低剂量甲氨蝶呤联合索拉非尼对小鼠骨肉瘤移植瘤的影响及其机制

Effect of low dose of methotrexate combined with sorafenib on osteosarcoma xenografts of mice and its mechanism

摘要

目的：探讨低剂量甲氨蝶呤（MTX）联合索拉非尼（SFN）对人骨肉瘤（OS）的抗肿瘤作用，并阐明其可能的作用机制。方法：体外培养4种人OS细胞（143B细胞、HOS细胞、U2OS细胞和MG63细胞），采用Western blotting法测定各种细胞中的血管内皮生长因子（VEGF）和血管内皮细胞生长因子受体2 （VEGFR2）蛋白表达水平；建立人OS裸鼠皮下移植瘤模型，并将建模成功的20只BABL/C裸鼠随机分为对照组（给予2%二甲基亚砜+98%玉米油）、低剂量MTX组(给予2 mg·kg^-1 MTX)、SFN组(给予15 mg·kg^-1 SFN)和联合用药组(给予2 mg·kg^-1 MTX+15 mg·kg^-1SFN)，每组5只，测量各组小鼠肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线；HE染色观察4组小鼠肿瘤组织病理形态表现，免疫组织化学法检测各组小鼠肿瘤组织中VEGFR2、细胞增殖抗原Ki-67和缺氧诱导因子1（HIF-1）蛋白阳性表达率；人OS 143B细胞分别给予0、 0.125、 0.250、 0.500、 1.000、 2.000和4.000μmol·L^-1 MTX处理，CCK-8法检测各组143B细胞存活率，计算半数抑制浓度（IC50），并选取对143B细胞存活无影响的MTX浓度作为低剂量MTX；人OS 143B细胞分为对照组和低剂量MTX组(给予0和0.250μmol·L^-1 MTX处理)，酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测各组143B细胞中VEGF水平。结果：与143B细胞比较，HOS细胞、U2OS细胞和MG63细胞中VEGF及VEGFR2蛋白表达水平明显降低（P<0.001）。裸鼠皮下移植瘤模型中，与对照组比较，SFN组和联合用药组小鼠皮下移植瘤体积减少（P<0.001），与低剂量MTX组和SFN组比较，联合用药组小鼠皮下移植瘤体积减少（P<0.01）。免疫组织化学法，与对照组比较，联合用药组小鼠肿瘤组织中Ki-67、VEGFR2和HIF-1蛋白阳性表达率明显降低（P<0.05）。CCK-8法，0.250μmol·L^-1 MTX对143B细胞增殖无明显改变。ELISA法，与对照组比较，低剂量MTX组143B细胞中VEGF水平明显降低（P<0.05）。结结论论：低剂量MTX促进了SFN对人OS的抗肿瘤作用，其可能是通过抑制OS细胞分泌VEGF进而增强SFN对人OS的抗肿瘤作用。

关键词

骨肉瘤 / 索拉非尼 / 甲氨蝶呤 / 抗肿瘤 / 血管内皮生长因子

Key words

Osteosarcoma / Sorafenib / Methotrexate / Anti-tumor / Vascular endothelial growth factor

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是一种高度恶性的骨肿瘤，多发于儿童和青少年。尽管近年来术后化疗及靶向药物治疗取得了一定进展，但部分OS患者由于肿瘤的广泛转移或对药物的敏感性及耐受性差，使得治疗效果并不理想，其5年生存率不足30%^［1］。血管生成在OS患者的肿瘤进展中起重要作用^［2-3］，通过阻断血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信号传导抑制OS细胞生长并诱导细胞凋亡^［2-4］。其中血管内皮细胞生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR2）是参与血管生成分子VEGF的受体，与OS细胞增殖和转移存在密切关联^［5-7］。索拉非尼（sorafenib，SFN）作为多激酶抑制剂，可抑制肿瘤细胞的复制及肿瘤血管生成，美国国立综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）指南已将SFN作为晚期OS的重要治疗药物^［8］。然而临床试验研究^［9］结果提示SFN单药治疗患者的生存获益时间有限。大剂量甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）是OS一线化疗药物，而低剂量MTX可抑制OS患者肿瘤转移，其机制可能与低剂量MTX抗血管生成存在关联^［10］，但是目前国内外关于低剂量MTX与SFN联合治疗OS的相关报道较少。因此，本研究探讨低剂量MTX联合SFN在裸鼠皮下移植瘤模型中的抗肿瘤作用，阐明其可能的作用机制，为低剂量MTX联合SFN的抗肿瘤机制研究提供依据。

