硫化氢合成酶CBS和CSE对乳腺癌细胞恶性生物学行为的影响

Effects of hydrogen sulfide synthase CBS and CSE on malignant biological behaviour of breast cancer cells

摘要

目的：探讨胱硫醚-β-合酶（CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）的表达及其对乳腺癌细胞恶性生物学行为的影响，并阐明其作用机制。方法：选择15例乳腺癌患者的乳腺癌组织和癌旁正常组织，采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)和Western blotting法检测乳腺癌组织和癌旁正常组织以及MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞中CBS和CSE的mRNA及蛋白表达水平。将MCF-7细胞分为siNC组（转染siNC）和siCBS组（转染siCBS）,MDA-MB-231细胞分为ovNC组（转染CSE过表达空载质粒）和ovCSE组（转染CSE过表达质粒）。CCK-8法检测各组乳腺癌细胞的增殖活性，Transwell小室实验检测各组细胞的迁移和侵袭细胞数，Western blotting法检测各组乳腺癌细胞中E钙黏蛋白（E-cadherin）、神经钙黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）表达水平。结果：与癌旁正常组织比较，乳腺癌组织中CBS和CSE mRNA及蛋白表达水平升高（P<0.05或P<0.01）。与MDA-MB-231细胞比较，MCF-7细胞中CBS mRNA表达水平升高（P<0.05）；与MCF-7细胞比较，MDA-MB-231细胞中CSE蛋白表达水平降低（P<0.05）。与siNC组比较，siCBS组MCF-7细胞增殖活性、迁移和侵袭细胞数、 N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平明显降低（P<0.05）, E-cadherin蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。与ovNC组比较，ovCSE组MDA-MB-231细胞增殖活性、迁移和侵袭细胞数、N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平明显升高（P<0.05）,E-cadherin蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。结论：CBS和CSE在乳腺癌组织中表达上调，高水平的CBS和CSE促进乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭和上皮-间质转化（EMT）。

关键词

胱硫醚-β-合酶 / 胱硫醚-γ-裂解酶 / 硫化氢 / 乳腺肿瘤 / 细胞增殖 / 细胞迁移

Key words

Cystathionine-β-synthase / Cystathionine-γ-lyase / Hydrogen sulfide / Breast neoplasms / Cell proliferation / Cell migration

乳腺癌是全球最常见的癌症之一。2020年，女性乳腺癌占所有癌症病例的11.7%，约12.9%的女性会患乳腺癌^［1-2］。在女性中，乳腺癌相对于其他癌症是导致死亡的主要原因^［1］。从手术治疗发展至放疗、化疗、内分泌治疗、靶向治疗和免疫治疗，乳腺癌治疗已取得较大进展，但仍有部分患者会发生局部复发或远处转移，导致其生存率下降^［3-4］。因此探索新的治疗方式和治疗靶点成为未来重要研究方向。硫化氢（hydrogen sulfide，H₂S）是一种重要的气体递质，在人体中发挥着重要的功能^［5］。H₂S发挥促进肿瘤的生长、细胞迁移、细胞侵袭、血管生成和上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）等作用^［6］。研究^［7］显示：低浓度持续加入外源性的H₂S可以通过诱导肿瘤抑制因子sONE（一种新型长链非编码RNA）降低乳腺癌细胞的侵袭性^［7］。在哺乳动物中，H₂S主要由胱硫醚-β-合酶（cystathionine-β-synthase，CBS）、胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine-γ-lyase，CSE）和3-巯基丙酮酸-硫转移酶（3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，3-MST）产生。H₂S合成酶已被证实在多种肿瘤中高表达^［6］。通过抑制H₂S合成酶减少内源性H₂S的释放，从而抑制肿瘤的进展^［8］。但目前H₂S在癌症进展中的作用尚存在争议，且H₂S合成酶在乳腺癌中研究较少，其在乳腺癌中具体的调控作用尚未明晰。因此，本研究通过实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）和Western blotting法验证H₂S合成酶在乳腺癌中的表达，沉默CBS和过表达CSE来进一步探讨H₂S合成酶在乳腺癌中的具体分子机制，以期为乳腺癌提供新的治疗靶点。

