甜菜碱对大鼠脑微血管内皮细胞氧糖剥夺损伤的改善作用及对PI3K/AKT通路的影响

Ameliorating effect of betaine on oxygen-glucose deprivation injury in rat brain microvascular endothelial cells and its influence in PI3K/AKT pathway

摘要

目的：探讨甜菜碱在大鼠脑微血管内皮细胞（BMECs）氧糖剥夺损伤中的作用，阐明甜菜碱对磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B (AKT)通路的调节机制。方法：选取5只7日龄SD大鼠，获取大鼠BMECs，在低氧低糖条件下制备BMECs氧糖剥夺模型，分为模型组，低、中和高剂量甜菜碱组及阳性对照组，另设空白对照组（不进行造模），空白对照组和模型组大鼠BMECs给予新鲜培养基，阳性对照组大鼠BMECs给予终浓度为10μmol·L-1的尼莫地平，低、中和高剂量甜菜碱组大鼠BMECs分别给予终浓度为0.5、1.0及2.0 mmol·L-1的甜菜碱。采用CCK-8法检测培养12、24和48 h时各组大鼠BMECs存活率，试剂盒检测各组大鼠BMECs中乳酸脱氢酶（LDH）活性和三磷酸腺苷（ATP）水平，酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测各组大鼠BMECs上清液中肿瘤坏死因子α (TNF-α)、白细胞介素（IL）-6、IL-1β和IL-18水平，试剂盒检测各组大鼠BMECs中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）水平，使用跨内皮电阻（TEER）分析仪检测各组大鼠BMECs的TEER值，使用插入式细胞培养器检测各组大鼠BMECs的辣根过氧化物酶（HRP）通透率，缺口末端标记（TUNEL）染色法检测各组大鼠BMECs凋亡率，Western blotting法检测各组大鼠BMECs中磷酸化PI3K (p-PI3K)/PI3K和磷酸化AKT (p-AKT)/AKT比值。结果：与空白对照组比较，模型组大鼠BMECs存活率，SOD活性，ATP水平和TEER值及大鼠BMECs中p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值均明显降低（P<0.05）;LDH活性，TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18和MDA水平，BMECs凋亡率和HRP通透率均明显升高（P<0.05）。与模型组比较，低、中和高剂量甜菜碱组及阳性对照组大鼠BMECs存活率，SOD活性，ATP水平和TEER值及大鼠BMECs中p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值均明显升高（P<0.05）;LDH活性、TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18和MDA水平，BMECs凋亡率和HRP通透率均明显降低（P<0.05）。结论：甜菜碱能够修复大鼠BMECs氧糖剥夺损伤，抑制BMECs氧化损伤及凋亡，改善大鼠BMECs通透性，其机制可能与调节PI3K/AKT通路有关。

关键词

甜菜碱 / 氧糖剥夺 / 再灌注损伤 / 磷脂酰肌醇3激酶 / 蛋白激酶B

Key words

Betaine / Oxygen and sugar deprivation / Reperfusion injury / Phosphoinositide 3-kinase / Protein kinase B

脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells，BMECs）氧糖剥夺损伤与脑细胞及神经损伤的发生存在密切关联，研究^［1］表明：氧糖剥夺再灌注可能导致BMECs炎症反应及氧化应激反应加剧，影响BMECs的功能，如不及时干预，可能导致脑卒中等疾病的发生^［2］。因此，对于BMECs氧糖剥夺再灌注损伤治疗药物的研发仍是当前研究的重点。磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）通路是近年来研究并证实与氧糖剥夺再灌注损伤过程存在密切关联的信号通路，PI3K/AKT通路的过度抑制可能是导致BMECs损伤的关键因素^［3-4］。甜菜碱是广泛存在于各种动植物中的生物碱，具有抗肿瘤和调节血压等多种药理作用^［5-6］。近年来，研究^［7］表明其在细胞氧糖剥夺再灌注损伤的修复过程中具有较大潜力。然而，有关甜菜碱对于BMECs氧糖剥夺再灌注的保护作用及其机制的研究尚未见相关报道，因此本研究探讨甜菜碱对BMECs氧糖剥夺再灌注损伤的保护作用及其机制，为BMECs氧糖剥夺再灌注损伤治疗药物的研发提供参考。

