Yes相关蛋白对人宫颈癌SiHa细胞生物学行为的影响

Effect of Yes-associated proteins on biological behaviors of human cervical cancer SiHa cells

摘要

目的：探讨Yes相关蛋白（YAP）沉默对人宫颈癌（CC） SiHa细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法：对人CC细胞株SiHa细胞进行体外培养，慢病毒YAPshRNA转染到SiHa细胞，建立稳定转染的YAP-shRNA实验组（sh-YAP组）和空载质粒对照组（对照组），采用Western blotting法检测YAP沉默效果；免疫荧光法检测2组细胞中肌动蛋白（F-actin）微丝数量及形态变化；CCK-8法、Transwell小室实验和细胞划痕实验检测2组细胞存活率、迁移及侵袭细胞数以及细胞划痕愈合率；Western blotting法检测2组细胞中上皮-间质转化（EMT）相关标记物[E钙黏蛋白（E-cadherin）和锌指转录因子（Snail）]、DNA损伤修复相关蛋白γ (γ-H2AX)和凋亡相关蛋白[c-MYC和B细胞淋巴瘤2 (Bcl-2)]蛋白表达水平。结果：慢病毒YAPshRNA转染SiHa细胞后，SiHa细胞中YAP蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。免疫荧光实验，YAP沉默后SiHa细胞中F-actin微丝稀疏且排列规则，细胞数量减少、细胞呈现蜷缩的状态。CCK-8法，与对照组比较，sh-YAP组培养24和48 h后SiHa细胞存活率明显降低（P<0.01）;Transwell小室实验和细胞划痕实验，与对照组比较，sh-YAP组的SiHa细胞迁移和侵袭细胞数明显减少（P<0.01），细胞划痕愈合率明显降低（P<0.05）;Western blotting法，与对照组比较，sh-YAP组细胞中E-cadherin蛋白表达水平升高（P<0.05）,c-MYC、Bcl-2和γ-H2AX蛋白表达水平降低（P<0.05或P<0.01）。结论：YAP基因沉默导致人CC SiHa细胞F-actin的解聚，并调控细胞凋亡和DNA损伤修复，可能会逆转EMT进程，从而抑制肿瘤细胞增殖和迁移。

关键词

宫颈肿瘤 / Yes相关蛋白 / 细胞增殖 / 细胞迁移

Key words

Cervical neoplasm / Yes-associated protein / Cell proliferation / Cell migration

宫颈癌（cervical carcinoma，CC）是女性恶性肿瘤的第四大疾病，2020年全球约新增60.4万例CC病例，死亡34.2万例^［1］。CC病例基本上均可归因于高危型人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染^［2］。而HPV感染与Yes相关蛋白（Yes-associated protein，YAP）表达存在密切关联^［3］。YAP作为 Hippo 通路的核心分子，可直接或间接调控与癌症的侵袭和迁移有关的靶基因的表达，促进肿瘤的侵袭和转移^［4］。在许多类型的肿瘤中，Hippo通路常发生失调，并与恶性肿瘤细胞的恶性增殖和迁移存在关联^［5］。肿瘤转移和侵袭常发生于肿瘤发展的中后期。CC的标准化治疗包括手术治疗、放射治疗和化学疗法，放射治疗是晚期疾病的主要治疗方法，然而，由于放射敏感性，多数肿瘤晚期患者都有不良结局^［6-7］。在细胞水平上，YAP在宫颈鳞状细胞癌中的作用机制以及YAP与DNA损伤修复相关蛋白泛素化组蛋白（histone H2A family member X，H2AX）磷酸化之间的相关作用尚无相关研究报道。本研究通过体外功能实验探讨YAP在人CC SiHa细胞生长中的作用，以及YAP对DNA损伤修复、凋亡和上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）等作用的影响，为更深入地研究肿瘤迁移和侵袭机制以及为CC的预后和靶向治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1　细胞、主要试剂和仪器