1 资料与方法

1.1　乳腺癌标本、细胞、主要试剂和仪器

收集2022年4月—2023年11月于石河子大学第一附属医院进行乳腺癌手术15例患者的样本作为研究对象。选择距肿瘤组织>5 cm且病理诊断为非癌组织作为癌旁正常组织。所有患者的病理诊断均为乳腺浸润性导管癌，术前均未接受过放疗、化疗及其他肿瘤相关治疗。本研究经石河子大学第一附属医院医学伦理委员会批准（伦理号：KJ2023-433-01），且所有患者均已签署知情同意书。MCF-7细胞购自武汉赛维尔生物科技有限公司，MDA-MB-231细胞购自上海复祥生物科技有限公司，胎牛血清购自以色列BI公司，TB Green^® Premix Ex Taq^TMⅡ购自日本宝日医生物技术有限公司，BCA蛋白定量检测试剂盒购自美国Thermo Fisher公司，CCK-8检测试剂盒购自兰杰柯科技有限公司，Transwell小室购自美国Corning公司，CBS抗体、CSE抗体、E钙黏蛋白（E-cadherin）抗体、神经钙黏蛋白（N-cadherin）抗体和波形蛋白（Vimentin）抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司，GAPDH抗体购自中杉金桥公司，CBS小干扰RNA（siCBS）及其阴性对照（siNC）由上海吉玛公司提供，Lipo8000^TM转染试剂购自上海碧云天生物技术股份有限公司，CSE过表达质粒（over expression CSE，ovCSE）和阴性对照（ovNC）购自重庆优宝生物技术股份有限公司，质粒提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，细胞爬片购自北京索莱宝科技有限公司。全自动酶标仪购自美国Thermo Fisher公司，OLYMPUS CKX53倒置显微镜购自日本奥林巴斯公司，Gelview 6000ProⅡ化学发光仪购自广州博鹭腾生物科技有限公司，7500 Fast Real Time PCR System荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.2　细胞培养、分组和转染

MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞用含有10%的胎牛血清与1%青-链霉素混合液的DMEM培养基，5% CO₂、37 ℃且具有一定湿度的培养箱中培养，2~3 d传代1次。取处于对数生长期的MCF-7细胞分为siNC组（转染siNC）和siCBS组（转染siCBS），MDA-MB-231细胞分为ovNC组（转染CSE过表达空载质粒）和ovCSE组（转染CSE过表达质粒）。

按照Lipo8000^TM转染试剂说明书将siCBS及其阴性对照siNC转染至MCF-7细胞中，过表达CSE质粒和CSE过表达空载质粒转染至MDA-MB-231细胞中。转染后的细胞生长24和48 h后进行RT-qPCR和Western blotting实验或其他实验。

1.3　RT-qPCR法检测乳腺癌组织以及乳腺癌细胞中CBS和CSE mRNA表达水平

采用TRIzol裂解组织和细胞，收集上清，利用氯仿、异丙醇和无水乙醇提取RNA，并按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为总体积20 μL的cDNA，利用TB Green^® Premix Ex Taq^TMⅡ试剂盒进行PCR扩增。PCR法反应条件：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、20 s，40个循环。以GAPDH为内参基因，采用2^-∆∆Ct 法计算目的基因表达水平。引物序列见表1。

1.4　Western blotting法检测乳腺癌组织中CBS和CSE以及各组乳腺癌细胞中EMT相关蛋白表达水平

采用RIPA裂解液提取组织和各组细胞的蛋白，使用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白浓度的测定。利用SDS-PAGE电泳分离蛋白，采用湿转法将蛋白转移至PVDF膜上，使用5%的脱脂奶粉封闭2 h，封闭结束后按照对应比例加入CBS、CSE、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和GAPDH一抗，4 ℃摇床孵育过夜。第2天进行洗膜、孵育二抗、曝光。使用Image J软件分析蛋白条带灰度值，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。

