胞质分裂作用因子4过表达慢病毒载体的构建和稳定转染Neuro-2a细胞的建立

摘要

目的：构建胞质分裂作用因子4 (DOCK4)过表达慢病毒载体，建立DOCK4稳定过表达的Neuro-2a细胞。方法：在美国国家生物信息中心（NCBI）查找DOCK4的序列并设计合成引物，采用聚合酶链式反应（PCR）法扩增获取DOCK4基因序列，通过Bam HⅠ和AgeⅠ限制性内切酶酶切后，将其与酶切后的慢病毒载体GV492进行连接，构建GV492-DOCK4过表达重组质粒，PCR法鉴定筛选出与目的基因片段长度大小相近的阳性克隆。将GV492-对照质粒和GV492-DOCK4过表达重组质粒分别转染至HEK293T细胞中，转染48 h后收集慢病毒进行包装并测定病毒滴度。将Neuro-2a细胞分为GV492-对照组和GV492-DOCK4组，分别采用GV492-对照组慢病毒和GV492-DOCK4过表达慢病毒感染Neuro-2a细胞，慢病毒感染复数（MOI）为100，感染72 h后采用嘌呤霉素（10 mg·L-1）筛选出成功感染GV492-对照组慢病毒和GV492-DOCK4过表达慢病毒的Neuro-2a细胞，荧光显微镜观察各组Neuro-2a细胞生长状态及绿色荧光蛋白表达情况；采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法和Western blotting法检测各组Neuro-2a细胞中DOCK4 mRNA和DOCK4蛋白表达水平。结果：PCR检测，GV492-DOCK4过表达重组质粒的基因片段长度约为691 bp，测序结果显示GV492-DOCK4过表达重组质粒基因序列与设计合成的DOCK4过表达序列一致；GV492-对照组和GV492-DOCK4过表达组慢病毒的滴度分别为2.5×108 TU·mL-1和2.5×108 TU·mL-1；荧光显微镜观察，各组Neuro-2a细胞生长状态良好且存在绿色荧光蛋白表达；RT-qPCR法检测，与GV492-对照组比较，GV492-DOCK4组Neuro-2a细胞中DOCK4 mRNA表达水平明显升高（P<0.01）;Western blotting法检测，各组细胞在相对分子质量225 000附近出现特异性条带，与GV492-对照组比较，GV492-DOCK4组Neuro-2a细胞中DOCK4蛋白表达水平明显升高（P<0.01）。结论：本研究成功构建DOCK4过表达慢病毒载体，建立了稳定过表达DOCK4的Neuro-2a细胞。

关键词

胞质分裂作用因子4 / 过表达慢病毒载体 / Neuro-2a细胞 / 稳定转染 / 过表达慢病毒