草苁蓉多糖对THP-1巨噬细胞炎症反应的抑制作用及其机制

摘要

目的：探讨草苁蓉多糖（BRPS）对脂多糖（LPS）诱导的THP-1巨噬细胞炎症反应的影响，并阐明其作用机制。方法：将THP-1单核细胞分化为巨噬细胞，采用LPS诱导THP-1巨噬细胞，建立炎症模型。CCK-8法检测不同浓度(0、100、200、500、1 000和2 000μg·L^-1) LPS及不同浓度(0、12.5、25.0、50.0、100.0和200.0 mg·L^-1) BRPS处理后THP-1巨噬细胞存活率，选取后续实验药物浓度。将THP-1巨噬细胞分为空白组、模型组、低剂量BRPS组(25.0 mg·L^-1 BRPS)、中剂量BRPS组(50.0 mg·L^-1 BRPS)和高剂量BRPS组(100.0 mg·L^-1 BRPS)。采用P38抑制剂SB203580、ERK抑制剂U0126、c-Jun氨基末端激酶（JNK）抑制剂SP600125和核因子κB （NF-κB）抑制剂BAY11-7082对THP-1细胞进行验证。另取THP-1细胞，分为对照组、LPS组、抑制剂组、100.0 mg·L^-1 BRPS组和抑制剂+100.0 mg·L^-1 BRPS组。酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测各组THP-1巨噬细胞培养液中肿瘤坏死因子α （TNF-α）、白细胞介素（IL）-6和IL-1β水平，2,7-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）荧光探针法检测各组THP-1巨噬细胞中活性氧（ROS）水平，Hoechst33342/PI荧光染色法观察各组THP-1巨噬细胞膜损伤情况，JC-1荧光染色法观察各组THP-1巨噬细胞线粒体膜电位，蛋白印迹法检测各组THP-1巨噬细胞中环氧合酶2 （COX-2）、高迁移率族蛋白B1 （HMGB1）、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3 （NLRP3）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-1、消皮素D （GSDMD）-N、IL-1β、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和NF-κB相关蛋白表达水平。结果：CCK-8法检测，LPS浓度为100～2 000μg·L^-1时，THP-1巨噬细胞存活率均>90%；与0μg·L^-1 LPS组比较，100、200、500、1 000和2 000μg·L^-1 LPS组THP-1巨噬细胞培养液中IL-6水平均明显升高（P<0.05），提示巨噬细胞炎症反应明显增强，因此选用100μg·L^-1 LPS构建炎症模型；12.5、25.0、50.0、100.0和200.0 mg·L^-1 BRPS处理THP-1巨噬细胞，THP-1巨噬细胞存活率分别为91.2%、93.8%、91.4%、90.6%和91.8%，选取25.0、50.0和100.0 mg·L^-1 BRPS作为后续实验中低、中和高剂量BRPS组药物浓度。ELISA法检测，与空白组比较，模型组THP-1巨噬细胞培养液中IL-6、 TNF-α和IL-1β水平均明显升高（P<0.05）；与模型组比较，低、中和高剂量BRPS组THP-1巨噬细胞培养液中IL-6、TNF-α和IL-1β水平均明显降低（P<0.05）。DCFH-DA荧光探针法检测，与空白组比较，模型组THP-1巨噬细胞中ROS水平明显升高（P<0.05）；与模型组比较，低、中和高剂量BRPS组THP-1巨噬细胞中ROS水平均明显降低（P<0.05）。Hoechst33342/PI荧光染色法观察，与空白组比较，模型组THP-1巨噬细胞膜损伤程度明显增加；与模型组比较，低、中和高剂量BRPS组THP-1巨噬细胞膜损伤程度明显减少。JC-1荧光染色法观察，空白组THP-1巨噬细胞线粒体膜电位较高；与空白组比较，模型组THP-1巨噬细胞线粒体跨膜电位明显降低；与模型组比较，低、中和高剂量BRPS组THP-1巨噬细胞线粒体跨膜电位逐渐升高。蛋白印迹法检测，与空白组比较，模型组THP-1巨噬细胞中COX-2、HMGB1、NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N和IL-1β蛋白表达水平及p-P38/P38、p-ERK/ERK、 p-JNK/JNK和p-NF-κB/NF-κB比值均明显升高（P<0.05）；与模型组比较，中和高剂量BRPS组THP-1巨噬细胞中HMGB1、 NLRP3、 Caspase-1、GSDMD-N和IL-1β蛋白表达水平及p-P38/P38、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK和p-NF-κB/NF-κB比值均明显降低（P<0.05），低剂量BRPS组THP-1巨噬细胞中NLRP3、Caspase-1和IL-1β蛋白表达水平均明显降低（P<0.05），高剂量BRPS组THP-1巨噬细胞中COX-2蛋白表达水平明显降低（P<0.05）；与对照组比较，LPS组THP-1巨噬细胞p-P38/P38、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK和p-NF-κB/NF-κB比值及IL-1β蛋白表达水平均明显升高（P<0.05）；与LPS组比较，抑制剂组、100 mg·L^-1BRPS组和抑制剂+100 mg·L^-1 BRPS组THP-1巨噬细胞中p-P38/P38、 p-ERK/ERK、 p-JNK/JNK和p-NF-κB/NF-κB比值及IL-1β蛋白表达水平均明显降低（P<0.05）；与抑制剂组比较，抑制剂+100 mg·L^-1 BRPS组THP-1巨噬细胞p-P38/P38、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK和p-NF-κB/NF-κB比值均明显降低（P<0.05）。结论：BRPS抑制THP-1细胞巨噬细胞的炎症反应，其机制可能与BRPS调控MAPK和NF-κB信号通路有关。

关键词

草苁蓉多糖 / NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3 / 丝裂原活化蛋白激酶 / 核因子κB / 焦亡