沉默DDX39A基因对食管癌TE-1细胞增殖、迁移和侵袭的作用及其机制

Effect of silencing DDX39A gene on proliferation, migration and invasion of esophageal cancer TE-1 cells and its mechanism

摘要

目的：探讨沉默DEAD-box RNA解旋酶39A (DDX39A)对食管癌TE-1细胞增殖、迁移和侵袭的调控作用，并阐明其可能的作用机制。方法：通过基因表达汇编（GEO）数据库下载GSE63941、GSE77861、GSE20347和GSE16153芯片数据，利用癌症基因组图谱（TCGA）数据库筛选并下载食管癌相关数据；采用R软件分析差异表达基因；通过基因与蛋白质相互作用关系检索工具（STRING）构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络数据，并采用Cytoscape软件中MCODE插件整合数据，鉴别出相关性强的关键基因，用基因表达谱数据动态分析网页工具（GEPIA 2）分析正常食管黏膜和食管癌组织中关键基因的表达情况，用卡普兰-迈尔曲线图（Kaplan-Meier Plotter）将筛查出来的关键基因进行生存分析并绘图。细胞学实验，选择食管癌TE-1细胞作为研究对象，采用小干扰RNA技术（siRNA）沉默DDX39A基因表达；取对数生长期TE-1细胞，将细胞分为空白组（MOCK组）、阴性对照组（si-NC组）和沉默组（si-DDX39A组）；采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)和Western blotting法检测各组细胞中DDX39A mRNA及蛋白表达水平，CCK-8法检测各组细胞增殖活性，细胞划痕愈合实验检测各组细胞迁移率，Transwell小室实验检测各组TE-1细胞的侵袭细胞数，Western blotting法检测各组细胞中β-黏连蛋白（β-catenin）、糖原合成酶激酶-3β (GSK3β)、磷酸化糖原合成酶激酶-3β (p-GSK3β)、原癌基因（c-MYC）和细胞周期蛋白D1 (Cyclin D1)及核内β-catenin蛋白表达水平。结果：TCGA数据库与GEO数据库相结合共得到56个差异表达基因。Cytoscape软件MCODE插件共鉴别出41个相关性强的关键基因，通过GEPIA 2和Kaplan-Meier plotter数据库分析41个基因得到DDX39A。RT-qPCR和Western blotting法，与si-NC组比较，si-DDX39A组细胞中DDX39A mRNA和蛋白表达水平均降低（P<0.05）。CCK-8法，si-DDX39A组细胞增殖活性低于si-NC组（P<0.05）；细胞划痕实验，24 h后，si-DDX39A组细胞迁移率低于si-NC组（P<0.05）;Transwell小室实验，si-DDX39A组侵袭细胞数低于si-NC组（P<0.05）。与si-NC组比较，si-DDX39A-1组和si-DDX39A-3组TE-1细胞中β-catenin、p-GSK3β、c-MYC及Cyclin D1以及核内β-catenin蛋白表达水平均降低（P<0.01），而GSK3β蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。结论：DDX39A基因沉默可以抑制食管癌TE-1细胞的增殖、迁移和侵袭能力，其作用机制可能与调控Wnt/β-catenin信号通路有关。

关键词

食管肿瘤 / DEAD-box RNA解旋酶39A / 生物信息学 / 信号通路 / 细胞侵袭

Key words

Esophageal neoplasms / DEAD-box RNA Helicase 39A / Bioinformatics / Signaling pathway / Cell invasion

食管癌是全球最常见的癌症之一^［1］。在我国，食管癌也属于高发的消化道系统肿瘤，其发病率和致死率分别位于消化系统肿瘤的第6位及第4位^［2］，且在食管癌发病后期尚未有能够显著提高患者生存质量的治疗措施，进而影响患者的预后^［3-5］。因此，探索食管癌的发生发展机制并寻找新的诊疗靶标是近年来研究的重点。DEAD-box RNA解旋酶39A（DEAD-box RNA helicase 39A，DDX39A）是RNA解旋酶DEAD-box家族成员之一，其在免疫识别、信号通路调控和RNA转录与剪切等方面发挥重要作用^［6］。研究^［7-9］显示：DDX39A在黑色素癌、肾癌和肺癌等多种恶性肿瘤组织中异常表达，且与肿瘤的强侵袭性和低生存率存在关联。目前，DDX39A在食管癌恶性进展过程中的作用及其相关机制尚未见相关报道。本研究探讨沉默DDX39A基因表达对食管癌TE-1细胞增殖、迁移和侵袭的作用及其对Wnt/β-黏连蛋白（β-catenin）信号通路的影响，并阐明其作用机制，为食管癌的靶向治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1　细胞、主要试剂和仪器

