小鼠SGK1基因真核表达载体的构建及鉴定

Construction and identification of eukaryotic expression vector of mouse SGK1 gene

摘要

目的：构建含有小鼠血清和糖皮质激素诱导激酶（SGK） 1基因的真核表达载体pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry，并观察载体在转染HEK293细胞后的表达情况。方法：PCR法扩增SGK1目的基因片段，并与经过HindⅢ和SbfⅠ双酶切的pcDNA3.1-MYC-C-mcherry载体连接。酶切和测序验证成功后，采用脂质体转染法将pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry转染至HEK293细胞中，Western blotting法测定HEK293细胞中真核表达载体的表达情况。结果：酶切载体条带位于5 200 bp，目的基因条带位于3 100 bp，与预期结果相符。Snap Gene软件比对，pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry的测序结果与预期序列一致，表明真核表达载体pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry构建成功。Western blotting法观察到转染后的HEK293细胞在相对分子质量49 000附近显现出明显的条带，真核表达载体pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry成功表达。结论：成功构建真核表达载体pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry，为后续研究SGK1基因对小鼠受精卵细胞早期发育的作用机制奠定了基础。

关键词

血清和糖皮质激素诱导激酶1 / 真核表达载体 / HEK293细胞 / 载体构建 / 质粒

Key words

Serum and glucocorticoid-induced kinase 1 / Eukaryotic expression vector / HEK293 cells / Vector construction / Plasmids

血清和糖皮质激素诱导激酶（serum and glucocorticoid-induced kinase，SGK）1作为血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶家族的重要成员之一，具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性^［1］。最初，SGK1作为糖皮质激素应答基因由乳腺肿瘤细胞中克隆出来^［2］，人类SGK1基因定位于6q23染色体^［3］。SGK1几乎分布于哺乳动物的所有组织中，尽管在多数组织中的表达水平普遍较低，但其对外界刺激较为敏感^［4-5］。当细胞受到血清或糖皮质激素的刺激时，SGK1基因的表达可以在30 min内迅速提高5~10倍^［6］。在哺乳动物体内，SGK1通过磷酸肌醇3激酶和3-磷酸肌醇依赖性激酶被胰岛素及生长因子激活^［7］。SGK有3种不同但高度同源的异构体，即SGK1、SGK2和SGK3，分别由位于不同染色体上的3个不同基因产生^［8］。SGK由3个结构域组成，分别是N端可变区、催化区和C端尾部，并且SGK1的调控严格受时间和空间限制^［9］。在许多正常细胞和转化细胞中，SGK1的表达、酶活性、蛋白稳定性和亚细胞定位均受严格的刺激依赖调节^［6］。SGK1可参与调节运输、神经兴奋性、激素释放及凝血^［10］。同时，SGK1对高血压^［11］、糖尿病^［12］、炎症^［13］和自身免疫性疾病^［14］等多种疾病的发生发展有一定的影响。SGK1是激素调节离子通道的关键酶^［4］，同时还与细胞分化、细胞周期调控和有丝分裂稳定性有关^［15］。本实验通过构建SGK1基因真核表达载体，为进一步研究SGK1基因在小鼠受精卵细胞早期发育中的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1　细胞、主要试剂和仪器

HEK293细胞购自北京全式金生物技术有限公司，目的基因由本课题组合成；SbfⅠ、XbaⅠ和HindⅢ等限制性内切酶购于美国Thermo Scientific公司，载体pcDNA3.1-MYC-C购自广州辉骏生物科技有限公司，SGK1抗体购于武汉proteintech公司，Prime STAR Max Premax（2×）和TaKaRa Taq由日本TaKaRa公司提供，质粒小提试剂盒购于广州亿涛生物科技公司，ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit连接酶购于南京诺唯赞公司，SDS-PAGE凝胶速配试剂盒及预染蛋白Marker购于北京索莱宝公司，SDS-PAGE上样缓冲液购于南京Bio-Channel公司，微量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购于生工生物工程（上海）股份有限公司，磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）购于上海碧云天生物技术公司，ECL化学发光试剂盒购于美国Piece Biotechnology 公 司，β-actin 抗 体 购 于 上 海SantaCruzbio 公 司，脱脂奶粉购于飞净公司，Lipofectamine^TM 2000试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司。超净工作台（中国苏净安泰公司），低温离心机（型号：Heraeus Fresco 17）和紫外分光光度计（型号：Nanodrop 2000c）均购自德国Thermo Scientific公司，CO₂恒温培养箱（型号：Binder C150）购自德国BINDER公司，多功能摇床（型号：SI1201）购自美国ENVIRO-GENIE公司，垂直电泳槽（型号：Mini Trans-Blotting）和凝胶自动成像仪（型号：Gel DOC XR+）均购自美国Bio-Rad公司，基因扩增仪（型号：Hema 9600）购自中国HEMA公司，纯水机（型号：TTCHZ）购自中国天创公司。

