miR-100-5p对急性髓系白血病细胞增殖及凋亡的影响及其分子机制

Effects of miR-100-5p on proliferation and apoptosis of acute myeloid leukemia cells and the underlying molecular mechanism

摘要

目的 探讨微小RNA（miRNA, miR）-100-5p靶向Tribbles同源蛋白1（Tribbles pseudokinase 1, TRIB1）对急性髓系白血病细胞增殖及凋亡活性的影响。 方法 收集16例健康体检儿童（对照组）和16例AML患儿（AML组）外周血。将HL-60细胞分为空白组、mimic NC组、miR-100-5p mimic组、si-NC组、si-TRIB1组、miR-100-5p mimic+TRIB1过表达质粒阴性对照（OE-NC）组、miR-100-5p mimic+TRIB1过表达质粒（OE-TRIB1）组。采用实时荧光定量PCR检测外周血和HL-60细胞中miR-100-5p、TRIB1 mRNA表达；5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2'-deoxyuridine, EdU）染色、CCK-8法检测HL-60细胞增殖；流式细胞术检测HL-60细胞凋亡；Western blot法检测HL-60细胞中TRIB1、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）、p53、程序性死亡受体-1（programmed cell death protein 1, PD-1）、程序性死亡受体-配体1（programmed death-ligand 1, PD-L1）蛋白表达；双萤光素酶报告基因实验验证miR-100-5p与TRIB1靶向关系。 结果 与对照组比较，AML组外周血中miR-100-5p表达降低，TRIB1 mRNA表达升高（P<0.05）。与空白组、mimic NC组比较，miR-100-5p mimic组miR-100-5p表达、细胞凋亡率、p53蛋白表达升高，TRIB1 mRNA表达、EdU阳性率、光密度（optical density, OD）₄₅₀值及TRIB1、PCNA、PD-1、PD-L1蛋白表达降低（P<0.05）；与空白组、si-NC组比较，si-TRIB1组TRIB1 mRNA表达、EdU阳性率、OD₄₅₀值及TRIB1、PCNA、PD-1、PD-L1蛋白表达降低，细胞凋亡率、p53蛋白表达升高（P<0.05）；与miR-100-5p mimic组、miR-100-5p mimic+OE-NC组比较，miR-100-5p mimic+OE-TRIB1组TRIB1 mRNA表达、EdU阳性率、OD₄₅₀值及TRIB1、PCNA、PD-1、PD-L1蛋白表达升高，细胞凋亡率、p53蛋白表达降低（P<0.05）；TRIB1-WT + miR-100-5p mimic组萤光素酶活性低于TRIB1-WT + mimic NC组（P<0.05）。 结论 过表达miR-100-5p可通过下调TRIB1抑制HL-60细胞增殖，诱导细胞凋亡。

