发热伴血小板减少综合征病毒非结构蛋白的表达和定位及宿主互作蛋白的筛选和分析

摘要

目的：通过免疫沉淀联合质谱分析的方法筛选发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV非结构蛋白（NSs）的宿主互相作用（互作）蛋白，探讨互作蛋白的功能、亚细胞定位及参与的生物途径，为阐明SFTSV的复制和致病机制提供依据。方法：将真核表达载体pSFTSV-NSs-Flag （实验组）和Flag-CMV-3 （阴性组）分别转染进人胚胎肾293T细胞中，同时设置空白组（不进行任何处理）。收集各组细胞裂解液，采用间接免疫荧光和Western blotting法验证SFTSV NSs在宿主细胞中的表达及定位。蛋白裂解液经protein A/G处理，采用免疫沉淀法富集与NSs结合的宿主蛋白，通过银染和考马斯亮蓝染色初步分析捕获的互作蛋白，观察各组蛋白差异条带。采用液相色谱和串联质谱技术得到蛋白质的序列信息，保留可信蛋白基于UniProt数据库检索，对鉴定到的蛋白进行基因本体论（GO）功能富集分析、蛋白结构域和功能位点数据库（IPR）、真核生物同源蛋白簇（KOGs）功能注释、京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析、亚细胞定位和转录因子（TF）功能注释，确定互作蛋白的亚细胞结构、基因功能及参与的生物过程。结果：SFTSV NSs在相对分子质量33 000处表达单一特异性条带，免疫荧光检测其定位于细胞质中，且聚集呈砂粒体包涵体样。银染和考马斯亮蓝染色，实验组和阴性组均存在显著差异条带。质谱筛选出46种潜在互作蛋白；GO功能富集分析、KOGs功能注释和KEGG信号通路富集分析，与病毒翻译、细胞代谢及蛋白质运输相关的生物途径富集到较多数目的蛋白，注释中有8种蛋白具有中间丝蛋白结构域。亚细胞定位所占百分率最高的是细胞质蛋白；与NSs定位场所一致。TF功能注释，有1种蛋白来自NF-Y家族。结论：互作蛋白在协助蛋白质正确折叠、参与核糖体翻译和构成细胞骨架等进程中发挥作用，可能参与了抗病毒复制，可作为候选蛋白进一步研究SFTSV的复制机制。

关键词

发热伴血小板减少综合征病毒 / 非结构蛋白 / 蛋白-蛋白互相作用 / 免疫沉淀 / 质谱