-1抗体（Abcam plc）；SREBP-1c抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；β-actin抗体、二抗（山羊抗鼠IgG和山羊抗兔IgG）（武汉博士德生物工程有限公司）；甘油三酯酶法测定试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司）；FFA检测试剂盒（上海西唐生物科技有限公司）；脂联素检测试剂盒（武汉云克隆科技股份有限公司）。

1.2 前脂肪细胞的诱导分化

将前脂肪细胞接种于6孔板（5×10⁴ cell/cm²），用DMEM完全培养基培养。待细胞完全汇合48 h诱导分化，先用诱导分化培养基Ⅰ（含0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L地塞米松、10 mg/L胰岛素和10%小牛血清的DMEM完全培养基）培养细胞48 h，再用诱导分化培养基Ⅱ（含10 mg/L胰岛素和10%小牛血清的DMEM完全培养基）培养细胞48 h，之后使用DMEM完全培养基培养细胞96 h，获得成熟脂肪细胞。成熟脂肪细胞鉴定方法为：吸弃培养基，1×PBS清洗3次，4%多聚甲醛溶液固定20 min，1×PBS清洗2次，加入油红O，静置染色10 min，蒸馏水清洗，加苏木素复染核20 s，蒸馏水清洗，倒置显微镜观察。

1.3 细胞染毒及共培养

1.3.1 脂肪细胞染毒

将诱导分化成熟的脂肪细胞分为6个不同处理组，每组2个复孔，独立重复3次，给予不同浓度Na₂SO₃（0.02，0.1，0.5，2.5 mmol/L）染毒12 h，并设阳性对照组（1 mmol/L OA）和阴性对照组（完全培养基），收集各处理组培养上清用于脂肪细胞脂联素等指标的测定，或进行肝细胞的共培养处理^［11］。

1.3.2 肝细胞与脂肪细胞共培养

将对数生长期的HepG2细胞接种在6孔板（5×10⁴个/cm²），于5% CO₂、37 ℃培养，待细胞贴壁达60%时，吸弃旧培养基，将按1.3.1分组处理后收集的培养上清分别加入HepG2细胞中共培养24 h，即共培养组。

1.3.3 肝细胞单独培养

将对数生长期的HepG2细胞接种在6孔板（5×10⁴个/cm²），于5% CO₂、37 ℃培养，待细胞贴壁达60%时，加入不同浓度的Na₂SO₃（0.02，0.1，0.5，2.5 mmol/L）单独处理HepG2细胞24 h，即单独培养组。

1.4 脂肪细胞培养上清中游离脂肪酸、脂联素、甘油三酯含量的测定

Na₂SO₃染毒脂肪细胞12 h，收集脂肪细胞培养上清，以2 000 r/min、4 ℃离心10 min，收集上清液。测定FFA时，将标准品和脂肪细胞上清样品30 μL加于96孔板，按照试剂盒说明每孔加入100 μL工作液R1b，37 ℃恒温孵育10 min，每孔加入200 μL工作液R2c，37 ℃恒温孵育10 min，用酶标仪在波长550 nm处测定吸光度（OD值）。测定脂联素时，取上清50 μL，按试剂盒说明书进行操作，用酶标仪在550 nm处测定OD值。测定TG时，将标准品和脂肪细胞上清样品10 μL加于96孔板，每孔加入10 μL蒸馏水，190 μL的工作液，37 ℃恒温孵育10 min，用酶标仪在波长450 nm处测定OD值，根据标准曲线计算样品中TG的含量。

1.5 肝细胞内甘油三酯含量的测定

细胞染毒完成后弃上清，PBS洗细胞3次，每孔加入200 μL细胞裂解液，冰浴震荡30 min，用细胞刮收集细胞到1.5 mL离心管中，用有机抽提法提取细胞内TG，提取及测定方法参见文献^［12］。

