PRDM5过表达慢病毒载体的构建及稳定转染Neuro-2a细胞的建立

Construction of PRDM5 over-expression lentivirus vector and establishment of stably transfected Neuro-2a cells

摘要

目的：构建PR锌指区域蛋白（PRDM） 5基因的过表达慢病毒载体，建立稳定转染的小鼠神经瘤母细胞Neuro-2a，为探讨PRDM5在缺血性脑卒中（IS）发病机制中的作用奠定基础。方方法法：在NCBI上搜索PRDM5的序列并设计引物，PCR法扩增获取PRDM5基因序列，将其与Bam HⅠ和AgeⅠ限制性内切酶双酶切后的慢病毒载体GV492进行连接，构建GV492-PRDM5过表达重组质粒，采用PCR法筛选并鉴定出的与目的基因片段长度相近的阳性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将测序正确的GV492-control质粒和GV492-PRDM5过表达重组质粒分别转染至人胚胎肾细胞HEK293T中，转染48 h后离心收集慢病毒，分别为GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒，采用慢病毒滴度测定法检测上述2种慢病毒滴度。将Neuro-2a细胞分为GV492-control组和GV492-PRDM5组，分别使用GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒感染Neuro-2a细胞，慢病毒感染复数（MOI）为100，感染72 h后使用嘌呤霉素(10 mg·L^-1)对成功感染GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒的Neuro-2a细胞进行筛选，通过荧光显微镜观察GV492-control组和GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞的生长状态及绿色荧光蛋白的表达情况。采用实时荧光定量PCR （RT-qPCR）法检测2组Neuro-2a细胞中PRDM5 mRNA表达水平；Western blotting法检测2组Neuro-2a细胞中PRDM5蛋白表达水平。结果：PCR法，GV492-PRDM5重组质粒阳性转化子的长度约为684 bp, GV492-PRDM5过表达重组质粒基因序列与设计合成的PRDM5过表达序列一致；GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒的滴度均为2.5×108 TU·mL^-1。荧光显微镜，GV492-control组和GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞的生长状态均良好，且能观察到绿色荧光蛋白的表达。RT-qPCR法，与GV492-control组比较，GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞中PRDM5 mRNA表达水平明显升高（P<0.01）。Western blotting法，GV492-control组和GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞在相对分子质量为75 000附近出现特异性条带；与GV492-control组比较，GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞中PRDM5蛋白表达水平升高（P<0.01）。结论：成功构建PRDM5过表达慢病毒载体，建立了稳定转染的GV492-PRDM5-Neuro-2a细胞。

关键词

PR锌指区域蛋白 / 过表达慢病毒载体 / 稳定表达 / Neuro-2a细胞

Key words

PRDI-BF1 and RIZ domain proteins / Over-expression lentivirus vector / Stable expression / Neuro-2a cells

PR锌指区域蛋白（PRDI-BF1 and RIZ domain proteins，PRDM）家族是拥有17个成员的Kruppel样锌指结构的保守亚家族，其N端均有保守的PR结构域^［1-4］。PR结构域在结构和功能上与SET结构域高度同源，因此该家族成员可通过募集组蛋白修饰酶至转录启动子区域进行转录抑制或激活；其C端连接数量不等的锌指结构（PRDM11除外），因此具有对DNA、RNA和蛋白的识别能力^［3，5］。PRDM5是PRDM家族成员之一，其N端具有PR结构域，C端则含有16个锌指结构^［6］。目前关于PRDM5的研究多数在肿瘤领域，PRDM5是肺癌、胃癌和宫颈癌等实体瘤的肿瘤抑制因子，是白血病和黑色素瘤等肿瘤的促进因子^［7-10］。关于PRDM5在神经系统领域作用的研究多集中于急性脊髓损伤（acute spinal cord injury，ASCI），如在经过氧化氢损伤的原代脊髓神经元中，过表达PRDM5可促进细胞炎症反应及凋亡^［11］；在缺氧处理的神经元细胞中，微小RNA-495（microRNA-495，miR-495）通过靶向PRDM5上调抗凋亡蛋白的表达进而抑制细胞凋亡^［12］；在大鼠ASCI模型中，迪乔治综合征关键区基因5（DiGeorge syndrome critical region gene 5，DGCR5）通过直接结合和负调节PRDM5进而减轻大鼠ASCI症状等^［13］。在脂多糖诱导神经炎症的星形胶质细胞中，PRDM5可诱发星形胶质细胞凋亡^［14］，然而PRDM5在缺血性脑卒中（ischemic stroke，IS）的具体功能及调控机制仍未见相关报道。本研究成功构建PRDM5过表达慢病毒载体并包装为PRDM5过表达慢病毒，通过体外感染小鼠神经瘤母细胞（Neuro-2a）并采用抗生素筛选获得稳定过表达PRDM5的Neuro-2a细胞，为进一步探讨PRDM5参与IS的发病机制奠定基础，为后续直接使用GV492-PRDM5-Neuro-2a细胞构建体外氧-糖剥夺/复氧（oxygen and glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）的脑缺血再灌注损伤模型提供条件。