HPV16阳性的SiHa人CC细胞，购自美国ATCC公司。DMEM培养液和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国Gibco生物公司，鼠抗人E钙黏蛋白（E-cadherin）、兔抗人锌指转录因子（Snail）、β肌动蛋白（β-actin）、c-MYC和B细胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）单克隆抗体均购自美国CST公司，兔抗γ-H2AX单克隆抗体购自江苏Affinity Biosciences公司，兔抗人YAP抗体单克隆抗体购自美国Abcam公司，Transwell小室购自美国Corning公司，罗丹明标记鬼笔环肽免疫荧光购自武汉ABclonal生物科技有限公司。CO₂恒温培养箱（型号：3111，美国Thermo公司），双近红外荧光分子成像系统（型号：Odyssey CLX，美国LI-COR公司），ECHO荧光显微镜（型号：RVL-00-M，美国ECHO公司）。

1.2　细胞培养、转染及分组

人CC细胞系SiHa细胞，采用DMEM培养基（含10%FBS），在37 ℃、5%CO₂培养箱中培养，每天观察，2~3 d更换1次培养液，待细胞融合度达到70%~80%时用胰蛋白酶消化传代，取生长状态良好的对数生长期细胞用于实验。YAP慢病毒RNA干扰序列由北京合生生物科技有限公司设计合成，YAP-shRNA重组载体序列：5'-GCCACCAAGCTAGATAAAGAA-3'；shRNA-NC空载体序列：5'-AAACGTGACACG- TTCGGAGAA-3'。选用慢病毒转染方法：转染前1 d按每孔1×10⁴个细胞将SiHa细胞接种于96孔细胞培养板，放置于37 ℃、5% CO₂培养箱中，第2天按照最佳病毒感染复数（multiple of infection，MOI）=30进行转染，24 h后更换新鲜的培养基，继续培养。实验分为对照组和YAP沉默组（sh-YAP组）。

1.3　免疫荧光法检测2组细胞中肌动蛋白（F-actin）聚合情况

采用罗丹明标记鬼笔环肽染色说明书进行荧光染色。收集对数生长期的细胞，经消化、离心和重悬后，接种于铺盖玻片的6孔细胞培养板中，每孔加入2 mL培养基，在培养箱中培养。48 h后取出6孔细胞培养板加入磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）漂洗3次，甲醇固定15 min，PBS缓冲液漂洗3次，0.5%Triton X-100通透细胞，室温静置20 min，PBS缓冲液漂洗3次后滴加罗丹明标记的鬼笔环肽免疫荧光2 h后，二眯基-2-苯基吲哚（4´，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色液核染色，封固剂封片，在荧光显微镜下观察并拍照。

1.4　CCK-8法检测2组细胞存活率

取对数生长期的细胞，接种于6孔细胞培养板内，调整细胞水平至每微升50个细胞，以每孔100 μL接种于96孔细胞培养板中，每孔加入CCK-8 10 μL，置于37 ℃、5% CO₂孵育箱内继续孵育，分别在0、24和48 h后于波长450 nm处测定每孔吸光度（A）值，并绘制增殖曲线。细胞存活率=sh-YAP组A值/对照组A值×100%。

1.5　细胞划痕实验检测2组细胞划痕愈合率

收集生长状态良好且处于对数生长期的细胞，分别进行消化、离心和重悬后，将细胞密度调整为每孔约7×10⁵个细胞，接种于6孔细胞培养板内，置于培养箱孵育。次日用枪头沿直尺划痕，用200 μL的移液器吸头垂直于孔板均匀划痕，注意使划痕等宽，去除划下的细胞，并给予药物治疗。置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养，分别在给药0和48 h应用显微镜拍照，分析划痕修复程度，计算细胞划痕愈合率。细胞划痕愈合率=（0 h划痕面积- 48 h划痕面积）/0 h划痕面积×100%。

