基于酵母双杂交技术对与纳尔逊海湾正呼肠孤病毒σNS相互作用宿主蛋白的筛选

摘要

目的：探讨小鼠成纤维L929细胞中与纳尔逊海湾正呼肠孤病毒（NBV）σNS蛋白相互作用（互作）的宿主蛋白，阐明宿主蛋白对病毒复制的影响。方法：构建表达σNS蛋白的诱饵质粒pGBKT7-S3，采用测序技术验证诱饵质粒在Y2H酵母细胞中的准确表达。将pGBKT7-S3和pGADT7质粒分别和共同转化至Y2HGold酵母细胞中，涂布于固体培养基进行培养，观察菌落生长情况，确认σNS蛋白对酵母细胞无毒性，不能自行激活报告基因。诱饵质粒pGBKT7-S3与小鼠成纤维L929细胞的cDNA文库进行杂交，对编码互作蛋白的阳性克隆进行质粒抽提，阳性测序结果通过Uniprot数据库检索筛选得到与NBVσNS互作的蛋白。对互作蛋白进行基因本体论（GO）功能富集分析、京都基因和基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析和STRING生物信息学分析。结果：成功筛选出61个阳性克隆。DNA测序分析和BLAST比对分析去除23个未匹配到数据库和测序基本相同的阳性克隆。阳性测序结果通过Uniprot数据库检索筛选得到38个与NBVσNS互作的蛋白，31个蛋白参与细胞生物过程，36个蛋白是细胞解剖成分，31个蛋白具有结合功能，5个蛋白是线粒体呼吸链组成部分，7个蛋白是核糖体蛋白和核糖体大小亚基的组成部分，2个蛋白参与铁代谢稳态。GO功能富集分析，互作蛋白参与的生物过程（BP）富集在细胞过程、代谢过程、生物学调节、定位和对刺激的反应等；细胞组分主要是细胞解剖成分和含蛋白复合物；分子功能集中在结合、催化活性、结构分子活性和转运活性等方面。KEGG信号通路富集分析，蛋白在遗传信息处理途径的翻译、折叠、分类和降解信号通路中高度富集，在机体系统中主要与消化系统有关联；与多种病毒性传染病和癌症有关联。STRING分析，互作蛋白涉及核糖体蛋白类、蛋白修饰类、代谢类和免疫蛋白类等功能蛋白。结结论论：成功筛选出与NBVσNS蛋白互作的蛋白，宿主蛋白在病毒复制中具有重要作用。

关键词

纳尔逊海湾正呼肠孤病毒 / 酵母双杂交实验 / σNS蛋白 / 蛋白互相作用 / 生物信息学