五味子乙素对胰腺癌细胞迁移和侵袭的抑制作用及其机制

Inhibitory effect of schisandrin on migration and invasion of pancreatic cancer cells and its mechanism

摘要

目的：探讨五味子乙素（SchB）对胰腺癌Pan02细胞迁移和侵袭的抑制作用，并阐明其相关作用机制。方法：胰腺癌Pan02细胞经不同浓度(0、 0.78、 1.56、 3.12、 6.25、 12.50和25.00 mg·L^-1) SchB处理24、48和72 h后，采用CCK-8法检测各组细胞存活率，确定后续实验SchB用药浓度。胰腺癌Pan02细胞分为对照组和2.5、5.0及10.0 mg·L^-1 SchB组。细胞划痕实验检测各组胰腺癌Pan02细胞划痕愈合率，Transwell小室实验检测各组胰腺癌Pan02细胞迁移和侵袭细胞数，Western blotting法检测各组胰腺癌Pan02细胞中波形蛋白（Vimentin）和N钙黏蛋白（N-cadherin）表达水平。构建胰腺癌Pan02细胞小鼠皮下移植瘤模型，成功建模的10只小鼠随机分为对照组和SchB组，每组5只；处理28 d后，测量小鼠肿瘤质量，计算瘤体积；采用免疫组织化学法检测各组小鼠肿瘤组织中Vimentin和N-cadherin蛋白表达情况。结果：CCK-8法，与对照组比较，其他浓度SchB组胰腺癌Pan02细胞存活率降低（P<0.05或P<0.01）；细胞划痕实验，与对照组比较，2.5、5.0和10.0 mg·L^-1 SchB组胰腺癌Pan02细胞划痕愈合率降低（P<0.05或P<0.01）;Transwell小室实验，与对照组比较，2.5、5.0和10.0 mg·L^-1 SchB组胰腺癌Pan02细胞迁移和侵袭细胞数减少（P<0.05或P<0.01）;Western blotting法，与对照组比较，2.5、5.0和10.0 mg·L^-1 SchB组胰腺癌Pan02细胞中Vimentin和N-cadherin蛋白表达水平降低（P<0.05或P<0.01）。与对照组比较，SchB组小鼠肿瘤体积和质量均明显降低（P<0.01）。免疫组织化学染色，与对照组比较，SchB组小鼠肿瘤组织中Vimentin和N-cadherin蛋白阳性表达率明显降低（P<0.01）。结论：SchB能够抑制胰腺癌Pan02细胞的增殖、迁移和侵袭能力，其作用机制与降低Vimentinh和N-cadherin蛋白表达有关。

关键词

五味子乙素 / 胰腺肿瘤 / 细胞迁移 / 细胞侵袭 / N钙黏蛋白 / 波形蛋白

Key words

Schisandrin B / Pancreas neoplasms / Cell migration / Cell invasion / N-cadherin / Vimentin

胰腺癌是最具侵袭性的恶性肿瘤之一，在肿瘤领域素有“癌症之王”的称号^［1］。目前，胰腺癌的治疗方式主要包括手术、化疗、介入治疗和免疫治疗等，手术切除是其中最为有效的治疗方法^［2］。但多数患者接受手术切除后会出现复发和转移。肿瘤细胞的侵袭和转移现已成为威胁患者生命的主要原因^［3］。因此，探索更多能够有效抑制胰腺癌细胞转移和侵袭的药物，可以为其治疗提供更多的选择。五味子乙素（Schisandrin B，SchB）是在中药北五味子中含量最高的联苯环辛烯类木脂素^［4］。既往研究^［5-8］表明：SchB具有抗炎和抗氧化的药理作用，同时还具有诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡等明显的抗癌活性以及心脏和肾脏保护活性。本课题组前期研究^［9］发现：SchB具有抑制胰腺癌Pan02细胞增殖的作用，其作用机制与诱导细胞凋亡有关。近年来研究^［10-12］显示：SchB对多种肿瘤表现出良好的治疗效果，并且具有抑制癌细胞侵袭和转移的作用。然而，目前国内外鲜有关于SchB抑制胰腺癌细胞迁移和侵袭的相关报道。本研究探讨SchB对胰腺癌Pan02细胞迁移和侵袭的抑制作用，并阐明其相关作用机制，为抗胰腺癌新药的研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1　细胞、实验动物、主要试剂和仪器