1.2　引物设计

结合实验要求，利用Snap Gene软件设计SGK1引物：上游引物，5'-TCAGAAGAG-GATCTGGCAAGCTTGATGAAACAGAGAAG-GATGGG-3'；下游引物，5'-CTCGCCCTTGCTC-ACCATGAGGAAGGAATCCACAGG-3'，用于后续目的基因扩增。

1.3　扩增目的基因及目的片段的回收

①扩增目的基因片段。将构建好的含目的基因的真核表达质粒作为模板，应用Prime STAR高保真酶进行PCR反应，扩增SGK1基因目的片段，反应体系共50 μL：质粒模板0.5 μL，SGK1上游引物2 μL，SGK1下游引物2 μL，Prime STAR Buffer 10 μL，Prime STAR Max Premix（2×）0.5 μL，dNTP Mixture 4 μL，ddH₂O 31 μL。扩增条件：96 ℃预变性4 min，96 ℃变性10 s，55 ℃复性退火15 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环，72 ℃延伸5 min，于16 ℃保存。待目的基因片段扩增完成，行1%琼脂糖凝胶电泳，并加入10 μL Marker对照，以此验证扩增是否达到预期效果。②回收目的基因片段。紫外光下，使用已高压灭菌的手术刀切取目标DNA条带置于干净EP管中；将Buffer G按3倍胶体积加入至胶块中，50 ℃水浴加热10 min至完全融化；之后再添加1倍胶体积的异丙醇，上下颠倒；将上述融化的液体移至微量DNA吸附柱中，静置2 min后12 000 r·min^-1离心1 min，弃去管中滤液；吸附柱中添加500 μL Buffer G溶液，室温12 000 r·min^-1离心1 min，弃去滤液；将已混入无水乙醇的650 μL Buffer W溶液加入离心管，12 000 r·min^-1 离心1 min，弃去滤液；空载吸附柱12 000 r·min^-1 离心2 min，去除残液，放于洁净1.5 mL无酶离心管中，向吸附膜中心加入10 μL Buffer B溶液，常温放置1~2 min使反应完全进行；最后，混合物12 000 r·min^-1离心1 min，进行洗脱纯化，获得的目的基因片段用于后续实验。

1.4　载体双酶切及酶切产物回收

①载体双酶切割。准备1支0.2 mL无酶EP管，加入5 μg pcDNA3.1-MYC-C-mcherry载体，采用Hind Ⅲ和Sbf Ⅰ酶对其进行切割。酶切体系：3 μL 10×Buffer溶液，Sbf Ⅰ和Hind Ⅲ酶各1.5 μL及5 μg pcDNA3.1-MYC-C-mcherry载体。将上述组分充分混合，加入无酶水调整总体积至30 μL，37 ℃酶 切60 min。反 应 结 束 后，取 30 μL 产 物 进 行1%琼脂糖凝胶电泳分析，以验证双酶切效果。②酶切产物的回收。紫外光下，高压灭菌手术刀裁切琼脂糖凝胶上的目标线性化载体条带，并将其移至1.5 mL无菌EP管中，参照微量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书回收载体片段。

1.5　目的片段与载体连接

取0.2 mL的ClonExpressⅡ One Step Cloning Kit连接酶置入干净EP管中，使酶切后回收的基因片段与载体DNA连接。构建的连接体系：100 ng酶切载体、100 ng PCR回收目的基因、1 μL的ClonExpressⅡ One Step Cloning Kit连接酶和2 μL的5×CEⅡ缓冲液，无酶水调整总体积至10 μL。37 ℃下孵育连接30 min，冰浴5 min，即可获得连接产物。