Abstract

Objective To investigate whether miR-100-5p regulates the proliferation and apoptosis of acute myeloid leukemia (AML) cells by targeting Tribbles pseudokinase 1 (TRIB1). Methods Peripheral blood was collected from 16 healthy children (control group) and 16 children with AML (AML group). HL-60 cells were divided into seven groups: blank, mimic negative control (mimic NC), miR-100-5p mimic, small interfering RNA negative control (si-NC), si-TRIB1, miR-100-5p mimic + TRIB1 overexpression plasmid negative control (OE-NC), and miR-100-5p mimic + TRIB1 overexpression plasmid (OE-TRIB1). The expression of miR-100-5p and TRIB1 mRNA in peripheral blood and HL-60 cells was detected by quantitative real-time PCR. Cell proliferation was assessed by 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) staining and the cell counting kit-8 (CCK-8) assay (OD₄₅₀). Apoptosis was analyzed by flow cytometry. Protein levels of TRIB1, proliferating cell nuclear antigen (PCNA), p53, programmed cell death protein 1 (PD-1), and programmed death-ligand 1 (PD-L1) were determined by Western blot. The targeting relationship between miR-100-5p and TRIB1 was validated by a dual-luciferase reporter assay. Results Compared with the control group, miR-100-5p expression was decreased and TRIB1 mRNA expression was increased in the peripheral blood of the AML group (P<0.05). Compared with the blank and mimic NC groups, the miR-100-5p mimic group showed higher miR-100-5p expression, apoptosis rate, and p53 protein, and lower TRIB1 mRNA expression, EdU-positive rate, OD₄₅₀ value, and TRIB1, PCNA, PD-1, and PD-L1 proteins (P<0.05). Compared with the blank and si-NC groups, the si-TRIB1 group exhibited reduced TRIB1 mRNA expression, EdU-positive rate, OD₄₅₀ value, and TRIB1, PCNA, PD-1, and PD-L1 proteins, together with increased apoptosis rate and p53 protein (P<0.05). Compared with the miR-100-5p mimic and miR-100-5p mimic + OE-NC groups, the miR-100-5p mimic + OE-TRIB1 group had elevated TRIB1 mRNA expression, EdU-positive rate, OD₄₅₀ value, and TRIB1, PCNA, PD-1, and PD-L1 proteins, and reduced apoptosis rate and p53 protein (P<0.05). Compared with the TRIB1-WT + mimic NC group, luciferase activity was decreased in the TRIB1-WT + miR-100-5p mimic group (P<0.05). Conclusions Overexpression of miR-100-5p inhibits proliferation and induces apoptosis of HL-60 cells by downregulating TRIB1.

Graphical abstract

关键词

微小RNA-100-5p / Tribbles同源蛋白1 / 急性髓系白血病 / 增殖 / 凋亡 / HL-60细胞

Key words

MiR-100-5p / Tribbles pseudokinase 1 / Acute myeloid leukemia / Proliferation / Apoptosis / HL-60 cell

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）是一种也可发生于儿童的血液系统肿瘤，具有高度异质性，其特征是未分化髓系原始细胞在骨髓和外周血中积聚，导致细胞无限增殖以及细胞凋亡受到抑制^［1-3］。近年来化疗和其他药物治疗取得了重大进展，在一定程度上改善了AML临床结果，但由于耐药性的快速发展和治疗后的高复发率，AML患儿的长期生存率仍然很低^［4］。因此，探索影响AML细胞增殖、凋亡的分子机制对于AML的治疗意义重大。越来越多的研究表明，微小RNA（microRNA, miR）-100-5p通过抑制蛋白质的翻译或者促进mRNA的降解，来参与多种生理和病理过程^［5］。如过表达miR-100-5p通过靶向哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制AML细胞增殖^［6］；上调miR-100可抑制儿童急性淋巴细胞白血病细胞增殖并促进细胞凋亡^［7］。但关于miR-100-5p影响AML细胞增殖及凋亡具体分子机制尚不清楚。Tribbles同源蛋白1（Tribbles pseudokinase 1, TRIB1）作为一种假激酶，通过影响蛋白稳定性、细胞周期进程等方式在肿瘤发生、发展中发挥复杂作用^［8］。研究显示，TRIB1过表达通过调节同源框A9基因转录促进AML细胞增殖，抑制细胞凋亡^［9］，且miR-100-5p与TRIB1可结合并影响乳腺癌进展^［10］，但miR-100-5p影响AML细胞增殖及凋亡是否有TRIB1参与尚不清楚。本研究旨在探究miR-100-5p对AML细胞增殖及凋亡的影响及分子机制。

1 材料与方法

1.1　外周血收集及细胞来源

收集2022年6月—2024年6月在滕州市中心人民医院就诊的16例AML（WHO分型M1型2例、M2型6例、M3型4例、M4型2例、M5型2例。未经过任何形式的治疗）患儿的外周血作为AML组，另取同期在本院进行体检的16例健康儿童的外周血作为对照组。收集的外周血标本经离心获得血清后置于-80℃保存。本研究已获得参与者监护人的书面知情同意，并通过本院伦理委员会批准（伦理审批号：2021-0015）。