小鼠胰腺癌Pan02细胞（上海富衡生物科技有限公司）；10只C57BL/6小鼠（广东省医学实验动物中心），5周龄，体质量14~16 g；SchB（上海源叶生物科技有限公司），DMEM高糖培养基和1%青-链霉素（美国Gibco公司），胎牛血清（澳大利亚ExCell Bio公司），CCK-8试剂盒（美国Glpbio公司），BCA蛋白浓度测定试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），12%预制胶（南京艾思易生物科技有限公司），快速转膜液20×（广州佑佰生物制品有限公司），Super ECL Plus 超敏发光液（北京普利莱基因技术有限公司），RIPA Lysis Buffer（康为世纪生物科技有限公司），波形蛋白（Vimentin）、N钙黏蛋白（N-cadherin）、β-actin、山羊抗兔IgG耦联HRP抗体和马抗小鼠Ig耦联HRP抗体（美国Cell Signaling公司）；CO₂恒温培养箱（型号：CLM-170B-8-CN）购于新加坡ESCO公司，光学显微镜（型号：徕卡DMi1）购于德国徕卡公司，酶标仪（型号：Infinite 200pro）购于德国BMG公司，离心机（型号：Sorvall ST16R）购于美国Thermo公司，电泳系统（型号：PowerPac HC）购于美国Bio-Rad公司，水浴锅（型号：BWS-27）购于上海-恒科学仪器有限公司。

1.2　细胞培养、分组和SchB溶液配制

小鼠胰腺癌细胞系Pan02细胞在DMEM培养基（含10%胎牛血清和1%青-链霉素双抗）中培养，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中。取对数生长期Pan02细胞分为对照组和不同质量浓度（2.5、5.0和10.0 mg·L^-1）SchB 组。 SchB 溶 解 于 二 甲 基 亚 砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中，初始浓度为10 g·L^-1。

1.3　CCK-8法检测各组胰腺癌Pan02细胞存活率

取对数生长期Pan02细胞，以每孔1×10³个细胞的密度接种于96孔细胞培养板中，24 h后向各组加入0、0.78、1.56、3.12、6.25、12.50和25.00 mg·L^-1 SchB，每组设3个复孔，0 mg·L^-1 SchB组为对照组，孵育24、48和72 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续孵育1 h，酶标仪测定波长450 nm处的吸光度（A）值，计算各组细胞存活率。细胞存活率= （实验组A值-空白组A值）/（对照组A值-空白组A值）×100%。

1.4　细胞划痕实验检测各组胰腺癌Pan02细胞划痕愈合率

细胞分组见“1.2”。取对数生长期胰腺癌Pan02细胞，以每孔1×10⁵个细胞的密度接种于6孔细胞培养板中，确保第2天细胞密度达90%以上，200 μL无菌枪头竖直划痕，磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）轻轻洗除划痕细胞，加入无血清培养基继续培养，0、24和48 h时显微镜下观察拍照，测量各组不同时间段的划痕宽度，计算细胞划痕愈合率。细胞划痕愈合率=（0 h划痕宽度-24或48 h划痕宽度）/0 h划痕宽度×100%。

1.5　Transwell小室实验检测各组胰腺癌Pan02细胞中迁移和侵袭细胞数

细胞分组见“1.2”。将消化后的胰腺癌Pan02细胞无血清培养基重悬，于Transwell小室上室加入4×10⁴个悬浮于200 μL无血清培养基的细胞，在下室添加500 μL完全培养基。侵袭实验提前将小室上室铺好Matrigel基质胶，于Transwell小室上室加入4×10⁴个悬浮于200 μL无血清培养基的细胞，在下室添加500 μL完全培养基。继续培养24 h后，PBS缓冲液清洗小室，4%多聚甲醛固定细胞并用结晶紫溶液染色，棉签轻柔擦去小室上层细胞后，显微镜下观察并拍照计数。随机选取3个视野，计数各组细胞中迁移和侵袭细胞数。

1.6　Western blotting法检测各组胰腺癌Pan02细胞中Vimentin和N-cadherin蛋白表达水平

细胞分组见“1.2”。于冰上收集各组细胞，采用预冷的PBS缓冲液漂洗细胞，每组加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液100 μL，细胞刮刀收集细胞，12 000 r·min^-1离心15 min，得到含有细胞蛋白的上清液，加入1/4的5×蛋白上样缓冲液，金属浴100 ℃、10 min变性。进行SDS-PAGE电泳时，凝胶浓度为4%~12%，每孔上样量为30 μg，电泳条件为160 V、40 min；PVDF膜转膜，转膜条件为400 mA、35 min。5%脱脂奶粉封闭2 h，TBST洗膜3×5 min，分别加入N-cadherin、Vimentin 和β-actin抗体，按照说明书比例稀释，4 ℃冰箱孵育过夜；次日回收一抗，TBST洗膜3×5 min，二抗孵育2 h，ECL化学发光显色，凝胶成像系统记录目的蛋白条带。采用Image J软件分析蛋白条带灰度值，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平＝目的蛋白条带灰度值/内参β-actin蛋白条带灰度值。