人食管癌TE-1细胞购于中国科学院上海细胞库。DDX39A siRNA及阴性对照siRNA由和元生物技术（上海）股份有限公 司 合 成， Lipofectamine 2000 试 剂 购 自 美 国Invitrogen公司，多克隆抗体DDX39A、单克隆抗体原癌基因（c-MYC）和单克隆抗体细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）购于武汉ABclonal公司，单克隆抗体β-catenin、GAPDH、糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK3β）、磷酸化GSK3β（phosphorylated GSK3β， p-GSK3β）和LaminB1购于杭州华安生物技术有限公司，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、Transwell 小室和RPMI 1640培养基购于以色列 Biolnd 公司，Opti-MEM^TM（减血清）培养基购于澳大利亚Gibco公司，CCK-8试剂购于河北瑞帕特生物科技有限公司，实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）试剂盒购于天津中实同创公司。倒置荧光显微镜（型号：TI-FL）购于日本Nikon公司，CO₂恒温培养箱（型号：3111）、Varioskan^TM LUX多功能微孔板读数仪（型号：VL0L00D0）、PCR仪（型号：Veriti）和RT-qPCR仪（型号：TCR0096）购于美国Thermo公司，电泳仪（型号：DYY-4C）购于北京六一生物科技有限公司。

1.2　生物信息学资料收集与分析

从癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库中下载162例食管癌和11名正常人的基因表达数据，采用R语言DESeq2包进行差异分析，以调整后的P值 （adj.P）<0.05， | log差异倍数（FC）|>1为筛选条件，得到差异表达的基因；在基因表达汇编（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库中下载GSE63941、GSE77861、GSE20347和GSE16153的基因表达数据集，以adj.P<0.05，|logFC|>1为筛选条件，通过GEO数据库自带在线分析工具GEO2R分析每一个数据集，得到差异表达基因；通过基因与蛋白质相互作用关系检索工具（STRING）构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络数据，并采用Cytoscape软件中MCODE插件整合数据，鉴别出相关性强的关键基因；通过基因表达谱数据动态分析网页工具（GEPIA 2）分析工具（http：//gepia2.cancer-pku.cn/）分析DDX39A在食管癌中mRNA表达情况；利用卡普兰-迈尔曲线图（Kaplan-Meier plotter）（https：//www.kmplot.com/analysis/）数据库分析DDX39A蛋白表达水平与食管癌患者预后的相关性。

1.3　细胞培养、分组和转染

将人食管癌TE-1细胞采用含10% FBS的RPMI 1640培养基进行培养。将其置于37 ℃、5% CO₂的细胞培养箱中培养，观察细胞状态，使其正常生长。当TE-1细胞处于对数生长期时，将其接种于6孔细胞培养板中，当细胞密度达到75%~80%时，将其分为空白对照组（MOCK组）、阴性对照组（si-NC组）和沉默组（si-DDX39A组）。依据Lipofectamine 2000试剂盒的说明书分别进行不同片段的转染。MOCK组未做处理组，si-NC组转染阴性对照siRNA，si-DDX39A组根据转染不同的沉默片段分为si-DDX39A-1组、si-DDX39A-2组和si-DDX39A-3组。转染6 h后换含10% FBS的RPMI 1640培养基培养，转染48 h内，采用RT-qPCR法测定TE-1细胞中DDX39A mRNA表达水平；转染72 h内，采用Western blotting法测定中TE-1细胞中DDX39A蛋白表达水平。

1.4　Western blotting法检测各组TE-1细胞中DDX39A蛋白表达水平

将各组处于对数生长期细胞，按比例在RIPA裂解液中加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，RIPA裂解液冰上裂解细胞30 min，4 ℃、20 000 r·min^-1离心15 min，吸取上清液，提取细胞蛋白。使用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法检测各组蛋白浓度。然后以1∶4的比例将SDS缓冲液与提取的上清液混合，将其煮沸。将各组分别取10 μg蛋白上样，利用10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（sodium dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electroporesis，SDS-PAGE）进行 电 泳 分 离， 再 转 膜 至 聚 偏 氟 乙 烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜。用5%的脱脂牛奶在摇床上室温封闭1 h后，采用DDX39A抗体（1∶1 000）4 ℃孵育过夜；在加入相应的二抗（1∶10 000）摇床上室温孵育1 h，用TBST溶液冲洗3次，每次8 min。在膜上均匀滴加ECL发光液，然后用显影仪进行显影、曝光，得到图像，采用Image J软件进行灰度值分析，以GAPDH为内参计算各组TE-1细胞中DDX39A蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/GAPDH蛋白条带灰度值。