人源髓系白血病细胞系HL-60购自上海弘顺生物科技有限公司。

1.2　主要试剂

miR-100-5p模拟物（miR-100-5p mimic；序列为5'-AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG-3'）及模拟物阴性对照（mimic negative control, mimic NC；序列为5'-UUCUCCGAACGUCACGUTT-3'）、TRIB1小干扰RNA（small interfering RNA-TRIB1, si-TRIB1；序列为5'-GACTCAGAAATAGGAACTTCA-3'）及小干扰RNA阴性对照（small interfering RNA-negative control, si-NC；序列为5'-GACTCAGTTTTACCTTCTTCA-3'）由广州基迪奥生物科技有限公司合成，TRIB1过表达（over expression-TRIB1, OE-TRIB1）质粒及其阴性对照（over expression-negative control, OE-NC）质粒由武汉金开瑞生物工程有限公司合成。其余试剂包括PrimeScript RT试剂盒（北京智杰方远科技公司），SYBR Green PCR Master Mix（美国MCE公司），5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2'-deoxyuridine, EdU）试剂盒（上海东寰生物公司），CCK-8试剂盒（碧云天生物技术有限公司），Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（上海泽叶生物科技公司），兔源一抗TRIB1、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）、GAPDH、p53、程序性死亡受体-1（programmed cell death protein 1, PD-1）、程序性死亡受体-配体1（programmed death-ligand 1, PD-L1）及二抗（英国Abcam公司）。

1.3　细胞分组

HL-60细胞在含10% FBS的RPMI-1640培养基中，于37℃、5% CO₂条件下悬浮培养。细胞分为空白组、mimic NC组、miR-100-5p mimic组、si-NC组、si-TRIB1组、miR-100-5p mimic+OE-NC组、miR-100-5p mimic+OE-TRIB1组。空白组HL-60细胞正常培养；mimic NC组、miR-100-5p mimic组、si-NC组、si-TRIB1组HL-60细胞分别转染50 nmol/L mimic NC、50 nmol/L miR-100-5p mimic、30 nmol/L si-NC、30 nmol/L si-TRIB1 24 h；miR-100-5p mimic+OE-NC组HL-60细胞转染50 nmol/L miR-100-5p mimic和2 μg/mL pcDNA 24 h；miR-100-5p mimic+OE-TRIB1组HL-60细胞转染50 nmol/L miR-100-5p mimic和2 μg/mL pcDNA-TRIB1 24 h。通过qRT-PCR法检测各转染组HL-60细胞中miR-100-5p及TRIB1 mRNA表达水平，评估是否转染成功。

1.4　外周血及HL-60细胞中miR-100-5p及TRIB1 mRNA表达检测

采用TRIzol试剂裂解外周血样本或细胞，加入氯仿后离心分相；收集上层水相，经异丙醇沉淀RNA、75%乙醇洗涤后，将RNA溶解于去离子水。随后，使用PrimeScript RT试剂盒进行反转录，合成cDNA。最后，采用SYBR Green PCR Master Mix进行qRT-PCR扩增，设置标准程序（95℃预变性，40个循环的95℃变性/60℃退火延伸），并通过熔解曲线验证扩增特异性。通过2^-△△Ct法计算miR-100-5p（以U6为内参）的相对表达量及TRIB1 mRNA（以GAPDH为内参）的相对表达量。引物序列为：miR-100-5p正向引物：5'-GTGTTCAAGCCTAGATGCCCAA-3'，反向引物：5'-GCATCTAGGCTTGAACACGCC-3'；TRIB1正向引物：5'-TTAGTTCCTTCTTCTGCTA-3'，反向引物：5'-AGTCATTATCTGGTTGGTA-3'；U6正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物：5'-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；GAPDH正向引物：5'-CATGGCCTTCCGTGTTCCTA-3'，反向引物：5'-TACTTGGCAGGTTTCTCCAGG-3'。

1.5　EdU染色检测细胞增殖

各组HL-60细胞以2×10⁴个细胞/孔的密度接种于6孔板，与50 μmol/L EdU溶液共孵育1 h后，加入500 μL 40 g/L多聚甲醛，室温固定20 min。加入0.5% Triton X-100孵育10 min后，用4',6-二氨基-2-苯基吲哚对细胞核进行染色20 min。PBS洗涤3次后，采用倒置荧光显微镜对染色细胞进行成像，并计算EdU阳性率。EdU阳性率（%）=（EdU阳性细胞数/总细胞数）×100%。