1.6　连接产物转化感受态细胞

在1.5 mL的无酶EP管中加入100 μL冰浴解冻的大肠杆菌DH5a感受态细胞和10 μL连接产物（在冰浴中完成），颠倒混合离心管，冰浴30 min；EP管于42 ℃下水浴60 s后迅速转移至冰水混合物中，继续冰浴3~5 min；吸取300 μL LB培养基至EP管中，并用移液枪吹打混匀，放入200 r·min^-1、37 ℃的培养箱中振荡培养1 h；接着，在含有100 mg·L^-1氨苄西林（Ampicillin）抗生素的LB平板上将菌液均匀涂抹（该步骤在超净工作台完成）；室温放置使培养基充分固化，将平板倒置放入37 ℃的恒温培养箱中，过夜培养。

1.7　菌落PCR鉴定阳性转化子

于洁净EP管配制菌检PCR混合液，菌检PCR体系：上下游引物各0.2 μL，TaKaRa Taq Max 5 μL，添加无酶水定容至10 μL。制备好的混合液均匀分配至无菌八联排管中。超净工作台上，筛选出8个独立菌落并进行合适的标记。经高压灭菌移液枪头轻触培养基菌落一侧后，移至八联排管中，轻摇使菌落撒入液体，弃枪头。然后进行PCR扩增，反应条件：94 ℃预加热5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共25个循环；72 ℃延伸3 min，于16 ℃保存。扩增完毕后，向PCR管中注入2 μL 10倍稀释的Loading缓冲液，吸取10 μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，同时加入10 μL的DNA Marker比较及鉴定，筛选出正确的菌落进行后续的摇菌及测序工作。

1.8　质粒提取

实验开始前先检查缓冲液Buffer P中是否添加RNase A，洗涤缓冲液Buffer PW中是否掺杂无水乙醇。收集菌体，取2支无酶EP管分别添加1.5 mL过夜培养菌液，室温12 000 r·min^-1离心1 min，弃去培养基；每管沉淀物添加250 μL缓冲液Ⅰ，移液枪吹散沉淀，使细菌沉淀重悬；试管中添加250 μL缓冲液Ⅱ，紧闭管盖，混合8~10次，室温静置3 min，彻底分解菌体；管中加入350 μL缓冲液Ⅲ，颠倒8~10次，12 000 r·min^-1离心10 min富集沉淀；移液枪将上清液转移至吸附柱，相同转速再离心1 min，使质粒紧密结合在吸附膜上；在混合液中添加500 μL缓冲液EF，12 000 r·min^-1离心1 min，弃去滤液；接着，向同一EP管中加入500 μL Buffer PW溶液，12 000 r·min^-1离心1 min，弃掉上清液，此步骤重复1次；空吸附柱12 000 r·min^-1离心1 min后，打开管盖，使残留乙醇缓慢挥发；之后，将吸附柱置于一无菌EP管中，吸取30 μL TE缓冲液试剂，垂直滴入吸附膜中央，确保液体在室温静置2 min充分作用，12 000 r·min^-1离心2 min，管底沉淀物即获得的质粒DNA，用于后续实验。

1.9　酶切鉴定及质粒测序验证

酶切鉴定体系：1 μL 的 质 粒，1 μL 10 × Buffer，0.5 μL XbaⅠ，0.5 μL Hind Ⅲ，7 μL无酶水，37 ℃切割60 min。取10 μL酶切质粒样品和10 μL DNA Marker，经1%琼脂糖凝胶电泳检测。将酶切获得的目的片段送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序验证，从而进一步验证pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry真核表达载体是否构建成功。

1.10　细胞培养与转染

将HEK293细胞置于含有10%胎牛血清、100 g·L^-1链霉素及100 U·mL^-1青霉素的培养基中培养，并于37 ℃、5% CO₂条件的培养箱中培养（按时更换培养液）；定期观察细胞的生长情况，收集处于对数生长期的细胞；待所收集的细胞密度达到80%时，依据Lipofectamine^TM 2000试剂盒说明书的要求转染HEK293细胞；培养24 h，转染5 μg pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry DNA。

1.11　Western blotting法检测HEK293细胞中pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry的表达

真核表达载体pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry转染至HEK293细胞48 h后，离心收集目的细胞，离心并用PBS缓冲液清洗3次，去除残留培养液；加入细胞裂解液提取蛋白，使用BCA定量试剂盒测定其浓度；蛋白质变性冷却至室温，使用12%的分离胶进行SDS-PAGE电泳分离，采用恒压恒流方式将分离后的蛋白质转移至PVDF膜上，50 g·L^-1脱脂牛奶室温密封1 h；加入一抗稀释液，4 ℃孵育过夜，特异性结合目标蛋白；取出NC膜，使用TBST溶液进行3次每次10 min的洗涤；使用辣根过氧化物酶标记二抗，室温下振摇孵育2 h，NC膜用TBST溶液漂洗3次，每次10 min，去除多余二抗；采用化学发光技术使膜显影，检测细胞中的蛋白表达情况。未转染组和空载体pcDNA3.1-MYC-C转染组参照载体pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry转染组的操作步骤，anti-β-actin抗体作为内参和anti-MYC标签抗体行蛋白电泳检测。采用Image J软件分析蛋白条带灰度值，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。