1 材料与方法

1.1　细胞、主要试剂和仪器

Neuro-2a细胞和人胚胎肾细胞HEK293T均购自武汉普诺赛生命科技有限公司；慢病毒载体质粒GV492（Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin）购自上海吉凯基因化学技术有限公司，DMEM高糖培养基、Opti-MEM、MEM（含非必需氨基酸）、0.25% Trypsin-EDTA、胎牛血清（foetal bovine serum，FBS）和Lipofectamine 2000均购自美国Thermo Scientific公司，BamHⅠ和AgeⅠ限制性核酸内切酶、Taq DNA聚合酶和T4 DNA连接酶均购自美国NEB公司，实时荧光定量PCR（real-time fluorescente quantitative PCR，RT-qPCR）染料预混液购自北京康润诚业生物科技有限公司，Anti-PRDM5抗体购自美国SANTA CRUZ公司，Anti-GAPDH抗体均购自美国Abcam公司。倒置光学显微镜和倒置荧光显微镜购自日本Olympus公司，RT-qPCR仪（型号：LightCycler480）购自瑞士Roche公司，凝胶成像系统（型号：Azure C300）购自美国Azure Biosystems公司。

1.2　Neuro-2a细胞和HEK293T细胞的培养

Neuro-2a细胞的生长培养基为MEM（含非必需氨基酸）+10%FBS+1%双抗，HEK293T细胞的生长培养基为DMEM高糖培养基+10%FBS+1%双抗，正常条件下2种细胞平均每隔2~3 d传代1次。

1.3　引物设计和合成

通过NCBI搜索PRDM5（Gene ID：70779）序列，结合引物设计原则和载体GV492阅读框克隆位点设计引物。PRDM5上游引物：5'-AGGTCGACTCTAGAGGATCCCGC-CACCATGCTGGGCATGTACGTACC-3'；下游引物：5'-TCCTTGTAGTCCATACCGGTGCT-GTCAGCTACCCCATGGATGTTG-3'。设计并合成PCR法鉴定引物，上游引物：5'-TCCACAAC-AGTGAGAGGACT-3'；下游引物：5'-CCTTAT-AGTCCTTATCATCGTC-3'。设计并合成PRDM5 qPCR引物，上游引物：5'-GATTGGCTACCTG-GACAGTGATG-3'；下游引物：5'-CACACTGT-GGACAGGCAAAGTC-3'。GAPDH qPCR引物，上游引物：5'-AGGTCAATGAAGGGGTCGTT-3'；下游引物：5'-AAATGGTGAAGGTCGGTGTG-3'。上述引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4　PRDM5慢病毒载体的构建