1.6　CCK-8检测细胞增殖

HL-60细胞以2×10⁴个细胞/孔的密度接种于96孔板，每孔体积为200 μL。待细胞贴壁后，按1.3所述分组处理后，每孔加入10 μL CCK-8试剂孵育2 h，于450 nm波长检测光密度（optical density, OD）值。OD₄₅₀值越大，表明细胞增殖能力越强。

1.7　细胞凋亡率检测

HL-60细胞以6×10⁵个细胞/孔的密度接种于12孔板，培养12~16 h，待细胞进入对数生长期并适应环境后收集，PBS洗涤2次。重悬细胞于100 μL 1×Binding Buffer，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI（50 μg/mL），室温避光孵育15 min。随后加入400 μL Binding Buffer混匀，立即上机行流式细胞术检测，计算细胞凋亡率。凋亡率（%）=［Annexin V⁺PI⁻（早期凋亡）细胞数+Annexin V⁺PI⁺（晚期凋亡/坏死）细胞数］/总细胞数×100%。

1.8　Western blot检测TRIB1、PCNA、p53、PD-1、PD-L1蛋白表达

采用RIPA裂解缓冲液提取各组HL-60细胞总蛋白，通过BCA试剂盒测定蛋白浓度。取等量蛋白样品（30 μg）行12% SDS-PAGE分离，转至PVDF膜。随后，将膜在含5%脱脂牛奶的PBS中封闭1 h，分别与一抗TRIB1（1∶3 000）、PCNA（1∶2 000）、p53（1∶4 000）、PD-1（1∶3 000）、PD-L1（1∶2 000）、GAPDH（1∶5 000）于4℃孵育过夜。次日经二抗（1∶5 000）孵育1 h后。用ECL试剂盒显影。采用Image J软件分析蛋白条带灰度值。蛋白相对表达量=目标蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

1.9　双萤光素酶报告基因实验

通过miRNA靶点预测工具starbase网站（https://starbase.sysu.edu.cn）鉴定miR-100-5p在TRIB1 3'UTR区的结合位点，设计TRIB1野生型（TRIB1-WT）序列和TRIB1突变型（TRIB1-MUT）序列，克隆至pGL3-Basic载体的萤光素酶基因下游，通过酶切鉴定载体构建成功。将构建成功的双萤光素酶报告基因载体分别与50 nmol/L miR-100-5p mimic（TRIB1-WT+miR-100-5p mimic组、TRIB1-MUT+miR-100-5p mimic组）或50 nmol/L mimic NC（TRIB1-WT+mimic NC组、TRIB1-MUT+mimic NC组）共转染至HL-60细胞，转染24 h后弃去培养基，每孔加入100 μL 1×Passive Lysis Buffer，室温裂解15 min。取20 μL裂解液，使用双萤光素酶报告基因检测系统进行检测：先加入100 μL Luciferase Assay Reagent Ⅱ检测萤火虫萤光素酶活性并记录数据，再加入100 μL Stop & Glo^® Reagent淬灭并检测海肾萤光素酶活性。最后计算萤火虫萤光素酶/海肾萤光素酶萤光值比值。

1.10　统计学分析

采用GraphPad Prism 8软件对数据进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（\overline{x}\pm s）表示。两组间比较采用两样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1　健康儿童、AML患儿miR-100-5p及TRIB1 mRNA表达比较

与对照组比较，AML组患儿外周血中miR-100-5p表达降低（分别为0.23±0.04、1.00±0.00；t=77.000，P<0.001），TRIB1 mRNA表达升高（分别为1.75±0.19、1.00±0.00；t=15.789，P<0.001）。