1.7　小鼠皮下移植瘤模型建立

取对数生长期的胰腺癌Pan02细胞，胰蛋白酶消化后，用预冷的PBS缓冲液调节细胞密度为每毫升5×10⁶个。选取10只小鼠，每只小鼠皮下注射200 μL细胞悬液到小鼠左侧腋下区域。

1.8　小鼠皮下移植瘤分组及给药

10只小鼠随机分为对照组和SchB组，每组5只。对照组小鼠作为空白对照给予等体积溶剂，SchB组灌胃给予100 mg·kg^-1的SchB悬浊液，每天给药1次，连续给药4周，记录小鼠体质量。给药4周后，无菌条件下取出肿瘤组织，称量肿瘤质量，测量肿瘤体积，肿瘤体积计算公式为：体积（mm³）=1/2×长径（mm）×短径（mm²）。

1.9　免疫组织化学染色检测各组小鼠皮下瘤组织中Vimentin和N-cadherin蛋白表达情况

收集肿瘤标本，常规采用4%甲醛溶液固定，经脱水、浸蜡包埋、切片后，脱蜡、水化，进行免疫组织化学染色。使用柠檬酸钠缓冲液进行高温抗原修复15 min，0.5% Triton X-100 处理15 min，3% H₂O₂处理25 min，使用10%山羊血清封闭30 min，4 ℃温育一抗过夜；次日用PBS缓冲液清洗3次，室温孵育二抗1 h，PBS缓冲液清洗3次。滴加过氧化物酶溶液，室温孵育30 min，PBS缓冲液清洗3次，滴加DAB显色液，当显微镜下可见染色区域发黄即可使用蒸馏水冲洗，苏木素复染1 min。使用梯度乙醇进行脱水处理，二甲苯浸泡，最后滴加中性树胶，盖玻片封片，于光学显微镜下观察肿瘤染色强度。Vimentin和N-cadherin蛋白阳性表达率=Vimentin和N-cadherin阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.10　统计学分析

采用Graphpad Prism 9. 5.0统计软件进行统计学分析并绘制图像。不同浓度SchB作用下胰腺癌Pan02细胞增殖活性、细胞划痕愈合率、迁移细胞数和侵袭细胞数，小鼠肿瘤体积和质量，各组胰腺癌Pan02细胞中Vimentin和N-cadherin蛋白表达水平均符合正态分布，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用Dunnett’s t检验，2组间样本均数比较采用两独立样本t检验，同组指标实验前后比较采用配对样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　各组胰腺癌Pan02细胞存活率

不同浓度 （0、0.78、 1.56、 3.12、 6.25、 12.50和25.00 mg·L^-1）SchB分别作用于胰腺癌Pan02细胞24、48和72 h后，随着SchB浓度升高，各组胰腺癌Pan02细胞存活率明显降低（P<0.01）。根据以上结果，Pan02细胞分为对照组、2.5、5.0和10.0 mg·L^-1 SchB组。见表1。

2.2　各组胰腺癌Pan02细胞划痕愈合率

与对照组 （52.85%±0.75%和84.87%±0.60%） 比较， 2.5、5.0和10.0 mg·L^-1 SchB组胰腺癌Pan02细胞24 h划痕愈合率（41.13%±0.54%、36.84%± 0.44%和23.48%±1.04%）和48 h划痕愈合率（72.78%±1.36%、58.55%±1.96%和51.45%± 2.57%）降低（P<0.05或P<0.01）。见图1。

2.3　各组胰腺癌Pan02细胞中迁移和侵袭细胞数

与对照组（201.00个±8.60个和189.67个± 14.38个）比较，2.5、5.0和10.0 mg·L^-1 SchB组胰腺癌Pan02细胞中迁移细胞数（156.00个± 11.43个、104.00个±9.42个和22.67个±5.56个）及侵袭细胞数（83.00个±5.10个、25.33个± 4.11个和6.67个±1.25个）减少（P<0.05或P<0.01）。见图2。