1 材料与方法

1.1　实验动物、细胞、主要试剂和仪器

20只BABL/C裸鼠，无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级，5周龄，体质量（20±2）g，购于杭州子源实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK（浙）2019-0004，饲养于苏州大学附属儿童医院动物中心SPF级动物房，相对湿度55%~60%。人OS细胞143B细胞（货号：FH0438）、HOS细胞（货号：FH0440）和U2OS细胞（货号：FH0062）购于上海富衡生物有限公司，MG63细胞（货号：CL-0157）购于武汉普诺赛生物技术公司。MTX（货号：HY-14519）和SFN（货号：HY-10201）购于美国MCE公司，酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒（货号：UX064ZZR2194）和细胞活性检测（cell counting kit-8，CCK-8）试剂盒（货号：AK10985）购于武汉伊莱瑞特生物科技有限公司，MEM/Alpha培养基（货号：BL306A）购于北京Biosharp公司，胰蛋白酶（货号：C0201）购于上海碧云天生物技术有限公司，南美胎牛血清（货号：S711001S）购于苏州双洳生物科技有限公司，VEGF抗体（货号：50661S）和VEGFR2抗体（货号： 2479S） 购于美国Cell signaling Technology公司，缺氧诱导因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）抗体（货号：GB113441）和细胞增殖抗原（Ki-67）抗体（货号：GB114499）购于武汉赛维尔生物有限公司。二氧化碳培养箱（型号：C170）购于美国Thermo Fisher有限公司，高速冷冻离心机（型号：5810R）购于德国艾本德公司，GE凝胶成像仪（型号：Imager 600 LAS4010）购于苏医生物基因技术有限公司，光学倒置显微镜（型号：CKX41）购于日本奥林巴斯公司。

1.2　OS细胞培养

人OS 143B细胞、HOS细胞、U2OS细胞和MG63细胞均培养于含10%胎牛血清及1%青-链霉素的MEM/Alpha培养基中，于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养。待细胞融合度为80%~90%时，按比例进行细胞传代。

1.3　Western blotting法检测各种OS细胞中VEGF和VEGFR2蛋白表达水平

收集上述人OS细胞，双吡啶甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法检测细胞裂解液蛋白浓度，湿转蛋白至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜。TBST溶液配置5%脱脂牛奶，膜封闭1 h，一抗孵育过夜（不超过16 h）。第2天室温下用TBST溶液洗涤膜3次，每次10 min。加入二抗，室温孵育2 h，TBST溶液漂洗3次，每次10 min，利用底物化学发光法显影分析，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参。采用Image J软件分析蛋白条带灰度值，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。

1.4　小鼠OS皮下移植瘤模型的制备及分组

取处于对数生长期的人OS 143B细胞，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）调整细胞密度至5×10⁷ mL^-1，皮下注射至裸鼠右前肢腋下，当小鼠腋下肿瘤体积≥150 mm³开始给药^［11］，将小鼠随机分为对照组、低剂量MTX组、SFN组和联合用药（MTX+SFN）组。对照组：使用空白溶剂（2%二甲基亚砜+98%玉米油）给药。低剂量MTX组：单独使用2 mg·kg^-1 MTX腹腔注射，每5 d 1次，共2次；SFN组：15 mg·kg^-1 SFN灌胃，每日1次，共10 d；联合用药组：分别用2 mg·kg^-1 MTX和15 mg·kg^-1 SFN治疗，疗程同上。

1.5　荷瘤小鼠一般情况观察及移植瘤体积测量

每隔1 d测量小鼠移植肿瘤大小和小鼠体质量。肿瘤体积计算方法：肿瘤体积=0.5×a×b²，其中a为肿瘤最长直径（mm），b为肿瘤最短直径（mm）。给药结束后次日，通过颈椎脱位处死小鼠后，皮下获取肿瘤，肿瘤样本送赛维尔生物公司进行HE染色，观察各组小鼠肿瘤组织病理形态表现。

1.6　免疫组织化学法检测各组小鼠肿瘤组织中Ki-67、VEGFR2和HIF-1蛋白阳性表达率

取小鼠肿瘤组织，切片脱蜡水化，利用 H₂O₂溶液处理以消除内源性过氧化物酶，微波修复抗原，一抗4 ℃孵育过夜，用PBS缓冲液冲洗3次，加入二抗，37 ℃孵育1 h，二氨基联苯胺 （3，3'-diaminobenzidine，DAB）显色，苏木精复染，中性树脂封片。Ki-67：以细胞核染成棕黄色为阳性反应，采用Image J软件分析细胞阳性表达率；VEGFR2：以肿瘤细胞的胞质中出现棕黄色颗粒为染色阳性；HIF-1：以肿瘤细胞的胞质或细胞核中出现棕黄色颗粒为染色阳性，每张片子随机选取5个视野，用Image J软件分析细胞阳性表达率。细胞阳性表达率=棕黄色颗粒染色阳性细胞面积/总面积×100%。

