水泡性口炎病毒对体外血管内皮屏障功能的损伤作用及其机制

摘要

目的：探讨水泡性口炎病毒（VSV）对血管内皮（VE）屏障的损伤作用，并阐明其作用机制。方法：采用犬肾细胞对VSV进行扩增，采用小鼠脑血管内皮瘤bEnd. 3细胞检测VSV的半数组织培养感染剂量（TCID50），采用300倍TCID50进行后续实验。将bEnd. 3细胞分为感染0 h组、感染4 h组、感染8 h组和感染12 h组，进行VSV感染损伤VE屏障实验；将bEnd. 3细胞分为对照组、感染组和纠正组，进行抑制VSV复制与VE屏障恢复实验。将bEnd. 3细胞接种于Transwell小室，构建体外VE屏障模型，采用细胞电压电阻仪检测感染VSV不同时间后各组bEnd. 3细胞中跨上皮电阻（TER），采用异硫氰酸荧光素-葡聚糖渗漏实验检测各组渗透系数，采用免疫荧光染色法观察VSV感染后各组bEnd. 3细胞骨架及黏附连接（AJs）中VE-钙黏蛋白、β-连环蛋白（β-catenin）和磷酸化β-连环蛋白（p-β-catenin）定位变化，采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法检测各组细胞中Wnt和β-catenin mRNA表达水平，采用Western blotting法检测各组细胞中Wnt、β-catenin和p-β-catenin表达水平。结果：VSV的TCID50为10-4.5·100μL-1。Transwell小室实验检测，与感染0 h比较，其他各组细胞中TER明显降低（P<0.05），渗透系数明显升高（P<0.05）。免疫荧光染色，与对照组比较，感染组bEnd. 3细胞骨架紊乱，细胞间隙增大，AJs线性指数明显降低（P<0.05）,β-catenin和p-β-catenin从细胞膜转移至细胞核周围。RT-qPCR法检测，与感染0 h比较，其他各组细胞中Wnt mRNA表达水平明显降低（P<0.05）,β-catenin mRNA表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。Western blotting法检测，与感染0 h比较，其他各组细胞中Wnt蛋白表达水平明显降低（P<0.05）,β-catenin表达水平差异无统计学意义（P>0.05）,p-β-catenin表达水平明显升高（P<0.05）。在抑制VSV复制并纠正低密度脂蛋白受体（LDLR）异常后，Transwell小室实验检测，与感染组比较，纠正组bEnd. 3细胞中TER明显升高（P<0.05），渗透系数明显降低（P<0.05）。免疫荧光染色，与感染组比较，纠正组细胞间隙减小，细胞中β-catenin和p-β-catenin核周聚集现象有所改善。RT-qPCR法检测，与感染组比较，纠正组细胞中Wnt mRNA表达水平明显升高（P<0.05）。Western blotting法检测，与感染组比较，纠正组细胞中Wnt蛋白表达水平明显升高（P<0.05）,β-catenin表达水平差异无统计学意义（P>0.05）,p-β-catenin表达水平明显降低（P<0.05）。结论：VSV感染后可引起LDLR失活，降低Wnt蛋白表达水平，造成β-catenin磷酸化水平升高并发生内化，破坏AJs稳定性，最终导致VE屏障损伤。

关键词

水泡性口炎病毒 / 血管内皮屏障 / 黏附连接 / 低密度脂蛋白受体 / Wnt/β-连环蛋白信号通路