2.4　各组胰腺癌Pan02细胞中Vimentin和N-cadherin蛋白表达水平

与对照组比较，2.5、5.0和10.0 mg·L^-1 SchB组胰腺癌Pan02细胞中Vimentin及N-cadherin蛋白表达水平均明显降低（P<0.05或P<0.01）。见图3。

2.5　2组小鼠移植瘤的体积和质量

与对照组比较，SchB组小鼠肿瘤体积和质量均明显降低（P<0.01）。见图4和表2。但2组小鼠体质量无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

2.6　2组小鼠移植瘤组织中Vimentin和N-cadherin蛋白阳性表达率

与对照组（51.25%± 2.35%和76.35%±3.06%）比较，SchB组小鼠肿瘤组织中Vimentin和N-cadherin蛋白阳性表达率（18.52%±5.55%和27.58%±4.98%）明显降低（P<0.01）。见图5。

3 讨 论

胰腺癌是一种致命的恶性肿瘤，在疾病发展到晚期之前几乎没有症状^［13］，以至于多数胰腺癌患者在初次确诊时已发生远处转移^［14］，其5年生存率约为10%^［15］。肿瘤转移使得手术和化疗等治疗策略效果差，是造成胰腺癌患者死亡的主要因素^［16］。因此，迫切需要开发新的有效药物作为辅助治疗药物用于预防胰腺癌转移。

本实验采用CCK-8法检测SchB对胰腺癌Pan02细胞活性的影响。结果显示：不同质量浓度的SchB作用于Pan02细胞24、48和72 h后，SchB能够显著抑制胰腺癌Pan02细胞活性，并具有浓度时间依赖性。Transwell小室实验检测结果显示：与对照组比较，随着SchB浓度的升高，胰腺癌Pan02细胞的迁移细胞数和侵袭细胞数均明显减少，表明SchB能够降低胰腺癌Pan02细胞的迁移和侵袭能力。

N-cadherin蛋白的异常表达与肿瘤侵袭和转移存在密切关联，是上皮-间充质转化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）中的间充质标志物^［17］。N-cadherin蛋白的表达促进了肿瘤细胞的原位脱落，克服了E-cadherin对肿瘤的抑制作用^［18］。研究表明：N-cadherin蛋白表达增加使体外多种癌症上皮细胞类型的迁移和侵袭能力增强^［19］。同时，N-cadherin蛋白通过包裹内皮细胞和壁细胞稳定微血管，从而促进血管生成并维持血管的完整^［20］。在致癌K-ras（G12D）模型中，N-cadherin蛋白的缺失导致胰腺上皮内瘤变和肿瘤发生率升高，表明其可以作为生长抑制剂发挥作用^［21］。Vimentin是EMT过程中过表达的典型标志物，通过与细胞表面受体相互作用来促进癌细胞迁移和侵袭^［22］。Vimentin在各种上皮癌中，包括前列腺癌、胃肠道肿瘤、中枢神经系统肿瘤、乳腺癌、肺癌和其他类型的癌症中的表达水平均升高^［23］。Vimentin蛋白在肿瘤中过表达与肿瘤生长、侵袭和预后不良存在密切相关^［24］。因此，Vimentin和N-cadherin蛋白是抑制胰腺癌侵袭和转移的关键靶点。

综上所述，本研究结果显示：SchB可以显著降低胰腺癌细胞以及皮下瘤组织中Vimentin和N-cadherin蛋白的表达。SchB能够抑制胰腺癌增殖、迁移和侵袭能力，作用机制与降低Vimentin和N-cadherin蛋白的表达有关。

参考文献

[1] PARK W， CHAWLA A， O’REILLY E M. Pancreatic cancer： a review［J］. JAMA， 2021， 326（9）： 851-862.

[2] STOFFEL E M， BRAND R E， GOGGINS M. Pancreatic cancer： changing epidemiology and new approaches to risk assessment， early detection， and prevention［J］. Gastroenterology， 2023， 164（5）： 752-765.

[3] SCHIZAS D， CHARALAMPAKIS N， KOLE C， et al. Immunotherapy for pancreatic cancer： a 2020 update［J］. Cancer Treat Rev， 2020， 86： 102016.

[4] 马骏池， 赵晋彤， 高世勇， 五味子乙素提纯工艺及药理作用研究进展［J］. 中国现代中药， 2022， 24（3）： 533-541.

[5] LUO W， LIN K， HUA J Y， et al. Schisandrin B attenuates diabetic cardiomyopathy by targeting MyD88 and inhibiting MyD88-dependent inflammation［J］. Adv Sci， 2022， 9（31）： e2202590.