将合成的PRDM5基因引物通过PCR法扩增PRDM5基因。PCR法反应体系（20 μL）：DNA模板 1 μL，10×PCR缓冲液2 μL，上游引物（5 μmol∙L^-1）2 μL，下游引物 （5 μmol∙L^-1） 2 μL， dNTP （2.5 mmol∙L^-1）2 μL，高保真Taq酶PrimeSTAR 0.15 μL，ddH₂O加至20 μL进行PCR反应。酶切体系（20 μL）：GV492（1 g·L^-1）1 μL，10×NEB Buffer 2 μL，BamHⅠ0.5 μL，AgeⅠ0.5 μL，ddH₂O加至总体积20 μL，置于37 ℃恒温箱酶切过夜。将PCR法扩增出的PRDM5基因连接至GV492载体上，连接体系（15 μL）：PRDM5 DNA 8 μL，GV492载体2 μL，10×T4连接缓冲液1.5 μL，T4 DNA连接酶1 μL，ddH₂O加至15 μL。次日将连接产物进行转化，挑取单克隆进行酶切鉴定。

1.5　PRDM5慢病毒包装

于HEK293T细胞密度约为80%时，按照传代细胞与总细胞1∶3的比例均匀铺于100 mm细胞培养皿中培养过夜。转染体系分为Mixture A和Mixture B体系，Mixture A：750 μL Opti-MEM+15 μL Lipofactamine 2000；Mixture B：750 μL Opti-MEM+7.5 μg GV492-control或GV492-PRDM5+3.75 μg pHelper 1.0+3.75 μg pHelper 2.0。将Mixture A和Mixture B混合物轻柔滴加到细胞培养皿中，放回培养箱继续培养4~6 h，换成15 mL的生长培养基后继续培养48 h，即可收集细胞培养基进行病毒浓缩。

1.6　PRDM5慢病毒的滴度测定

将HEK293T细胞以每孔5×10⁴个的密度铺至96孔细胞培养板内，次日准备5个EP管，每个EP管内均加入90 μL的无血清培养基。在第1个EP管中再加入10 μL病毒原液，第1个EP管即为1E+1 μL；从第1个EP管中吸取10 μL置于第2个EP管中，第2个EP管即为1E+0 μL；随后从第2个EP管中吸取10 μL置于第3个EP管中，第3个EP管即为1E-1 μL。继续相同的操作直到第5个EP管；随后在对应孔内分别加入上述含病毒的培养基，4 d后在荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光表达情况。

1.7　PRDM5过表达慢病毒感染Neuro-2a细胞及构建稳定细胞

将细胞均匀铺在12孔细胞培养板中，选择感染复数（multiplicity of infection，MOI）为10、25、50和100，进行慢病毒感染Neuro-2a细胞实验。将Neuro-2a细胞分为GV492-control组和GV492-PRDM5组，分别将GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒加入至Neuro-2a细胞生长培养基中，配置含慢病毒的细胞培养基进行Neuro-2a细胞感染，24 h换液继续培养48 h，期间在荧光显微镜下观察慢病毒的感染效率和细胞的生长状态。感染48 h后采用嘌呤霉素（10 mg·L^-1）对感染慢病毒的细胞进行筛选，持续筛选2周。

1.8　RT-qPCR法检测2组Neuro-2a细胞中PRDM5 mRNA表达水平

使用TRIzol法提取Neuro-2a细胞中RNA反转录为cDNA，进行RT-qPCR反应，检测2组Neuro-2a细胞中PRDM5 mRNA表达水平。独立进行3次实验后，以GAPDH为内参，采用2^-△△Ct法计算Neuro-2a细胞中PRDM5 mRNA表达水平。

1.9　Western blotting法检测2组Neuro-2a细胞中PRDM5蛋白表达水平

使用RIPA（含蛋白酶抑制剂）裂解细胞收集蛋白，采用Western blotting 法检测2组Neuro-2a细胞中PRDM5蛋白表达水平。电泳条件：50 V、30 min，100 V、90 min。转膜后将对应条带分别加入PRDM5或GAPDH一抗4 ℃孵育过夜，次日室温孵育二抗1 h进行条带曝光。独立进行4次实验后，以GAPDH为内参，采用Image J软件对条带进行灰度值分析，计算PRDM5蛋白表达水平。PRDM5蛋白表达水平=PRDM5蛋白条带灰度值/GAPDH蛋白条带灰度值。