2 结 果

2.1　酶切鉴定pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry真核表达载体构建成功

通过以上实验步骤所构建的真核表达载体pc-DNA3.1-MYC-SGK1-mcherry，使用XbaⅠ和HindⅢ限制性内切酶对其进行双酶切鉴定，然后行1%琼脂糖凝胶电泳处理，载体条带位于5 200 bp，目的基因条带位于3 100 bp，与预期结果完全吻合，表明pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry真核表达载体构建成功。见图1。

2.2　pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry的测序结果

连接目的基因片段与载体，使用Snap Gene软件对测序结果进行比对，pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry测序结果与预期序列完全匹配。见图2。进一步证实pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry真核表达载体构建成功。

2.3　HEK293细胞中pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry真核表达载体的表达水平

采用脂质体转染法将构建的pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry真核表达载体转染至HEK293细胞中，采用Western blotting法检测anti-β-actin抗体和anti-MYC标签抗体进行，未转染组和空载体转染组均未检测到条带，转染了真核表达载体pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry 的 HEK293 细 胞 在 相 对 分 子 质 量 为49 000处可见一条清晰条带，结果表明载体构建成功且能正确表达。见图3。

3 讨 论

SGK1是多种信号转导通路和细胞磷酸化级联反应的纽带^［16］，在各种纤维化疾病（肺纤维化、糖尿病肾纤维化和克罗恩病）中，SGK1存在过度表达^［5］。本课题组^［17］前期通过显微注射SGK1-mRNA在小鼠1-细胞期受精卵中过表达SGK1，促使受精卵提前完成G₂/M期转变，缩短受精卵卵裂时间；并使用不同浓度的SGK1抗体作用于体外培养的小鼠1-细胞期受精卵，延迟受精卵开始卵裂的时间，使受精卵发育停滞于G₂/M期，抑制受精卵的早期发育；同时也发现SGK1的激活时间较细胞周期蛋白依赖性激酶1（cyclin dependent kinase 1，CDK1）的激活时间早，通过CDK1对小鼠1-细胞期受精卵的发育进行调控。上述实验结果表明SGK1在受精卵的早期发育进程中发挥重要作用，但SGK1参与调控G₂/M期转换的具体机制尚未完全阐明，有待进一步研究探讨。

本研究通过设计引物并合成SGK1基因序列，构建pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry真核表达载体，并对重组载体进行酶切鉴定及测序。电泳结果显示载体条带位于5 200 bp，目的基因条带位于3 100 bp，与预期结果相符，并且测序结果也与预期序列一致，表明载体成功插入目的基因。为了检测构建的载体能否在细胞中成功表达，采用脂质体转染技术将含有SGK1基因的表达载体转入HEK293细胞中；Western blotting法检测结果显示：在相对分子质量约49 000附近出现一条电泳条带，证实在转染HEK293细胞中SGK1基因可以成功表达。研究^［18］显示：抑制SGK1过表达能够提高神经胶质对谷氨酸所致毒性的清除效率，阻止神经胶质细胞衰老和线粒体损伤，是帕金森病和阿尔茨海默病的关键治疗靶点^［19］。SGK1已被确定为肿瘤促进基因，在多种恶性肿瘤（胃癌^［20］、肺癌^［21］、乳腺癌^［22］、胶质母细胞瘤^［23］、结直肠癌^［24］和前列腺癌^［25］等）中均观察到SGK1的失调。

综上所述，采用PCR和双酶切等方法可以成功构建pcDNA3.1-MYC-SGK1-mcherry真核表达载体，本研究结果为后续细胞实验奠定了基础。同时构建该表达载体对肿瘤和退行性疾病的干预治疗具有重要意义。

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基金资助

国家自然科学基金项目(81360109)

内蒙古自治区科技厅自然科学基金项目(2021MS08158)