1.5　CCK-8法检测各组细胞增殖活性

细胞转染后，按照每孔3 000~5 000个细胞数量，将各组细胞铺于96孔细胞培养板中。待细胞贴壁后，按照所需检测时间0、24、48和72 h，每孔加入10 μL CCK-8试剂，继续置于37 ℃培养箱中培养2~4 h后，采用全自动酶标仪检测各孔吸光度（A）值。细胞增殖活性=［（实验组A值-空白组A值）/（对照组A值-空白组A值）］×100%，空白组仅加入培养基（用于调零）。

1.6　Transwell小室实验检测各组细胞迁移和侵袭细胞数

Transwell细胞迁移实验：将转染好的各组细胞进行消化计数，向上室中接种200 μL无血清的单细胞悬液，下室为600 μL含20%血清的培养基，置于37 ℃培养箱中培养。24 h后将24孔细胞培养板取出，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）清洗小室，4%多聚甲醛固定30 min，结晶紫染色20 min，用棉签轻轻擦去小室内部的细胞，干燥后于倒置显微镜下拍照，最后采用Image J图像软件进行迁移细胞计数。Transwell细胞侵袭实验除需使用基底胶之外，其他步骤与细胞迁移实验相同。

1.7　统计学分析

采用SPSS 26.0统计软件进行统计学分析。乳腺癌组织、癌旁正常组织以及各组细胞中CBS和CSE的mRNA及蛋白表达水平，各组细胞增殖活性、迁移细胞数、侵袭细胞数、细胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平均符合正态分布，以x±s表示，2组间样本均数比较采用两独立样本t检验，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　乳腺癌组织和癌旁正常组织中CBS及CSE mRNA以及蛋白表达水平

RT-qPCR法检测结果显示：与癌旁正常组织比较，乳腺癌组织中CBS和CSE mRNA表达水平升高（P<0.05）。见图1。Western blotting法检测结果显示：在乳腺癌组织中CBS和CSE蛋白表达水平明显高于癌旁正常组织（P<0.01）。见图2。

2.2　在不同乳腺癌细胞中CBS和CSE mRNA及蛋白表达水平

RT-qPCR和Western blotting法检测结果显示：与MDA-MB-231细胞比较，MCF-7细胞中CBS mRNA表达水平升高（P<0.01），在2株乳腺癌细胞中CSE mRNA表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。Western blotting法检测结果显示：与MCF-7细胞比较，MDA-MB-231细胞中CSE蛋白表达水平降低（P<0.01）。见图3和4。因此本研究选择在MCF-7细胞中敲低CBS，在MDA-MB-231细胞中过表达CSE，分析通过干预调控2种H₂S关键酶后对乳腺癌细胞恶性生物学行为的影响。

2.3　siCBS和ovCSE转染条件的筛选

首先采用RT-qPCR和Western blotting法确定CBS是否在MCF-7中敲低，结果显示：与siNC组比较，CBS的mRNA和蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。见图5和6。采用RT-qPCR和Western blotting实验验证过表达CSE转染比例，结果显示：在质粒用量（μg）∶Lipo8000^TM（μL）为1∶1.6转染比例下，MDA-MB-231细胞中CSE表达水平最高（P<0.01）。见图7和8。

2.4　各组乳腺癌细胞的增殖活性

CCK-8法检测结果显示：与siNC组比较，siCBS组MCF-7细胞增殖活性明显降低（P<0.01）。见图9。与ovNC组比较，ovCSE组MDA-MB-231细胞增殖活性明显增强（P<0.01）。见图10。提示干预CBS和CSE的表达可以影响乳腺癌细胞的增殖。

2.5　各组乳腺癌细胞中迁移和侵袭细胞数

Transwell小室实验检测结果显示：与siNC组比较，siCBS组MCF-7细胞迁移和侵袭细胞数减少（P<0.05）。见图11和12。与ovNC组比较，ovCSE组MDA-MB-231细胞迁移和侵袭细胞数增加（P<0.05）。见图13和14。提示CBS和CSE可以调控乳腺癌细胞的迁移和侵袭。

2.6　各组乳腺癌细胞中EMT相关蛋白表达水平

在MCF-7细胞中，与siNC组比较，siCBS组MCF-7细胞中E-cadherin蛋白表达水平明显升高（P<0.01），N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。见图15。在MDA-MB-231细胞中，与ovNC组比较，ovCSE组MDA-MB-231细胞中E-cadherin蛋白表达水平明显降低（P<0.05），N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平明显升高（P<0.01）。见图16。提示CBS和CSE参与乳腺癌细胞EMT。