1.6　Transwell小室实验检测2组细胞迁移和侵袭细胞数

将SiHa细胞以每孔8×10³个细胞密度接种于Transwell小室（8.0 μm），在37 ℃、5% CO₂培养箱中培养48 h，取出小室吸除培养基，棉签擦去上室面未穿膜的细胞，甲醛固定，结晶紫染色，显微镜下随机选取5个视野，采用Image J软件计数，取平均值，实验重复3次。细胞侵袭实验首先将Matrigel胶4 ℃过夜融化，次日与无血清DMEM培养基以1∶10比例稀释，每孔60 μL包被小室膜上，置于37 ℃恒温箱中30 min，干燥后待用。显微镜下观察并选取5个高倍视野进行拍照，采用Image J软件计数各组迁移和侵袭细胞数，GraphPad Prism 8.0进行统计分析和统计图绘制。

1.7　Western blotting法检测2组细胞中E-cadherin、Snail、YAP、c-MYC、Bcl-2和γ-H2AX蛋白表达水平

PBS缓冲液洗涤细胞，加入含有PMSF的RIPA细胞裂解液，用刮勺研磨，冰上孵育30 min，4 ℃、13 000 r·mim^-1 离心10 min，取上清液，即为细胞总蛋白。应用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，取30 μg细胞总蛋白变性用于蛋白印迹上样，通过SDS-PAGE电泳分离蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，一抗孵育过夜，二抗孵育2 h，ECL显影曝光。采用Image J软件分析目的蛋白条带灰度值，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参β-actin蛋白条带灰度值。

1.8　统计学分析

采用 SPSS 22.0和GraphPad Prism 7.0统计软件进行统计学分析及绘图。各组细胞存活率、细胞划痕愈合率、迁移和侵袭细胞数以及细胞中EMT相关蛋白、YAP、c-MYC、Bcl-2和γ-H2AX蛋白表达水平均符合正态分布，以x±s表示，2组间样本均数比较采用两独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　2组SiHa细胞中YAP蛋白表达水平

与对照组比较，sh-YAP组SiHa细胞中YAP蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。见图1。

2.2　2组SiHa细胞中F-actin聚合情况

转染沉默YAP基因的慢病毒载体，用罗丹明标记的鬼笔环肽免疫荧光染色，显示SiHa细胞中微丝的形态及分布，便于观察F-actin的聚合和解聚情况。结果显示：对照组中SiHa细胞微丝丰富且排列紊乱，sh-YAP组中微丝稀疏且排列规则，细胞数量减少，细胞呈现蜷缩的状态。见图2。

2.3　2组SiHa细胞存活率

与对照组比较，sh-YAP组培养24 h后SiHa细胞存活率明显降低（P<0.01），而培养48 h后SiHa细胞存活率降低更加明显（P<0.01）。见图3。

2.4　2组SiHa细胞划痕愈合率和迁移及侵袭细胞数

与对照组比较，sh-YAP组SiHa细胞划痕愈合率明 显 降 低（P<0.05）。见图4。与 对 照 组 比 较，sh-YAP组SiHa细胞迁移和侵袭细胞数均明显减少（P<0.01）。见图5。

2.5　2组SiHa细胞中E-cadherin和Snail蛋白表达水平

与对照组比较，sh-YAP组SiHa细胞中Snail蛋白表达水平降低，但差异无统计学意义（P>0.05），E-cadherin蛋白表达水平升高（P<0.01）。见图6。

2.6　2组SiHa细胞中Bcl-2、c-MYC和γ-H2AX蛋白表达水平

与对照组比较，sh-YAP组SiHa细胞中Bcl-2、c-MYC和γ-H2AX蛋白表达水平降低（P<0.05或P<0.01）。见图7。

3 讨 论

目前，CC细胞凋亡、增殖和存活的发病机制及分子机制尚未完全阐明^［8］。

Hippo信号通路最初被发现作为器官大小控制的主要调节因子，但近年来研究其与CC发展存在密切关联^［3，9］。YAP是Hippo信号通路途径下游的关键转录辅助因子，当Hippo信号通路失去活性时，YAP能由细胞质转换至细胞核，其通过结合DNA结合转录因子激活基因的表达并调节细胞的各种功能，包括细胞分化、增殖、凋亡及迁移^［9-10］。多项研究^［11-12］表明YAP表达异常与肿瘤发生呈正相关关系。因此，Hippo信号通路被视为恶性肿瘤的潜在治疗靶点^［13-14］。