1.10　统计学分析

采用Graphpad Prism 6.0统计软件进行统计学分析。2组Neuro-2a细胞中PRDM5 mRNA和蛋白表达水平均符合正态分布，以x±s表示，2组间样本均数比较采用两独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　PRDM5过表达慢病毒载体的构建

通过NCBI搜索PRDM5（Gene ID：70779）序列设计引物，携带gcGFP/Puromycin的慢病毒GV492载体通过限制性内切酶BamHⅠ和AgeⅠ双酶切后，将PCR扩增的PRDM5基因连接至GV492载体上（图1A）。PCR法鉴定结果显示：GV492-PRDM5过表达重组质粒的基因片段长度约为684 bp，与预期结果一致（图1B）。将GV492-PRDM5质粒送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，将测序成功的序列与设计的PRDM5序列比对，二者的DNA序列完全匹配（图1C），表明PRDM5序列成功克隆至GV492载体中，PCR法鉴定和测序结果提示GV492-PRDM5慢病毒载体构建成功。

2.2　慢病毒感染及PRDM5过表达的Neuro-2a细胞的构建

GV492空载质粒和GV492-PRDM5重组质粒分别与辅助质粒共转染至HEK293T细胞，转染48 h后在荧光显微镜下可观察到绿色荧光，表明GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5重组过表达慢病毒包装成功。将收集的病毒液进行滴度测定：GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒的滴度均为2.5×10⁸ TU·mL^-1；根据MOI=100取相应的病毒量感染Neuro-2a细胞，感染72 h后加入嘌呤霉素（10 mg·L^-1）进行筛选24 h，随后继续使用半量的嘌呤霉素（5 mg·L^-1）对细胞继续筛选2周，在荧光显微镜下观察到GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒感染的Neuro-2a细胞生长状态良好且表达绿色荧光（图2），表明GV492-control-Neuro-2a和GV492-PRDM5-Neuro-2a稳定表达细胞构建成功。

2.3　2组Neuro-2a细胞中PRDM5 mRNA表达水平

与GV492-control组（1.09±0.11）比较，GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞中PRDM5 mRNA表达水平（2.33±0.15）明显升高（P<0.01）。

2.4　2组Neuro-2a细胞中PRDM5蛋白表达水平

GV492-control组和GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞中在相对分子质量约为75 000处均出现特异性条带，提示Neuro-2a细胞中PRDM5蛋白表达成功。与GV492-control组（1.09±0.04）比较，GV492-PRDM5组细胞中PRDM5蛋白表达水平（1.81±0.18）明显升高（P<0.01）。见图3。

3 讨 论

脑卒中包括出血性脑卒中和IS，其中IS占80%以上^［15］。IS是一种由于血栓阻塞导致血流不畅而造成脑组织缺血缺氧坏死的神经系统疾病，其主要临床表现为肢体偏瘫、视野偏盲和感觉障碍等，严重可致患者意识障碍甚至死亡^［16-17］。目前IS备受国内外专家关注，与其高患病率、高致残率、高死亡率和高医疗负担等存在密切关联。国际上IS最推荐的治疗方案是应用重组组织型纤溶酶原激活剂（recombinant tissue plasminogen activator，rtPA）进行静脉溶栓，但该治疗方法存在治疗时间窗短及出血风险大等弊端，因此有必要寻找一种更高效安全的治疗方法^［18-19］。

PRDM5可能在缺氧诱导脊髓损伤细胞模型的中枢神经系统病理生理中发挥重要作用^［5］，miR-182和miR-7a能够通过抑制PRDM5的表达进而抑制神经元的凋亡，减轻大鼠急性脊髓损伤^［20］。敲除长链非编码RNA BDNF反义RNA（long non-coding RNA BDNF antisense RNA， lncRNA BDNF-AS）能够通过下调miR-130b-5p靶基因PRDM5抑制缺氧诱导的急性脊髓损伤中神经细胞凋亡^［21］。IS常用的脑缺血再灌注损伤细胞模型即OGD/R也涉及到缺氧处理^［22-25］，因此本文作者猜测PRDM5可能参与IS的发生发展。