3 讨 论

乳腺癌相较于其他癌症治疗方式多样，早期乳腺癌患者的5年生存率较高^［4］。基因突变或基因表达的改变是导致乳腺癌转移的主要原因^［2］。许多药物在乳腺癌中具有应用前景，但单独或者联合用药时，总体效果较差^［9］。因此寻找乳腺癌新的治疗靶点至关重要。

在多种癌症类型中发现了H₂S合成酶的失调。通过调节H₂S合成酶的表达，改变肿瘤来源H₂S水平，从而改变肿瘤微环境，影响肿瘤的生长和转移^［10］。在生理条件下，3-MST对H₂S的贡献较低^［11］，因此本研究选择CBS和CSE作为研究对象，结果显示：在乳腺癌组织中CBS和CSE的mRNA及蛋白表达水平均明显升高，且CBS在MCF-7细胞中高表达，CSE在MDA-MB-231细胞中低表达。因此本研究选择在MCF-7细胞中敲低CBS，在MDA-MB-231细胞中过表达CSE，检测调控H₂S合成酶蛋白水平后对乳腺癌增殖和迁移能力的影响。本研究结果显示：H₂S合成酶CBS和CSE参与了乳腺癌细胞的恶性生物学行为。研究^［12-14］显示：H₂S合成酶的表达影响肿瘤细胞的增殖和迁移能力。在HCT116结肠癌细胞系中敲低CBS或用氨基氧乙酸（aminooxyacetic acid，AOA）进行药物抑制，细胞增殖和H₂S合成减少，细胞迁移和侵袭能力也被抑制^［12］。CBS的药理抑制或基因沉默被证明在体外抑制肿瘤的生长和转移^［15］。在人前列腺癌PC3细胞中过表达CSE增加细胞H₂S水平，增强细胞侵袭、血管生成、淋巴管生成和肿瘤生长转移^［16］。CSE在肝癌细胞中过表达，通过磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶（extracelluar regulated kinases，ERK）1/2参与肝癌细胞增殖^［17］。作为H₂S的合成酶，CBS和CSE蛋白表达水平改变的同时，细胞内源性H₂S水平可能也发生相应变化。

EMT是肿瘤转移是关键过程，EMT是极化的上皮细胞通过多种生化改变，导致间质表型的生物学过程^［18］。E-cadherin等上皮蛋白表达水平的下调，N-cadherin和Vimentin等间充质蛋白表达水平升高，是EMT发生的标志^［19-20］。转移是导致乳腺癌高死亡率的主要原因，转移性乳腺癌主要通过EMT从肿瘤微环境中获得侵袭性^［21］。研究^［22］显示：在HepG2细胞中敲低CSE，明显降低辐射诱导的EMT相关蛋白表达水平升高。H₂S合成酶的抑制导致结肠癌细胞中ATP柠檬酸裂解酶（ATP citrate lyase， ACLY）活性被抑制，进而诱导EMT向间充质-上皮转化（mesenchymal-epithelial transition，MET）转变^［23］。因此本研究探索了H₂S合成酶对乳腺癌EMT的影响，结果显示：敲低CBS后，E-cadherin蛋白表达水平升高，N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平降低，而过表达CSE呈现的结果与之相反，表明H₂S合成酶表达水平升高可以促进乳腺癌EMT。

综上所述，CBS和CSE在乳腺癌组织中高表达，高水平的CBS和CSE可以促进乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT，进而促进乳腺癌的生长和转移。H₂S合成酶可能为乳腺癌的治疗提供新的靶点。

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基金资助

国家自然科学基金项目(82103290)

新疆维吾尔自治区人力资源和社会保障厅“天池英才”计划项目(CZ003103)

新疆生产建设兵团科技研究指导项目(2022ZD003)

新疆生产建设兵团科技计划项目(2024DA041)

石河子大学国家大学生创新创业训练计划项目(202410759083)

石河子大学青年创新拔尖人才项目(CXBJ202207)

新疆生产建设兵团重点领域科技攻关项目(2023AB0S8)