重症肌无力患者外周血单个核细胞中线粒体自噬和凋亡相关基因表达及其诊断价值

Expression of mitophagy and apoptosis related genes in peripheral blood mononuclear cells of patients with myasthenia gravis and its clinical diagnosis value

摘要

目的 探讨重症肌无力（MG）患者外周血单个核细胞（PBMCs）中线粒体自噬和凋亡相关基因的表达水平，阐明其对MG诊断的指导价值。 方法 收集并提取50名健康对照者（对照组）和50例MG患者（MG组）的PBMCs，采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法和Western blotting法检测线粒体自噬因子磷脂酶和张力蛋白同源物（PTEN）诱导激酶1（PINK1）、E3泛素连接酶PARK2（Parkin）、泛素结合蛋白62（p62）、微管相关蛋白1轻链3（LC3Ⅱ）及凋亡因子细胞色素C（Cyt-C）、B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相关Ｘ蛋白（Bax）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶 3（caspase 3）和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶 9（caspase 9）的mRNA以及蛋白表达水平，根据mRNA检测结果设定多个不同临界值，在每个临界值处计算出相应的灵敏度和特异度，并绘制受试者工作特征（ROC）曲线。 结果 与对照组比较，MG组患者PBMCs中的自噬因子PINK1、Parkin和LC3Ⅱ的mRNA及蛋白表达水平明显降低（P<0.01），p62 mRNA和蛋白表达水平升高（P<0.05或P<0.01）；凋亡因子Cyt-C、Bax、caspase 3和caspase 9 mRNA及蛋白表达水平明显升高（P<0.05或P<0.01），Cyt-C mRNA和蛋白表达水平升高（P<0.05或P<0.01），而Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。ROC曲线检测，PINK1、Parkin、p62和LC3Ⅱ的ROC曲线下面积（AUC）分别为0.969 6（95%CI：0.943 5~0.995 7）、0.944 0（95%CI：0.904 7~0.983 3）、0.855 6（95%CI：0.776 7~0.934 5）及0.908 8（95%CI：0.852 6~0.965 0）（P<0.01），灵敏度分别为92%、92%、78%和84%，特异度分别为88%、82%、92%和82%；而Cyt-C、Bax、Bcl-2、caspase 3和caspase 9的AUC均为1.000（P<0.01），灵敏度和特异度均达到100%。 结论 MG患者PBMCs中存在线粒体自噬障碍和凋亡增加现象，其对临床诊断MG具有较高的指导价值。

Abstract

Objective To discuss the expression levels of mitochondrial autophagy and apoptosis-related genes in peripheral blood mononuclear cells （PBMCs） in the patients with myasthenia gravis （MG），and to clarify its diagnostic value for MG. Methods The PBMCs from 50 healthy controls （control group） and 50 MG patients （MG group） were collected and extracted. Real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR） and Western blotting methods were used to detect the expression levels of mitochondrial autophagy factors phosphatase and tensin homolog （PTEN）-induced kinase 1 （PINK1）， E3 ubiquitin-protein ligase PARK2 （Parkin）， ubiquitin-binding protein p62 （p62）， microtubule-associated proteins light chain 3 type Ⅱ （LC3Ⅱ）， and apoptotic factors cytochrome C （Cyt-C）， B cell lymphoma-2 （Bcl-2）， Bcl-2-associated X protein （Bax）， cysteine-containing aspartic acid protease 3 （caspase 3）， and cysteine-containing aspartic acid protease 9 （caspase 9） mRNA and protein. Different cut-off values were set based on the mRNA detection results， and the corresponding sensitivity and specificity at each cut-off value were calculated. The receiver operating characteristic （ROC） curve was drawn. Results Compared with control group， the expression levels of autophagy factors PINK1， Parkin， and LC3Ⅱ mRNA and protein in the PBMCs in MG group were significantly decreased （P<0.01）， while the expression levels of p62 mRNA and protein were increased （P<0.05 or P<0.01）. The expression levels of apoptotic factors Cyt-C， Bax， caspase 3， and caspase 9 mRNA and protein were significantly increased （P<0.05 or P<0.01）， and while the expression levels of Cyt-C mRNA and protein were increased （P<0.05 or P<0.01）， and the expression levels of Bcl-2 mRNA and protein were significantly decreased （P<0.01）. The ROC curve analysis results showed that the area under the curve （AUC） for PINK1， Parkin， p62， and LC3Ⅱ were 0.969 6 （95%CI： 0.943 5-0.995 7）， 0.944 0 （95%CI： 0.904 7-0.983 3）， 0.855 6 （95%CI： 0.776 7-0.934 5）， and 0.908 8 （95%CI： 0.852 6-0.965 0） （P<0.01）， respectively，and the sensitivities were 92%， 92%， 78%， and 84%， and the specificities were 88%， 82%， 92%， and 82%， respectively； whereas the AUC for Cyt-C， Bax， Bcl-2， caspase 3， and caspase 9 was 1.000 （P<0.01）， and the sensitivity and specificity reached 100%. Conclusion Mitochondrial autophagy disorder and increased apoptosis are found in the PBMCs in the patients with MG， which has a higher guiding value for clinical diagnosis of MG.

关键词

重症肌无力 / 线粒体自噬 / 细胞凋亡 / 外周血单个核细胞 / 诊断价值

Key words

Myasthenia gravis / Mitophagy / Apoptosis / Peripheral blood mononuclear cell / Diagnostic value

Author summay

蔡东红（1992－），女，广东省揭阳市人，医学硕士，主要从事脾胃病与神经肌肉病的基础与临床方面的研究。