硫唑嘌呤对RSL3诱导小鼠精母细胞铁死亡的影响

摘要

目的：探讨硫唑嘌呤（AZA）对还原型谷胱甘肽（GSH）过氧化物酶4抑制剂RSL3诱导的小鼠精母细胞铁死亡的影响，并阐明其可能的作用机制。方法：小鼠精母GC-2细胞随机分为对照组（不进行处理）、RSL3组（给予10 nmol·L-1 RSL3处理24 h）、RSL3+铁死亡抑制剂（Fer-1）组（给予10 nmol·L-1 RSL3处理24 h+2μmol·L-1 Fer-1处理12 h）、RSL3+低剂量AZA组（给予10 nmol·L-1RSL3处理24h+5μmol·L-1AZA处理12h）、 RSL3+中剂量AZA组（给予10 nmol·L-1 RSL3处理24 h+10μmol·L-1 AZA处理12 h）和RSL3+高剂量AZA组（给予10 nmol·L-1 RSL3处理24 h+20μmol·L-1 AZA处理12 h）。MTT法检测不同浓度AZA和不同浓度RSL3作用后GC-2细胞活性，采用GSH和氧化型谷胱甘肽（GSSG）检测试剂盒检测GC-2细胞中GSH和GSSG水平，采用丙二醛（MDA）试剂盒检测各组GC-2细胞中MDA水平，采用Western blotting法检测各组GC-2细胞中长链脂酰CoA合成酶4 (ACSL4)、血红素氧合酶1 (HO-1)和谷胱甘肽过氧化物酶4 (GPX4)蛋白表达水平，采用免疫荧光法检测各组GC-2细胞中ACSL4蛋白表达情况。结果：与对照组比较，5、10和20μmol·L-1AZA组GC-2细胞活性差异无统计学意义（P>0.05）,30和40μmol·L-1 AZA组GC-2细胞细胞活力明显降低（P<0.01），因此AZA作用浓度选择为20μmol·L-1以内。与对照组比较，1、5和10 nmol·L-1 RSL3组GC-2细胞活性差异无统计学意义（P>0.05）,50、100、500和1 000 nmol·L-1RSL3组GC-2细胞活性明显降低（P<0.05或P<0.01），因此将RSL3作用浓度定为10 nmol·L-1以内。GSH和MDA试剂盒检测，与对照组比较，RSL3组GC-2细胞中GSSG和MDA水平明显升高（P<0.05）, GSH水平明显降低（P<0.05）；与RSL3组比较，RSL3+Fer-1组和RSL3+AZA组GC-2细胞中GSSG和MDA水平明显降低（P<0.01）, GSH水平明显升高（P<0.01）。Western blotting法检测，与对照组比较，RSL3组GC-2细胞中ACSL4和HO-1蛋白表达水平明显升高（P<0.05）,GPX4蛋白表达水平明显降低（P<0.01）；与RSL3组比较，RSL3+Fer-1组和RSL3+AZA组GC-2细胞中GPX4蛋白表达水平明显升高（P<0.05）,ACSL4和HO-1蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。免疫荧光检测，与对照组比较，RSL3组GC-2细胞中ACSL4蛋白表达量明显增多；与RSL3组比较，RSL3+Fer-1组和RSL3+AZA组ACSL4蛋白表达量明显降低。结论：AZA可以减轻RSL3诱导的小鼠精母细胞铁死亡。

关键词

硫唑嘌呤 / 铁死亡 / 精母细胞 / 谷胱甘肽过氧化物酶4 / 酯酰辅酶A合成酶长链家族成员4

基金资助

国家自然科学基金青年基金项目（81402655）; 重庆市科技局自然科学基金面上项目（cstc2019jcyj-msxm X0427)