通过人类免疫缺陷病毒1型（human immunodeficiency virus type 1，HIV-1）构建的慢病毒载体能够通过外源基因有效地整合到受体细胞的染色体上，从而使外源基因得到长期稳定表达^［26］。本实验构建GV492-PRDM5过表达慢病毒载体，可使PRDM5得到长期稳定的表达。关于构建PRDM5过表达慢病毒载体及PRDM5-Neuro-2a细胞目前尚未见相关报道，因此本实验构建PRDM5稳定感染的细胞株具有一定的创新性，为后续直接使用GV492-PRDM5慢病毒稳转细胞系构建OGD/R脑缺血再灌注损伤模型提供参考，也为研究PRDM5在IS发生发展中作用提供条件。本研究中PCR法鉴定结果和DNA测序结果证实GV492-PRDM5过表达慢病毒载体构建成功，慢病毒感染Neuro-2a细胞后可在荧光显微镜下观察到绿色荧光，RT-qPCR法检测2组Neuro-2a细胞中PRDM5 mRNA的表达，结果显示：GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞中PRDM5 mRNA表达水平较GV492-control组明显升高。Western blotting法检测结果显示：2组Neuro-2a细胞中均有PRDM5蛋白的表达，GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞中PRDM5蛋白表达水平较GV492-control组明显升高。提示GV492-PRDM5的Neuro-2a细胞系构建成功，并且可以升高PRDM5的表达水平。

综上所述，本研究成功构建了GV492-PRDM5慢病毒表达载体，建立了稳定过表达GV492-PRDM5的Neuro-2a细胞，为进一步探讨PRDM5在IS的作用机制奠定了基础。

参考文献

[1] DI TULLIO F， SCHWARZ M， ZORGATI H， et al. The duality of PRDM proteins： epigenetic and structural perspectives［J］. FEBS J， 2022， 289（5）： 1256-1275.

[2] LESZCZYŃSKI P， ŚMIECH M， PARVANOV E， et al. Emerging roles of PRDM factors in stem cells and neuronal system： cofactor dependent regulation of PRDM3/16 and FOG1/2 （novel PRDM factors）［J］. Cells， 2020， 9（12）： 2603.

[3] CASAMASSIMI A， RIENZO M， DI ZAZZO E， et al. Multifaceted role of PRDM proteins in human cancer［J］. Int J Mol Sci， 2020， 21（7）： 2648.

[4] MEHMOOD S， DAD R， AHMAD A， et al. Structural and functional annotation of PR/SET domain （PRDM） protein family： in-silico study elaborating role of PRDM12 mutation in congenital insensitivity to pain［J］. Comput Biol Chem， 2020， 89： 107382.

[5] LIU J， WU W J， HAO J， et al. PRDM5 expression and essential role after acute spinal cord injury in adult rat［J］. Neurochem Res， 2016， 41（12）： 3333-3343.

[6] DUAN Z J， PERSON R E， LEE H H， et al. Epigenetic regulation of protein-coding and microRNA genes by the Gfi1-interacting tumor suppressor PRDM5［J］. Mol Cell Biol， 2007， 27（19）： 6889-6902.

[7] DENG Q D， HUANG S. PRDM5 is silenced in human cancers and has growth suppressive activities［J］. Oncogene， 2004， 23（28）： 4903-4910.

[8] TAN S X， HU R C， TAN Y L， et al. Promoter methylation-mediated downregulation of PRDM5 contributes to the development of lung squamous cell carcinoma［J］. Tumour Biol， 2014， 35（5）： 4509-4516.

[9] WANG L， DING Q Q， GAO S S， et al. PRDM5 promotes the proliferation and invasion of murine melanoma cells through up-regulating JNK expression［J］. Cancer Med， 2016， 5（9）： 2558-2566.