1.6 肝细胞脂肪代谢相关蛋白表达水平的测定

采用Western blot法检测肝细胞内蛋白表达水平。细胞染毒24 h，用细胞裂解液处理HepG2细胞。用BCA法定量蛋白，取蛋白样品40 μg上样，10%分离胶、5%浓缩胶SDS-PAGE分离蛋白，转硝酸纤维素膜。5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别加相应一抗（AMPKα、p-AMPKα、ACC、p-ACC、FASN、SREBP-1c、CPT-1、β-actin稀释度1∶1 000），4 ℃孵育过夜。PBST室温洗涤3次， 加二抗（羊抗兔1∶5 000、羊抗鼠1∶5 000）室温孵育2 h，PBST洗涤3次，用ECL发光法检测蛋白条带。胶片显影后通过Image-Pro Plus 6.0软件对杂交图光密度值半定量分析。

1.7 统计学分析

实验数据结果都以均数±标准差（X±S）表示。用SPSS 24.0进行统计学分析，多组间比较先行方差齐性检验再进行单因素方差分析，各组间两两比较采用Dunnet-t检验。以P<0.05作为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 前脂肪细胞成熟化诱导结果

前脂肪细胞贴壁生长，呈梭形，突触相交联，细胞内无脂滴（见图1A）。经诱导分化后由于细胞内脂滴积聚，显微镜下可观察到细胞变圆、突触变短、细胞间隙变大（见图1B）。油红O染色后，在镜下可观察到细胞内出现大量橘红色脂肪颗粒（见图1C）。

2.2 Na₂SO₃对脂肪细胞FFA、脂联素和TG分泌水平的影响

与阴性对照组相比，除0.02 mmol/L Na₂SO₃组外，其余各浓度Na₂SO₃处理组脂肪细胞培养上清中FFA浓度均显著降低（P<0.001，见表1），提示较高浓度Na₂SO₃可抑制脂肪细胞FFA的分泌。与阴性对照组相比，各Na₂SO₃处理组脂肪细胞培养上清中脂联素水平明显降低（P<0.01，见表1），其中2.5 mmol/L Na₂SO₃组脂联素降低最为明显，说明Na₂SO₃可抑制脂肪细胞脂联素的分泌，且浓度越高抑制作用越明显。与阴性对照组相比，各Na₂SO₃处理组脂肪细胞培养上清中TG的浓度均无明显变化（P>0.05，见表1），提示Na₂SO₃对脂肪细胞TG的分泌无显著影响。

2.3 不同浓度Na₂SO₃对单独培养组和共培养组肝细胞内TG含量的影响

与阴性对照相比，各浓度Na₂SO₃处理后，单独培养肝细胞内TG含量未见明显改变（P>0.05）；与阴性对照相比，2.5 mmol/L Na₂SO₃可引起共培养肝细胞内TG含量的显著增加（P<0.001，见表2），提示Na₂SO₃可通过脂肪细胞的作用使肝细胞内TG的含量升高。

2.4 不同浓度Na₂SO₃对单独培养组和共培养组肝细胞脂肪合成相关蛋白表达水平的影响

在单独培养肝细胞中，与阴性对照组相比，各Na₂SO₃处理组SREBP-1c的表达水平均无明显变化（P>0.05）；除0.5 mmol/L Na₂SO₃组外，0.02，0.1，2.5 mmol/L Na₂SO₃组ACC表达均显著上调（P<0.05），而各Na₂SO₃处理组p-ACC的表达均无明显变化（P>0.05）；2.5 mmol/L Na₂SO₃组FASN的表达水平显著上调（P<0.05，见图2）。

在共培养肝细胞中，与阴性对照组相比，各Na₂SO₃处理组SREBP-1c、p-ACC和FASN的表达水平均无显著差异（P>0.05），但ACC表达水平普遍升高（P<0.05，见图2）。

2.5 不同浓度Na₂SO₃对单独培养组和共培养组肝细胞脂肪酸分解相关蛋白表达水平的影响

与阴性对照组相比，各Na₂SO₃处理组AMPKα的表达水平在单独培养细胞中均无明显变化（P>0.05），在共培养细胞中表达均增高（P<0.05，见图3）；在单独培养和共培养细胞中均未检测到p-AMPKα的表达。与阴性对照组相比，各Na₂SO₃处理组单独培养和共培养细胞中CPT-1的表达水平均无显著变化（P> 0.05）。