细胞迁移和侵袭依赖于F-actin的解聚，并由特定的伪足和收缩的微丝结构驱动^［15］，细胞骨架受相应的细胞信号调节^［16］。YAP调节肌动蛋白细胞骨架重排和癌细胞侵袭^［17］。

YAP作为Hippo信号通路的核心分子，其可直接或间接调控与癌症的侵袭和迁移有关的靶基因表达，触发肿瘤细胞中侵袭性伪足的出现，减少细胞间黏附，降解细胞外基质，并引起EMT，促进肿瘤的侵袭和转移^［4］。EMT是上皮性癌症细胞获得间质表型并降低细胞间黏附的过程，参与多种癌症的浸润生长和转移。YAP的高表达促进EMT，导致肿瘤的发生，且已在肝细胞癌、口腔鳞状细胞癌、结肠癌和卵巢癌等研究中被证实^{［11，18-21］}。然而，YAP在CC中的功能及潜在机制尚不清楚。

本研究通过沉默CC细胞系SiHa细胞中YAP的表达，研究YAP对CC细胞生物学行为的影响，结果显示：YAP沉默后SiHa细胞的增殖、侵袭和迁移过程受到明显抑制；YAP蛋白沉默后EMT相关上皮标记物E-cadherin表达上调，间质标志物Snail表达下调，可能会逆转EMT的进展。上述结果表明YAP可能在宫颈鳞状细胞癌的发生和转移中发挥重要作用。

YAP蛋白表达水平变化影响细胞周期的进程^［22］，c-MYC的激活引起基因组编程的变化，从而促进核糖体生物的发生、细胞生长和细胞增殖^［23］。c-MYC是最常见的与细胞周期和凋亡相关的致癌基因之一，在CC组织中有大量表达^［24］。YAP是c-MYC转录的刺激因子，参与CC中c-MYC的调节^{［12，25］}。Bcl-2是凋亡抑制因子，被认为是YAP-TEA域转录因子1（TEA domainfamilymember 1，TEAD1）活性复合物的直接靶基因^［26］，本研究中YAP沉默后SiHa细胞中c-MYC和Bcl-2蛋白表达水平降低，表明YAP可以调节c-MYC和Bcl-2，影响细胞周期和细胞凋亡，促进CC的发生和发展。

YAP的表达影响DNA 损伤修复，YAP的下调可以抑制DNA损伤修复和细胞过度增殖^［27］。当DNA发生损伤，出现DNA双链断裂（double-stranded breaks，DSBs）时，在损伤处形成H2AX焦点，在C端的丝氨酸残基迅速磷酸化形成γ-H2AX。γ-H2AX在DNA损伤位点扩增DNA损伤反应（DNA damage response，DDR）信号因子以修复DNA，γ-H2AX在DNA修复完成后及时脱磷酸化^［28］。γ-H2AX 定位于细胞核，与基因的转录和调控、DNA修复、细胞周期控制及细胞凋亡有关^［29］。本研究结果显示：YAP沉默后γ-H2AX蛋白表达明显下调，提示YAP可能通过调控DNA损伤修复的过程，影响CC的发生。DDR抑制可能是进一步深入研究CC发病机制和治疗的强有力靶点，可以提高当前治疗的有效性^［30］。

综上所述，YAP沉默可以通过多个途径抑制CC细胞的生长及转移，同时也可调节EMT、DNA损伤修复、细胞周期和细胞凋亡相关蛋白，其可能通过其下游的肿瘤微环境相关蛋白参与CC的发生和发展。

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基金资助

国家自然科学基金地区基金项目(81860043)

国家自然科学基金青年基金项目(81902790)

吉林省科技厅科技发展计划项目(20200201571JC)

吉林省教育厅“十三五”科学技术项目(JJKH20200525KJ)