[10] ZHOU P， CHEN X， LI M K， et al. Overexpression of PRDM5 promotes acute myeloid leukemia cell proliferation and migration by activating the JNK pathway［J］. Cancer Med， 2019， 8（8）： 3905-3917.

[11] GUO X L， CHEN H， LI S N， et al. LncRNA MALAT1 promotes neuronal apoptosis during spinal cord injury through miR-199a-5p/PRDM5 axis［J］. Turk Neurosurg， 2024， 34（2）： 196-205.

[12] ZHANG Y， WANG S S， LI H L， et al. MiR-495 reduces neuronal cell apoptosis and relieves acute spinal cord injury through inhibiting PRDM5［J］. J Mol Histol， 2021， 52（2）： 385-396.

[13] ZHANG H F， WANG W G， LI N， et al. LncRNA DGCR5 suppresses neuronal apoptosis to improve acute spinal cord injury through targeting PRDM5［J］. Cell Cycle， 2018， 17（16）： 1992-2000.

[14] ZHANG Y， LIU X J， XUE H Q， et al. Upregulation of PRDM5 is associated with astrocyte proliferation and neuronal apoptosis caused by lipopolysaccharide［J］. J Mol Neurosci， 2016， 59（1）： 146-157.

[15] SARVARI S， MOAKEDI F， HONE E， et al. Mechanisms in blood-brain barrier opening and metabolism-challenged cerebrovascular ischemia with emphasis on ischemic stroke［J］. Metab Brain Dis， 2020， 35（6）： 851-868.

[16] FESKE S K. Ischemic stroke［J］. Am J Med， 2021， 134（12）： 1457-1464.

[17] JOLUGBO P， ARIËNS R A S. Thrombus composition and efficacy of thrombolysis and thrombectomy in acute ischemic stroke［J］. Stroke， 2021， 52（3）： 1131-1142.

[18] HERPICH F， RINCON F. Management of acute ischemic stroke［J］. Crit Care Med， 2020， 48（11）： 1654-1663.

[19] RABINSTEIN A A. Update on treatment of acute ischemic stroke［J］. Continuum， 2020， 26（2）： 268-286.

[20] LING W Q， XU X， LIU J B. A causal relationship between the neurotherapeutic effects of miR182/7a and decreased expression of PRDM5［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2017， 490（1）： 1-7.

[21] ZHANG H F， LI D Z， ZHANG Y， et al. Knockdown of lncRNA BDNF-AS suppresses neuronal cell apoptosis via downregulating miR-130b-5p target gene PRDM5 in acute spinal cord injury［J］. RNA Biol， 2018， 15（8）： 1071-1080.

[22] LI S N， CHEN S F， WANG Y J， et al. Direct targeting of DOCK4 by miRNA-181d in oxygen-glucose deprivation/reoxygenation-mediated neuronal injury［J］. Lipids Health Dis， 2023， 22（1）： 34.

[23] SHARMA A， BRENNER M， JACOB A， et al. Extracellular CIRP activates the IL-6Rα/STAT3/Cdk5 pathway in neurons［J］. Mol Neurobiol， 2021， 58（8）： 3628-3640.

[24] ZHANG G L， GUO J H， ZENG J， et al. LncRNA SNHG14 is beneficial to oxygen glucose deprivation/reoxygenation-induced neuro-2a cell injury via mir-98-5p sequestration-caused BCL2L13 upregulation［J］. Metab Brain Dis， 2022， 37（6）： 2005-2016.

[25] DONG W， CHEN Q F， ZHAO S Y， et al. IKKα contributes to ischemia-induced autophagy after acute cerebral ischemic injury［J］. Ann Transl Med， 2022， 10（4）： 160.

[26] COCKRELL A S， KAFRI T. Gene delivery by lentivirus vectors［J］. Mol Biotechnol， 2007， 36（3）： 184-204.

基金资助

国家自然科学基金项目(81571157)

广东省基础与应用基础研究基金委员会自然科学基金面上项目(2023A1515012750)

广东省卫健委医学科研基金项目(A2022139)

广东医科大学百项青年研究项目资助计划项目(GDMUD2022010)