3 讨论

本课题组前期研究显示SO₂染毒可使小鼠肝细胞中脂滴增加^［7］，但体外实验显示用Na₂SO₃直接染毒肝细胞并不能导致肝细胞中TG增加^［8］。从生理学角度分析，腹腔中脂肪细胞分泌的各种细胞因子，如脂联素、TNF-α和瘦素等可直接通过门静脉进入肝脏，对肝脏脂代谢产生显著影响^［13］。因此我们推测Na₂SO₃可能通过脂肪细胞的间接作用对肝细胞TG代谢产生影响。本研究结果显示，各浓度Na₂SO₃处理单独培养肝细胞，TG含量均未明显改变，这与本课题组之前的研究结果相一致^［8］；肝细胞中AMPKα、SREBP-1c、p-ACC和CPT-1表达均无明显变化，而ACC和FASN表达明显增加，提示Na₂SO₃可能在一定程度上促进肝细胞脂肪酸合成。但单独培养未观察到肝细胞内TG水平积累。其原因可能是Na₂SO₃除促进肝细胞脂肪酸、TG合成外，可能还会促进TG的分泌外排^［9］。然而，2.5 mmol/L Na₂SO₃可引起与脂肪细胞共培养的HepG2细胞内TG含量明显增加，提示Na₂SO₃暴露引起肝细胞脂肪变性可能与脂肪细胞的脂肪动员改变或细胞因子分泌异常有关。

有研究显示，在饥饿情况下，体内FFA可由脂肪细胞中的TG经脂肪酶水解而来，释放入血后被机体利用，为肝脏、心脏等器官提供代谢所需能量^［14］。本研究显示，与阴性对照比较，不同浓度Na₂SO₃接触12 h，脂肪细胞的培养上清中FFA明显降低，表明Na₂SO₃处理可能会抑制机体脂肪动员，导致肝脏供能物质减少。而供能物质的减少可致肝细胞内ATP生成减少，进而促进AMPKα表达增加。本研究显示，与脂肪细胞共培养的肝细胞中AMPKα蛋白表达水平均明显增高，二者相互印证，共同提示Na₂SO₃对肝细胞TG代谢的影响与脂肪组织相关。

白色脂肪组织可分泌脂联素，作为一种重要的细胞因子，脂联素通过与脂联素受体结合而发挥生物学作用^［15］。脂联素能调节肝脏的糖脂代谢，增强胰岛素敏感性^［16］，减少肝脏TG含量^［17］，而脂联素水平的降低可直接引起肝脏TG积累，是动脉粥样硬化及肝功能障碍的危险因素^{［18，19］}。本研究显示Na₂SO₃染毒后各处理组脂肪细胞的培养上清中脂联素显著降低，其中2.5 mmol/L Na₂SO₃组降低最为明显。同时，2.5 mmol/L Na₂SO₃处理后与脂肪细胞共培养的肝细胞内TG含量明显升高，ACC蛋白表达显著升高。故推测Na₂SO₃接触后肝细胞内TG积累可能与脂肪细胞脂联素的分泌明显减少有关，但其详尽机制需进一步研究。

综上所述，高剂量Na₂SO₃诱导肝细胞TG蓄积可能与脂肪细胞脂联素分泌减少有关。然而，本研究还存在一定局限性：①肝细胞脂肪蓄积的判定仅依赖TG含量的定量生化测定，没有油红O染色的形态学的佐证；②研究仅聚焦于脂联素水平变化，未纳入瘦素等其他调控肝脏脂肪代谢的脂肪细胞因子，在因果归因上证据链尚不完整。后续研究将进一步探讨Na₂SO₃对瘦素等其他脂肪细胞相关细胞因子的调控作用，明确脂联素、瘦素等分泌异常与肝细胞TG蓄积是否存在因果关联，为揭示Na₂SO₃的肝损伤机制提供更充分的实验证据。

参考文献

[1] D'Amore T， Di Taranto A， Berardi G， et al. Sulfites in meat： occurrence， activity， toxicity， regulation， and detection. A comprehensive review［J］. Compr Rev Food Sci Food Saf， 2020， 19（5）： 2701-2720.