1.7　CCK-8法检测不同浓度MTX处理后143B细胞存活率

将143B细胞以每孔3×10³个的密度接种至96孔细胞培养板中。次日使用0、0.125、0.250、0.500、1.000、2.000和4.000 µmol·L^-1 MTX作用48 h后，向每个孔中加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃继续孵育2 h。于波长450 nm处测量吸光度（A）值，并计算细胞存活率。细胞存活率=（实验孔A值－空白孔A值）/（对照孔A值－空白孔A值）×100%。采用非线性回归分析自动拟合剂量-反应曲线计算药物半数抑制浓度（half inhibitory concentration，IC₅₀）值。

1.8　ELISA法检测各组143B细胞中VEGF水平

将人OS143B细胞分为对照组和低剂量MTX组，分别给予0和0.250 µmol·L^-1 MTX。将试剂平衡至室温，30倍浓缩后，按1∶33的比例加入至蒸馏水中，混匀备用。对应板孔中加入100 μL标准品工作液或样本，37 ℃水浴孵育90 min；弃掉板内液体，加入100 μL生物素化抗体工作液，37 ℃孵育60 min；洗涤3次；每孔加入100 μL酶结合物工作液，37 ℃孵育30 min，洗板5次；每孔加入90 μL底物溶液，37 ℃孵育15 min；每孔加入50 μL终止液，立即于450 nm波长处测量A值。计算标准品和样本复孔的平均A值并减去空白孔的A值作为校正值。以浓度为横坐标，A值为纵坐标，在双对数坐标轴上拟合四参数逻辑函数的标准曲线。根据标准曲线方程计算各样本VEGF水平，结果以ng·L^-1表示。

1.9　统计学分析

采用 SPSS 26.0和Graphpad Prism 7.0统计软件进行统计学分析。各组OS细胞中VEGF和VEGFR2蛋白表达水平，各组小鼠皮下移植瘤体积和小鼠体质量，肿瘤组织中Ki-67、VEGFR2和HIF-1阳性表达率，143B细胞存活率和VEGF水平均符合正态分布，以x±s表示。多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用SNK-q检验；2组间样本均数比较采用两独立样本t检验。所有实验重复3次。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　不同人OS细胞中VEGF和VEGFR2蛋白表达水平

与143B细胞比较，HOS、MG63和U2OS细胞中VEGF及VEGFR2蛋白表达水平均明显降低（P<0.001）。见图1。以上结果提示：143B细胞中VEGF信号异常激活。鉴于SFN对VEGFR家族具有抗肿瘤的药理作用，因此选用143B细胞构建小鼠OS皮下移植瘤模型。

2.2　各组小鼠皮下移植瘤体积

与对照组比较，SFN组和联合用药组小鼠皮下移植瘤体积减少（P<0.001），低剂量MTX组小鼠皮下移植瘤体积未见明显减少，差异无统计学意义（P>0.05）；与低剂量MTX组和SFN组比较，联合用药组小鼠皮下移植瘤体积减少（P<0.001）。见图2。

2.3　各组小鼠不同时间点体质量

对照组、低剂量MTX组、SFN组和联合用药组小鼠体质量分别为（21.56±0.81）g、（19.66±0.42）g、（18.60±1.81）g及（18.50±1.35）g，SFN和低剂量MTX联合SFN导致小鼠体质量轻微减轻，但各组小鼠不同时间点的体质量比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见图3。

2.4　各组小鼠肿瘤组织病理形态表现及肿瘤组织Ki-67、VEGFR2和HIF-1蛋白阳性表达率

HE染色结果显示：对照组和低剂量MTX组小鼠肿瘤组织具有高密度的多形性及梭形OS细胞；SFN组小鼠肿瘤细胞呈现中重度坏死为主；而联合用药组以重度坏死为主，可见细胞间隙呈空泡状。免疫组织化学染色法结果显示：与对照组、低剂量MTX组和SFN组比较，联合用药组小鼠肿瘤组织中增殖相关分子Ki-67蛋白阳性表达率减少（P<0.001）；与对照组比较，联合用药组和SFN组小鼠肿瘤组织中VEGFR2阳性表达率减少（P<0.05）；与对照组比较，低剂量MTX组和联合用药组小鼠肿瘤组织中HIF-1阳性表达率减少（P<0.05）。见图4、5和6。