1 材料与方法

1.1　实验动物、主要试剂和仪器

5只7日龄SD大鼠，雄性，体质量12~20 g，健康清洁级，购自新疆医科大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK（新）2023-0001。本研究动物实验经本院伦理委员会审核批准（批准文号：KY2022061519）。甜菜碱（标准品，纯度≥98%，货号：B8230）、尼莫地平（标准品，纯度≥98%，货号：SN8560）和磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）（货号：P1022）购自北京索莱宝科技有限公司，乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）试剂盒（货号：hlk3939）购自上海佰利莱生物科技有限公司，三磷酸腺苷（adenosine-triphosphate，ATP）试剂盒（货号：S0026）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）试剂盒（货号：PT516）、白细胞介素（interleukin，IL）-6试剂盒（货号：PI328）、IL-1β试剂盒（货号：PI303）、IL-18试剂盒（货号：PI555）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒（货号：S0101）、丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）试剂盒（货号：S0131）、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）试剂盒（货号：ST2569）、缺口末端标记（TdT-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL）凋亡试剂盒（货号：T2196）、甘油醛3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH） （货 号：AF1186）、磷酸化PI3K（phosphorylated PI3K，p-PI3K） （货号： AF5905）、 PI3K （货号： AF7742）、磷酸化AKT（phosphorylated-AKT，p-AKT）（货号：AF1546）、AKT兔抗体（货号：AA326）、山羊抗兔二抗（货号：A0208）、化学发光试剂盒（货号：P0018）和蛋白测定试剂盒（货号：P0011）均购自碧云天生物科技有限公司。Artemis ST型跨内皮电阻（transepithlium electrical resistant，TEER）分析仪购自荷兰Locsense公司，DM IRB型荧光倒置显微镜购自德国Leica公司，Gel Doc EZ型凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司，Allegra X-30R型高速冷冻离心机购自美国Beckman Coulter公司，iD5型酶标仪购自美谷分子仪器（上海）有限公司。

1.2　BMECs分离、培养及氧糖剥夺模型的制备

取7日龄新生SD大鼠，断头处死后，取大脑皮质，剪碎后过100目筛，收集血管组织，使用0.2%胶原酶消化后，1 000 r·min^-1离心10 min，弃上清，得到BMECs，使用PBS缓冲液清洗3次，接种于预先涂有1%明胶的培养皿中，使用含1%双抗的DMEM完全培养基继续培养，待细胞融合度达80%时进行传代。使用第3代细胞进行后续实验。使用含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM完全培养基，将BMECs置于37 ℃、5%CO₂常氧恒温培养箱中培养，待细胞融合度达90%时开始传代，并进行后续实验。取对数生长期的BMECs，使用PBS缓冲液清洗2次后，使用无糖DMEM培养基，置于37 ℃，94% N₂、5% CO₂和 1% O₂恒温小室中培养6 h，制备BMECs氧糖剥夺模型^［8-9］。

1.3　细胞分组和处理

将氧糖剥夺培养后的大鼠BMECs置于37 ℃、5% CO₂培养箱中，分别设置模型组，低、中和高剂量甜菜碱组及阳性对照组，另设空白对照组，不进行造模，使用完全培养基于37 ℃、5%CO₂培养箱中正常培养。各剂量甜菜碱组分别给予终浓度为0.5、1.0和2.0 mmol·L^-1的甜菜碱^［10］，阳性对照组给予终浓度为10 μmol·L^-1的尼莫地平^［11］，空白对照组更换不含甜菜碱和尼莫地平的新鲜培养液，置于完全培养基继续培养。每组设置3个复孔。

1.4　CCK-8法检测不同时间点各组大鼠BMECs存活率

各组大鼠BMECs按照“1.3”中的方法给药，另设调零组，只加入培养基和CCK-8试剂，不加细胞和药物，分别培养12、24和48 h，采用CCK-8法检测各组BMECs的存活率。细胞存活率＝（实验组A值－调零组A值）/（对照组A值－调零组A值）×100%。

1.5　采用试剂盒检测各组大鼠BMECs中LDH活性和ATP水平

BMECs按照“1.3”中的方法给药后，继续培养24 h，使用胰酶消化并收集各组BMECs，使用试剂盒分别检测各组BMECs中LDH活性和ATP水平。

1.6　酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法检测各组大鼠BMECs上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18水平

BMECs按照“1.3”中的方法给药后，继续培养24 h，收集细胞上清液，3 500 r·min^-1、4 ℃离心5 min，取上清，ELISA法检测各组大鼠上清液中BMECs中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18水平。

1.7　采用试剂盒检测各组大鼠BMECs中SOD活性和MDA水平

BMECs按照“1.3”中的方法给药后，继续培养24 h，使用胰酶消化并收集各组BMECs，3 500 r·min^-1、4 ℃离心5 min，弃上清，使用试剂盒检测各组大鼠BMECs中SOD活性和MDA水平。