[6] ZHANG Q， LIU J， DUAN H， et al. Activation of Nrf2/HO-1 signaling： an important molecular mechanism of herbal medicine in the treatment of atherosclerosis via the protection of vascular endothelial cells from oxidative stress［J］. J Adv Res， 2021， 34： 43-63.

[7] LI Z M， ZHAO L J， XIA Y S， et al. Schisandrin B attenuates hepatic stellate cell activation and promotes apoptosis to protect against liver fibrosis［J］. Molecules， 2021， 26（22）： 6882.

[8] XU C H， DENG Y， MAN J W， et al. Unveiling the renoprotective mechanisms of schisandrin B in ischemia-reperfusion injury through transcriptomic and pharmacological analysis［J］. Drug Des Devel Ther， 2024， 18： 4241-4256.

[9] 傅家财， 秦玲莎， 杨露， 五味子乙素对胰腺癌Pan02细胞增殖的抑制作用及其机制［J］. 吉林大学学报（医学版）， 2024， 50（3）： 638-646.

[10] 向玲宝， 朱奕， 左玲， 五味子乙素通过Wnt/β-catenin信号通路抑制膀胱癌增殖、迁移和侵袭［J］.海南医学院学报， 2023， 29（8）： 568-574， 580.

[11] 王吉维， 郝文伟， 李盛涛， 五味子乙素通过Wnt/β-catenin信号通路调节人胰腺癌细胞增殖、凋亡和侵袭［J］. 解剖科学进展， 2021， 27（1）： 58-60.

[12] 吴赛男. 五味子乙素对人宫颈癌Siha细胞增殖和迁移的影响及机制研究［D］. 吉林： 北华大学， 2021.

[13] ACHARI A， CHATTERJEE S， DEY S， et al. Catecholase-catalyzed synthesis of wedelolactone， a natural coumestan and its analogs［J］. Org Biomol Chem， 2022， 21（1）： 89-92.

[14] RODRÍGUEZ GIL Y， JIMÉNEZ SÁNCHEZ P， MUÑOZ VELASCO R， et al. Molecular alterations in pancreatic cancer： transfer to the clinic［J］. Int J Mol Sci， 2021， 22（4）： 2077.

[15] KLEIN A P. Pancreatic cancer epidemiology： understanding the role of lifestyle and inherited risk factors［J］. Nat Rev Gastroenterol Hepatol， 2021， 18（7）： 493-502.

[16] 徐彪铭， 左朝晖. 外泌体作为药物载体在胰腺癌化学治疗中的作用［J］. 中南大学学报（医学版）， 2023， 48（2）：268-274.

[17] SKARKOVA V， VITOVCOVA B， MATOUSKOVA P， et al. Role of N-cadherin in epithelial-to-mesenchymal transition and chemosensitivity of colon carcinoma cells［J］. Cancers， 2022， 14（20）： 5146.

[18] LOH C Y， CHAI J Y， TANG T F， et al. The E-cadherin and N-cadherin switch in epithelial-to-mesenchymal transition： signaling， therapeutic implications， and challenges［J］. Cells， 2019， 8（10）： 1118.

[19] CAO Z Q， WANG Z， LENG P. Aberrant N-cadherin expression in cancer［J］. Biomed Pharmacother， 2019， 118： 109320.

[20] BLASCHUK O W. N-cadherin antagonists as oncology therapeutics［J］. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci， 2015， 370（1661）： 20140039.

[21] SU Y， LI J， SHI C， et al. N-cadherin functions as a growth suppressor in a model of K-ras-induced PanIN［J］. Oncogene， 2016， 35（25）： 3335-3341.

[22] ZHANG H， WU X S， XIAO Y Z， et al. Coexpression of FOXK1 and vimentin promotes EMT， migration， and invasion in gastric cancer cells［J］. J Mol Med， 2019， 97（2）： 163-176.

[23] SATELLI A， LI S L. Vimentin in cancer and its potential as a molecular target for cancer therapy［J］. Cell Mol Life Sci， 2011， 68（18）： 3033-3046.

[24] PARVANIAN S， COELHO-RATO L S， PATTESON A E， et al. Vimentin takes a hike-Emerging roles of extracellular vimentin in cancer and wound healing［J］. Curr Opin Cell Biol， 2023， 85： 102246.

基金资助

国家自然科学基金项目(82203351)

广东省中医药局科研项目(20231412)

广东省卫健委医学科学技术研究基金项目(A2022163)