2.5　不同剂量MTX作用下143B细胞存活率及VEGF水平

CCK-8实验检测结果显示：高剂量MTX对143B细胞的增殖具有抑制作用，该作用呈剂量依赖性，IC₅₀为1.77 μmol·L^-1。见图7。选取对143B细胞增殖无显著影响（细胞存活率为98.81%±3.18%）的低剂量MTX，浓度为0.250 μmol·L^-1。ELISA法检测结果显示：与对照组（1 178.23 ng·L^-1±62.23 ng·L^-1）比较，低剂量MTX组143B细胞中VEGF水平（822.70 ng·L^-1±60.46 ng·L^-1）降低（P<0.05）。

3 讨 论

OS高度依赖血管生成，传统的治疗方法易产生耐药性，术后复发和转移是OS预后不良的主要原因^［12］。分子靶向药物SFN作为一种口服多靶点受体酪氨酸激酶抑制剂，其可通过靶向VEGF通路抑制血管生成。临床试验^［13］结果显示：OS患者使用SFN可能会出现疾病进展。因此，寻找能增强SFN抗肿瘤作用的药物具有重要的临床价值。

2000年BROWDER等^［14］研究显示：持续低剂量环磷酰胺能使肿瘤血管内皮细胞凋亡，提示低剂量的细胞毒性药物可能具有抗血管生成作用。同年，研究者也证实持续低剂量的长春花碱能够抑制肿瘤血管生成^［15］。在上述2项研究基础上，HANAHAN等^［16］提出了节拍化疗的理念。节拍化疗是指高频度、规律地给予低剂量化疗药物，旨在维持有效性但不增加额外毒性。然而，尽管节拍化疗毒性较小，但多数节拍化疗作为单一药物用于晚期癌症患者的治疗效果非常有限^［17］。KERBEL等^［17］提出节拍化疗与抗血管生成药物的联合应用不仅可以减轻化疗药物常见的骨髓抑制和心脏毒性等毒副作用，还能提高疗效。本研究结果显示：低剂量MTX联合SFN可以显著抑制小鼠OS移植瘤的生长，且其作用明显强于SFN组；联合给药对小鼠体质量影响不明显，表明联合用药组在体内的耐受性良好。

VEGF在肿瘤耐药的过程中起着关键作用，其通过改变肿瘤微环境和调控肿瘤细胞内信号通路，促进肿瘤的生长、侵袭性和耐药性^［18］。一方面，肿瘤本身微环境中高浓度的VEGF可能通过保护肿瘤相关内皮细胞进而促进细胞毒性药物耐药^［19］；另一方面，细胞毒性药物也可能通过上调肿瘤相关内皮细胞中VEGF和其他促进生存的内皮细胞生长因子的表达产生自我保护效应^［20-21］；细胞毒性药物与阻断VEGF或其受体的药物联合，可选择性地放大细胞毒性药物对肿瘤相关内皮细胞的促凋亡作用，从而提高治疗指数^［15］。尽管细胞毒性药物对肿瘤相关内皮细胞的作用已有相关报道，但细胞毒性药物对肿瘤细胞中VEGF的影响及其与靶向药物联合应用的作用机制目前尚未完全阐明。本研究结果显示：低剂量MTX可能通过抑制肿瘤细胞增殖和血管生成增强SFN的抗肿瘤效果。本研究体外实验结果显示：0.25 μmol·L^-1 MTX对143B细胞的生长无显著抑制作用，却能明显降低VEGF的分泌，而SFN为VEGFR靶点抑制剂，由此提示低剂量MTX增强SFN抗OS的作用是通过抑制VEGF/VEGFR完成的。研究^［22］显示：缺氧是包括OS在内的实体肿瘤的普遍特征，缺氧可通过HIF-1α上调VEGF的表达，促进血管生成和肿瘤生长。敲低HIF-1α后，缺氧诱导的VEGF降低，且皮下和原位小鼠移植瘤的生长速率均显著减慢^［23］。KARAKUYU等^［24］发现：MTX可以显著降低大鼠肾脏氧化应激模型中HIF-1α表达水平，提示MTX可能是通过抑制HIF-1α信号进而抑制OS细胞分泌VEGF，免疫组织化学染色检测结果也提示低剂量MTX组和联合用药组HIF-1的表达水平显著低于对照组和SFN组，其具体作用机制有待进一步研究。

综上所述，低剂量MTX可能通过抑制OS细胞分泌VEGF进而增强了SFN对移植瘤的抑制作用，但其作用机制还有待进一步研究。

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基金资助

国家自然科学基金青年基金项目(32200775)

江苏省教育厅高等学校基础科学（自然科学）面上项目(21KJB320017)

苏州市科技局科教强卫项目(KJXW2020026)