2.2　上调miR-100-5p或沉默TRIB1对HL-60细胞miR-100-5p及TRIB1 mRNA表达的影响

与空白组、mimic NC组比较，miR-100-5p mimic组miR-100-5p表达升高，TRIB1 mRNA表达降低（P<0.05）；与空白组、si-NC组比较，si-TRIB1组TRIB1 mRNA表达降低（P<0.05）；与miR-100-5p mimic组、miR-100-5p mimic+OE-NC组比较，miR-100-5p mimic+OE-TRIB1组TRIB1 mRNA表达升高（P<0.05）。见表1。

2.3　上调miR-100-5p或沉默TRIB1对HL-60细胞增殖的影响

miR-100-5p mimic组EdU阳性率、OD₄₅₀值低于mimic NC组和空白组（P<0.05）；si-TRIB1组EdU阳性率、OD₄₅₀值低于si-NC组和空白组（P<0.05）；与miR-100-5p mimic组、miR-100-5p mimic+OE-NC组比较，miR-100-5p mimic+OE-TRIB1组HL-60细胞EdU阳性率、OD₄₅₀值升高（P<0.05）。见表2、图1。

2.4　上调miR-100-5p或沉默TRIB1对HL-60细胞凋亡的影响

miR-100-5p mimic组（30.0%±1.6%）细胞凋亡率高于mimic NC组（8.0%±0.5%）和空白组（8.0%±0.4%）（P<0.05）；si-TRIB1组（32.3%±1.8%）细胞凋亡率高于si-NC组（7.9%±0.5%）和空白组（P<0.05）；与miR-100-5p mimic组、miR-100-5p mimic+OE-NC组（28.8%±1.5%）比较，miR-100-5p mimic+OE-TRIB1组（15.6%±0.9%）细胞凋亡率降低（P<0.05）；7组细胞凋亡率比较差异有统计学意义（F=566.100，P<0.001）。见图2。

2.5　上调miR-100-5p或沉默TRIB1对HL-60细胞中TRIB1、PCNA、p53、PD-1、PD-L1蛋白表达的影响

与空白组、mimic NC组比较，miR-100-5p mimic组HL-60细胞中TRIB1、PCNA、PD-1、PD-L1蛋白表达降低，p53蛋白表达升高（P<0.05）；与空白组、si-NC组比较，si-TRIB1组HL-60细胞中TRIB1、PCNA、PD-1、PD-L1蛋白表达降低，p53蛋白表达升高（P<0.05）；与miR-100-5p mimic组、miR-100-5p mimic+OE-NC组比较，miR-100-5p mimic+OE-TRIB1组HL-60细胞中TRIB1、PCNA、PD-1、PD-L1蛋白表达升高，p53蛋白表达降低（P<0.05），见表3、图3。

2.6　miR-100-5p靶向调控TRIB1验证

TRIB1与miR-100-5p可结合，见图4。TRIB1-WT+miR-100-5p mimic组萤光素酶活性低于TRIB1-WT+mimic NC组（分别0.336±0.062、1.011±0.032；t=23.698，P<0.001）；与TRIB1-MUT+mimic NC组（0.989±0.034）比较，TRIB1-MUT+miR-100-5p mimic组（0.992±0.028）萤光素酶活性差异无统计学意义（t=0.167，P=0.871）。

3 讨论

AML是由于未成熟髓系细胞的异常增殖和细胞凋亡受损，导致造血系统受到抑制所致^［11］。目前，AML的主要治疗方法还不能明显改善AML患儿预后^［12］。因此，深入探究调控AML细胞增殖与凋亡的分子机制具有重要意义。

