利用CRISPR/Cas13d抑制肠道病毒71型感染

摘要

肠道病毒71型(enterovirus 71, EV71)感染会导致手足口病和危及生命的神经系统疾病,目前尚无针对EV71的抗病毒药物可用。为了利用成簇规则间隔的短回文重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein, CRISPR/Cas)系统抑制EV71感染,本研究选择CRISPR/Cas13d系统,构建U6启动子驱动的向导RNA (guide RNA, g RNA)、EF-1α启动子驱动的Cas13d和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的表达载体;将不同g RNA质粒分别转染人胚肾细胞293T (HEK293T)后感染EV71,通过实时荧光定量PCR检测EV71 VP1 m RNA的含量,采用Western-blot检测EV71 VP1蛋白的表达量,利用流式细胞术检测GFP蛋白的含量,运用CCK-8法检测细胞活力。结果显示,在5个靶向EV71基因组不同位置的g RNA质粒中,有4个可以显著抑制EV71 VP1 m RNA和蛋白质表达,其中1个质粒具有较强的旁切活性,但是所有的质粒均没有表现出显著的细胞毒性。实验结果初步表明,可以利用CRISPR/Cas13d系统抑制EV71感染,但是需要选择合适的g RNA,以保障抗病毒作用和避免细胞毒性。

关键词

肠道病毒71型(EV71) / 成簇规则间隔的短回文重复序列及其相关蛋白13d(CRISPR/Cas13d) / 抗病毒活性 / 细胞毒性