[2] Ren Y， Huang J， Wang X， et al. Effects of sulfite treatment on the quality of black fungus［J］. Food Chem， 2022， 385：132685.

[3] Kessels IJ， Gutermuth J， Grosber M. Successful treatment of anaphylaxis to sulfites with sulfite⁃containing adrenaline auto⁃injector［J］. Allergo J. Int.， 2025， 34（4）：1-3.

[4] Silva M， Gama J， Pinto N， et al. Sulfite concentration and the occurrence of headache in young adults： a prospective study［J］. Eur J Clin Nutr， 2019， 73（9）：1316-1322.

[5] Aldabayan YS. Effect of artificial food additives on lung health： an overview［J］. Medicina （Kaunas）， 2025， 61（4）：684.

[6] Wu S， Zhang X， Lu Y， et al. SO₂ derivatives impair ovarian function by inhibiting Serpine1/NF⁃κB pathway⁃mediated ovarian granulosa cell survival［J］. J Hazard Mater， 2025， 487：137116.

[7] 白剑英， 孟紫强. 二氧化硫对肝脏组织学结构的影响［J］. 中华病理学杂志， 2004， 33（2）：74-76.

[8] 赵春燕， 白剑英. 亚硫酸钠对肝细胞内甘油三酯含量和ARF⁃1、COP I表达的影响［D］. 太原：山西医科大学，2012.

[9] 张艳， 白剑英， 雷佩玉， 等. 亚硫酸钠对HL⁃7702细胞极低密度脂蛋白组装分泌和内质网应激的影响［J］. 癌变·畸变·突变， 2016， 28（3）：169-173.

[10] Harwood HJ Jr. The adipocyte as an endocrine organ in the regulation of metabolic homeostasis［J］. Neuropharmacology， 2012， 63（1）：57-75.

[11] 常艳， 魏伟. 细胞共培养及其应用的研究进展［J］.中国临床药理学与治疗学， 2009， 14（7）：827-832.

[12] 雷佩玉， 白剑英. 亚硫酸钠对HL⁃7702肝细胞极低密度脂蛋白组装途径的影响［D］. 太原： 山西医科大学， 2012.

[13] Shih PH， Shiue SJ， Chen CN， et al. Fucoidan and Fucoxanthin attenuate hepatic steatosis and inflammation of NAFLD through modulation of Leptin/Adiponectin axis［J］. Mar Drugs， 2021，19（3）：148.

[14] Zechner R， Zimmermann R， Eichmann TO， et al. FAT SIGNALS： lipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling［J］. Cell Metab， 2012， 15（3）：279-291.

[15] Fang H， Judd RL. Adiponectin regulation and function［J］. Compr Physiol， 2018， 8（3）：1031-1063.

[16] Yamauchi T， Kamon J， Minokoshi Y， et al. Adiponectin stimulates glucose utilizationand fatty⁃acid oxidation by activating AMP⁃activated protein kinase［J］. Nat Med， 2002， 8（11）：1288-1295.

[17] 阳琰， 邓华聪， 龙健， 等. 不同浓度脂联素对HepG2细胞内甘油三酯含量的影响及其机制［J］.吉林大学学报（医学版）， 2013， 39（2）：195-198.

[18] Lee Y， Kim BR， Kang GH， et al. The effects of PPAR agonists on atherosclerosis and nonalcoholic fatty liver disease in ApoE^-/- FXR^-/- mice［J］. Endocrinol Metab（Seoul）， 2021， 36（6）：1243-1253.

[19] Khoramipour K， Chamari K， Hekmatikar AA， et al. Adiponectin： structure， physiological functions， role in diseases， and effects of nutrition［J］. Nutrients， 2021， 13（4）：1180.

基金资助

国家自然科学基金资助项目(30972445)

山西省回国留学人员科研资助项目(2009-53)