miRNA在进化上具有保守性，其异常表达存在于AML等多种恶性肿瘤中，并可影响肿瘤细胞的生物学行为^［13］。miR-100-5p作为miR-100家族的重要成员在进化上高度保守，其在多种肿瘤中存在异常表达，且可调控肿瘤细胞生物学行为^［14］。例如，过表达miR-100-5p可抑制甲状腺癌细胞增殖并诱导细胞凋亡^［15］；过表达miR-100-5p可在体外和体内抑制脊索瘤生长^［16］；miR-100上调可抑制急性淋巴细胞白血病细胞增殖^［17］。本研究检测了健康儿童及AML患儿外周血中miR-100-5p表达水平，结果显示，与对照组比较，AML组患儿外周血miR-100-5p表达降低，提示其在AML组患儿体内呈异常下调状态，且可能与AML患儿预后不良相关，有待大样本临床研究进一步验证。以人髓系白血病细胞系HL-60为研究对象进行过表达转染实验，结果表明，上调miR-100-5p表达可抑制HL-60细胞增殖并诱导凋亡。此外，PCNA可环绕DNA并固定DNA聚合酶以维持DNA持续合成，进而增强细胞增殖能力^［18］；p53作为序列特异性转录因子，其表达上调可触发细胞凋亡^［19］。本研究发现，与空白组、mimic NC组比较，miR-100-5p mimic组HL-60细胞中PCNA蛋白表达降低，p53蛋白表达升高。提示miR-100-5p有望成为AML干预的潜在有效靶点。

miRNA可通过直接靶向mRNA的3'-非翻译区下调基因表达，并破坏mRNA稳定性^［20-21］。为进一步探究过表达miR-100-5p抑制HL-60细胞增殖并诱导细胞凋亡的分子机制，本研究证实TRIB1为miR-100-5p的靶基因。TRIB1作为致癌基因，在多种恶性肿瘤中高表达并推动肿瘤恶性进展^［22］。例如，在唐氏综合征Ts1Cje小鼠模型中，TRIB1过表达可促进AML发生发展^［23］；敲低TRIB1能抑制视网膜母细胞瘤细胞增殖和克隆形成，并促进细胞凋亡^［24］。本研究结果显示，AML患儿外周血中TRIB1 mRNA呈高表达状态；敲低TRIB1后，HL-60细胞增殖能力减弱，凋亡能力增强；且过表达miR-100-5p可下调HL-60细胞中TRIB1 mRNA及蛋白表达。据此推测，上调miR-100-5p可能通过下调TRIB1表达抑制HL-60细胞增殖，促进细胞凋亡。为验证该推测，本研究进一步实验结果显示，过表达TRIB1逆转了过表达miR-100-5p对HL-60细胞增殖及凋亡的影响，证实上调miR-100-5p可能通过降低TRIB1表达抑制HL-60细胞增殖，促进细胞凋亡。此外，PD-1作为重要免疫抑制分子，可通过与PD-L1相互作用促进肿瘤相关巨噬细胞和其他免疫细胞极化为促肿瘤表型，促进肿瘤细胞免疫逃逸和癌症进展^［25］；已有研究表明，TRIB1缺失可进一步增强慢性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒感染小鼠中PD-1通路阻断效果^［26］。本研究中各组HL-60细胞PD-1、PD-L1蛋白表达变化说明上调miR-100-5p通过下调TRIB1抑制HL-60细胞增殖，促进细胞凋亡的机制可能与PD-1、PD-L1有关。另有研究报道，TRIB1可通过调控MEK1/ERK通路参与髓系白血病发生发展^［27］，提示上调miR-100-5p可能通过调控TRIB1-MEK1/ERK通路发挥上述作用，后续需设计实验验证具体机制。

综上所述，上调miR-100-5p可通过下调TRIB1表达抑制HL-60细胞增殖，促进细胞凋亡，本研究为AML治疗提供了潜在新靶点。但本研究存在一定局限性：其一，尽管观察到AML患儿中miR-100-5p低表达和TRIB1高表达的显著趋势，但尚未系统分析两者表达水平与临床预后指标及治疗反应的相关性；其二，研究所用HL-60细胞系源自成人AML-M2/M3患者，而临床样本来自儿童AML（涵盖M1-M5亚型）。尽管HL-60细胞广泛用于AML机制研究，但其成人来源、特定分子特征及M2/M3亚型背景，可能与儿童AML生物学特性存在差异，这可能影响miR-100-5p/TRIB1通路的调控机制的适用性。未来研究需在更多儿童AML原代细胞或代表性细胞模型中验证本研究发现，以增强结论的说服力。

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