miR-30c-5p对前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用及其机制

摘要

目的：探讨微小RNA (miR)-30c-5p对人前列腺癌细胞（LNCap）增殖、迁移和侵袭的影响，并阐明其可能的机制。方法：LNCap细胞根据转染质粒不同分为LNCap组（无转染质粒）、miR-30c-5p mimic组（转染miR-30c-5p mimic）、mimic NC组（转染miR-30c-5p mimic NC）、sh-DNA损伤诱导转录因子4 (DDIT4)组（转染sh-DDIT4）、sh-NC组（转染sh-DDIT4 NC）、miR-30c-5p mimic+pc-DNA3.1-NC组（共转染miR-30c-5p mimic和pc DNA3.1-DDIT4空载质粒）和miR-30c-5p mimic+pc-DNA3.1-DDIT4组（共转染miR-30c-5pmimic和pc-DNA3.1-DDIT4过表达质粒），RWPE-1细胞正常培养。实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法检测各组细胞中miR-30c-5p和DDIT4mRNA表达水平，Western blotting法检测各组细胞中DDIT4蛋白表达水平，CCK-8法检测各组LNCap细胞增殖率，Transwell小室实验检测各组LNCap细胞侵袭细胞数，划痕实验检测各组LNCap细胞划痕愈合率，双荧光素酶报告基因实验验证miR-30c-5p与DDIT4的靶向关系。体内裸鼠成瘤实验，18只雄性BALB/c裸鼠随机分为空白组、agomiR-NC组（转染agomiR-30c-5p NC）和agomiR-30c-5p组（转染agomiR-30c-5p），每组6只。agomiR-NC组和agomiR-30c-5p组裸鼠皮下注射LNCap细胞，空白组裸鼠注射等量生理盐水，检测各组小鼠肿瘤体积。HE染色观察各组小鼠前列腺癌组织形态表现，RT-qPCR法和免疫荧光染色法检测各组小鼠前列腺癌组织中miR-30c-5p和DDIT4 mRNA表达水平及DDIT4蛋白荧光强度。结果：体外前列腺癌细胞实验，与人正常前列腺上皮RWPE-1细胞比较，前列腺癌LNCap细胞中miR-30c-5p表达水平明显降低（P<0.01）,DDIT4 mRNA和蛋白表达水平明显升高（P<0.05或P<0.01）；转染48 h后，与LNCap组和mimic NC组比较，miR-30c-5p mimic组LNCap细胞中miR-30c-5p表达水平明显升高（P<0.01）。与LNCap组和sh-NC组比较，sh-DDIT4组LNCap细胞中DDIT4 mRNA表达水平明显降低（P<0.01）；与miR-30c-5p mimic组和miR-30c-5p mimic+pcDNA3.1 NC组比较，miR-30c-5p mimic+pc-DNA3.1-DDIT4组LNCap细胞中miR-30c-5p表达水平明显降低（P<0.01）；与miR-30c-5p mimic组和miR-30c-5p mimic+pcDNA3.1 NC组比较，miR-30c-5p mimic+pc-DNA3.1-DDIT4组LNCap细胞中DDIT4 mRNA表达水平明显升高（P<0.01）；与miR-30c-5pmimic组和miR-30c-5pmimic+pcDNA3.1NC组比较，miR-30c-5pmimic+pc-DNA3.1-DDIT4组LNCap细胞中DDIT4蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。CCK-8法检测，与LNCap组和mimic NC组比较，miR-30c-5p mimic组LNCap细胞增殖率明显降低（P<0.01）；与LNCap组和sh-NC组比较，sh-DDIT4组LNCap细胞增殖率明显降低（P<0.01）；与miR-30c-5p mimic组和miR-30c-5pmimic+pcDNA3.1NC组比较，miR-30c-5pmimic+pc-DNA3.1-DDIT4组LNCap细胞增殖率明显升高（P<0.01）。Transwell小室实验检测，与LNCap组和mimic NC组比较，miR-30c-5p mimic组LNCap细胞侵袭细胞数明显减少（P<0.01）；与LNCap组和sh-NC组比较，sh-DDIT4组LNCap细胞侵袭细胞数明显减少（P<0.01）；与miR-30c-5pmimic组和miR-30c-5p mimic+pcDNA3.1 NC组比较，miR-30c-5p mimic+pc-DNA3.1-DDIT4组LNCap细胞侵袭细胞数明显增加（P<0.01）。划痕实验检测，与LNCap组和mimic NC组比较，miR-30c-5p mimic组LNCap细胞划痕愈合率明显降低（P<0.01）；与LNCap组和sh-NC组比较，sh-DDIT4组细胞划痕愈合率明显降低（P<0.01）；与miR-30c-5p mimic组和miR-30c-5p mimic+pcDNA3.1 NC组比较，miR-30c-5p mimic+pc-DNA3.1-DDIT4组细胞划痕愈合率明显升高（P<0.01）。双荧光素酶实验检测，与共转染WT-DDIT4和mimic NC的LNCap细胞比较，共转染WT-DDIT4和miR-30c-5p mimic的LNCap细胞中荧光素酶活性明显降低（P<0.01）。体内裸鼠成瘤实验，细胞注射后第3、6、9、12和15天，与空白组和agomiR-NC组比较，agomiR-30c-5p组裸鼠肿瘤体积明显减小（P<0.05）。HE染色观察，空白组和agomiR-NC组小鼠前列腺癌组织中细胞核增大，核仁突出且畸形；agomiR-30c-5p组小鼠前列腺癌组织部分区域细胞排列整齐，细胞核恢复正常形态。RT-qPCR法和免疫荧光染色法检测，与agomiR-NC组比较，agomiR-30c-5p组小鼠前列腺癌组织中miR-30c-5p表达水平明显升高（P<0.01）；与空白组和agomiR-NC组比较，agomiR-30c-5p组小鼠前列腺癌组织中DDIT4 mRNA表达水平明显降低（P<0.01）;DDIT4蛋白主要在细胞质表达，与空白组和agomiR-NC组比较，agomiR-30c-5p组小鼠前列腺癌组织中DDIT4蛋白荧光强度明显降低（P<0.01）。结论：miR-30c-5p在前列腺癌LNCap细胞中表达水平明显降低，其可通过靶向下调DDIT4抑制前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，从而参与前列腺癌的发生发展。

关键词

前列腺肿瘤 / 微小RNA-30c-5p / DNA损伤诱导转录因子4 / 细胞增殖 / 细胞迁移

基金资助

云南省科技厅-昆明医科大学应用基础研究联合专项基金资助项目（202001AY070001-069）; 云南省教育厅科学研究项目（2020J0207）; 昆明医科大学第三附属医院2023年教学联盟本科教育教学研究项目（JXYJ20230211）; 昆明医科大学2024年研究生教育创新基金（2024S341,2024S342）