1.8　采用TEER分析仪和插入式细胞培养器检测各组BMECs的TEER值及HRP通透率

BMECs按照“1.3”中的方法给药后，继续培养24 h，使用TEER分析仪测定各组BMECs的TEER值，使用插入式细胞培养器测定各组BMECs的HRP通透率^［12-13］。HRP通透率=受体池HRP浓度×受体池培养液体积/（供体池HRP浓度×供体池培养液体积）×100%。

1.9　TUNEL法检测各组大鼠BMECs凋亡率

BMECs按照“1.3”中的方法给药后，继续培养24 h，使用TUNEL试剂盒测定各组大鼠BMECs凋亡率。细胞凋亡率=TUNEL阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.10　Western blotting法检测各组大鼠BMECs中p-PI3K、PI3K、p-AKT和AKT蛋白表达水平

BMECs按照“1.3”中的方法给药后，继续培养24 h，使用胰酶消化并收集BMECs，使用细胞裂解液充分裂解后，8 000 r·min^-1、4 ℃离心10 min，取上清，采用蛋白测定试剂盒测定总蛋白浓度，取蛋白浓度为40 μg的裂解液，依次经电泳、分离和转膜后，使用质量分数为5%的脱脂牛奶室温封闭1 h，分别经GAPDH、p-PI3K、PI3K、p-AKT和AKT兔抗体（所有抗体按照1∶500稀释）4 ℃孵育过夜，PBS缓冲液清洗3次，山羊抗兔二抗（1∶1 000稀释）室温孵育1 h，PBS缓冲液再次清洗3次，使用化学发光液，置于凝胶成像系统拍照，计算p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值。

1.11　统计学分析

采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。各组大鼠BMECs存活率，BMECs中LDH和SOD活性以及ATP和MDA水平，BMECs上清中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18水平，BMECs的TEER值、HRP通透率和细胞凋亡率，BMECs中p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值均符合正态分布，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　不同时间点各组大鼠BMECs存活率

与空白对照组比较，培养12、24和48 h时模型组大鼠BMECs存活率明显降低（P<0.05）；与模型组比较，培养12、24和48 h时，低、中和高剂量甜菜碱组及阳性对照组大鼠BMECs存活率明显升高（P<0.05），且随着甜菜碱剂量的升高，培养12、24和48 h时大鼠BMECs存活率逐渐升高。依据大鼠BMECs存活率结果，确定后续实验BMECs给药后培养时间为24 h。见表1。

2.2　各组大鼠BMECs中LDH活性和ATP水平

与空白对照组比较，模型组大鼠BMECs中LDH活性明显升高（P<0.05），ATP水平明显降低（P<0.05）；与模型组比较，低、中和高剂量甜菜碱组及阳性对照组大鼠BMECs中LDH活性明显降低（P<0.05），ATP水平明显升高（P<0.05），且随着甜菜碱剂量的升高，大鼠BMECs中LDH活性逐渐降低（P<0.05），ATP水平逐渐升高（P<0.05）。见表2。

2.3　各组大鼠BMECs上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18水平

与空白对照组比较，模型组大鼠BMECs上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18水平明显升高（P<0.05）；与模型组比较，低、中和高剂量甜菜碱组及阳性对照组大鼠BMECs上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β以及IL-18水平明显降低（P<0.05），且随着甜菜碱剂量的增加，大鼠BMECs上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18水平逐渐降低（P<0.05）。见表3。

2.4　各组大鼠BMECs中SOD活性和MDA水平

与空白对照组比较，模型组大鼠BMECs中SOD活性明显降低（P<0.05），MDA水平明显升高（P<0.05）；与模型组比较，低、中和高剂量甜菜碱组及阳性对照组大鼠BMECs中SOD活性明显升高（P<0.05），MDA水平明显降低（P<0.05），且随着甜菜碱剂量的升高，大鼠BMECs中SOD活性逐渐升高（P<0.05），MDA水平逐渐降低（P<0.05）。见表4。

2.5　各组大鼠BMECs的TEER值和HRP通透率

与空白对照组比较，模型组大鼠BMECs的TEER值降低（P<0.05），HRP通透率升高（P<0.05）；与模型组比较，低、中和高剂量甜菜碱组及阳性对照组大鼠BMECs的TEER值升高（P<0.05），HRP通透率降低（P<0.05），且随着甜菜碱剂量的升高，大鼠BMECs的TEER值逐渐升高（P<0.05），HRP通透率逐渐降低（P<0.05）。见表5。

2.6　各组大鼠BMECs凋亡率

与空白对照组（1.01%±0.19%）比较，模型组大鼠BMECs凋亡率（44.35%±2.46%）明显升高（P<0.05）；与模型组比较，低（31.78%±1.60%）、中（17.40%±0.66%）和高（6.10%±0.89%）剂量甜菜碱组及阳性对照组（6.37%±0.83%）大鼠BMECs凋亡率明显降低（P<0.05），且随着甜菜碱剂量的升高，大鼠BMECs凋亡率逐渐降低（P<0.05）。见图1。

2.7　各组大鼠BMECs中p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值

与空白对照组比较，模型组大鼠BMECs中p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值明显降低（P<0.05）；与模型组比较，低、中和高剂量甜菜碱组及阳性对照组大鼠BMECs中p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值明显升高（P<0.05），且随着甜菜碱剂量的升高，大鼠BMECs中p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值逐渐升高（P<0.05）。见图2和表6。

3 讨 论

脑卒中具有发生率高、死亡风险大和预后差等特点，而脑血管内皮细胞损失是导致脑卒中发生发展的关键因素^［14-15］。缺血缺氧环境引发的BMECs细胞氧糖剥夺是导致脑血管内皮细胞和神经细胞损伤的重要原因。因此，抑制BMECs氧糖剥夺/再灌注损伤可能是预防脑血管病变及脑卒中发生的重要途径。研究^［16-18］显示：甜菜碱对于缺血再灌注损伤的治疗具有显著的改善作用，其在细胞缺血缺氧后再灌注损伤的修复中具有较大潜力。因此，本研究探讨甜菜碱对大鼠BMECs氧糖剥夺/再灌注损伤的修复作用及其机制，为甜菜碱的药理作用研究提供参考。

LDH是细胞氧糖剥夺的重要代谢标志物^［19-20］，夏霜莉等^［21］研究显示：降低LDH活性能够显著改善大鼠脑血管内皮细胞和神经元细胞损伤。由此可见，调节大鼠BMECs代谢水平，抑制LDH释放，是改善大鼠BMECs氧糖剥夺/再灌注损伤的有效途径。同时，TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18水平是反映细胞损伤及炎症水平的重要标志^［22-24］，调节TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18水平可能是治疗BMECs氧糖剥夺/再灌注损伤的有效途径和方法。本研究结果表明：甜菜碱能够呈剂量依赖性地抑制LDH释放，调节BMECs中ATP水平，进而显著改善氧糖剥夺/再灌注后BMECs炎症损伤，降低TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18水平。同时，甜菜碱呈剂量依赖性升高SOD活性并降低MDA水平，进一步改善BMECs氧化损伤，缓解炎症损伤，与文献［25-26］报道结果一致。

TEER值是反映BMECs通透性的重要指标，张创等^［27］研究表明：TEER值降低与脑缺血再灌注小鼠BMECs通透性降低有关；陈丽等^［28］研究表明：TEER值下调与缺血再灌注大鼠血脑屏障通透性改变有关，上调TEER值与缓解血脑屏障通透性及减轻脑组织缺血后损伤有关联。由此可见，调节TEER值可能是改善BMECs氧糖剥夺/再灌注损伤的有效途径。窦晋芳等^［29］研究表明：HRP通透率升高与血脑屏障结构和功能存在关联，孙瑞等^［30］研究表明：降低HRP通透率可显著改善BMECs通透性。本研究结果表明：与模型组比较，各剂量甜菜碱组大鼠BMECs的TEER值呈剂量依赖性升高，HRP通透率降低，进而调节BMECs通透性，修复大鼠BMECs损伤。

PI3K/AKT通路是近年来发现的与BMECs氧糖剥夺/再灌注损伤相关的重要信号通路^［31-32］。王圣鑫等^［33］研究表明：氧糖剥夺/再灌注损伤的发生与HT22细胞中PI3K/AKT通路的过度抑制有关，激活PI3K/AKT通路能够显著修复细胞氧化应激损伤。由此可见，调节PI3K/AKT通路可能是修复BMECs损伤的有效途径和方法。本研究结果表明：与模型组比较，各剂量甜菜碱组大鼠BMECs中PI3K和AKT蛋白磷酸化水平呈剂量依赖性升高，大鼠BMECs存活率明显升高，抑制BMECs凋亡，促进BMECs氧糖剥夺/再灌注损伤的恢复。

综上所述，甜菜碱能够修复大鼠BMECs氧糖剥夺/再灌注损伤，抑制BMECs氧化损伤及凋亡，改善大鼠BMECs通透性，其机制可能与调节PI3K/AKT通路有关。

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基金资助

新疆维吾尔自治区科技厅自然科学基金项目(2022D01C113)