1.5　RT-qPCR 法检测各组TE-1细胞中DDX39A mRNA表达水平

将各组细胞培养转染48 h内，使用RNA提取试剂盒提取细胞的RNA，进行cDNA逆转录，之后进行Real-time PCR扩增，检测DDX39A mRNA表达水平。Real-time PCR反应采用两步法。第一步：95 ℃、5 min；第二步：95 ℃、10 s，60 ℃、20 s，40个循环。DDX39A引物序列：正向引物，5'-GATTGAGCCTGTCAAC-GGACAG-3'；反向引物，5'-GATGGAGAGACC-ACCGAAGA-AC-3'。以GAPDH为内参比较RT-qPCR扩增的程度。以GAPDH作为内参基因，采用2^-△△Ct法计算DDX39A mRNA表达水平。

1.6　CCK-8法检测各组TE-1细胞增殖活性

转染48 h后，取各组数量相等的细胞，接种于96孔细胞培养板中（每孔3×10³个细胞），分别于培养0、24、48和72 h后，配置含10% CCK-8的培养基以换液的形式加入96孔细胞培养板中，培养2 h后，用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度（A）值，并绘制细胞增殖曲线，以A值代表细胞增殖活性。

1.7　细胞划痕实验检测各组TE-1细胞迁移率

各组细胞转染48 h后接种于6孔细胞培养板中（每孔1×10⁵个细胞）培养24 h，融合度大于90%时；用200 μL的枪头尖端在融合的单层上进行划痕，并加入不含FBS的培养基进行培养；划痕后0~24 h内，在光学显微镜下记录细胞的图像，采用Image J软件计算划痕部位的迁移面积，并计算划痕愈合率。划痕愈合率=（0 h划痕面积-24 h划痕面积）/0 h划痕面积×100%，划痕愈合率即为细胞迁移率。

1.8　Transwell小室实验检测各组TE-1细胞的侵袭细胞数

各组细胞转染48 h后，用无血清RPMI 1640重悬细胞，分别取各组相同数量的细胞（每孔5×10⁴个细胞）接种于Transwell小室的上室，下室加入500 μL的RPMI 1640+10% FBS培养基，置于细胞培养箱中培养。48 h后将小室取出，用多聚甲醛固定并用0.1%结晶紫染色；使用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）清洗并晾干后，拍照并随机选取5个视野进行细胞计数，5个视野侵袭细胞数的均值代表细胞的侵袭能力。侵袭实验前以1∶8比例将无血清RPMI 1640与基质胶混合，铺于Transwell小室上室，放在培养箱中使其形成薄膜。培养48 h后，结晶紫染色，显微镜拍照并随机选取5个视野进行细胞计数，5个视野侵袭细胞数的均值代表细胞的侵袭能力，以上实验每组重复3次。

1.9　Western

blotting法检测各组TE-1细胞中β-catenin、p-GSK3β、GSK3β、c-MYC和Cyclin D1及核内β-catenin蛋白表达水平　各组细胞转染72 h 后，分别提取各组细胞的蛋白，Western blotting法检测各组TE-1细胞中β-catenin、p-GSK3β、GSK3β、c-MYC和Cyclin D1及核内β-catenin蛋白表达水平。方法同“1.4”。其中核内β-catenin蛋白表达水平=核内β-catenin蛋白条带灰度值/LaminB1蛋白条带灰度值，以LaminB1为内参。β-actin、p-GSK3β、GSK3β、c-MYC和Cyclin D1一抗浓度为1∶1 000，二抗浓度为1∶10 000。

1.10　统计学分析

采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 8.0统计软件进行统计学分析。各组细胞增殖活性、细胞迁移率、侵袭细胞数和DDX39A mRNA表达水平，TE-1细胞中DDX39A、β-actin、p-GSK3β、GSK3β、c-MYC和Cyclin D1及核内β-catenin蛋白表达水平均符合正态分布，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验；2组间样本均数比较采用两独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　食管癌生物信息学分析结果

在TCGA数据库中下载关于食管癌组织的基因集，分析162例食管癌患者食管癌组织和11名正常人食管组织中的差异表达基因，结合GEO数据库的验证，通过交互式维恩图分析得到的数据集中的14 222个差异表达基因，其中共同差异表达基因有50个上调基因和6个下调基因用于后续分析 （图1）。利用Cytoscape分析软件整合PPI网格数据并进行可视化分析，用其MCODE插件鉴别相关性强的关键基因有41个（图2）；利用GEPIA 2在线数据库对食管癌的差异表达基因进行差异分析，结果显示：DDX39A基因在肿瘤组织中的表达水平高于正常组织（图3A）；利用Kaplan-Meier plotter数据库绘制DDX39A表达的生存曲线，结果显示：DDX39A高表达食管癌患者的生存率低（图3B）。

2.2　各组TE-1细胞中DDX39A mRNA和蛋白表达水平

与MOCK组和si-NC组比较，si-DDX39A-1组、si-DDX39A-2组和si-DDX39A-3组TE-1细胞中DDX39A mRNA表达水平明显降低（P<0.05）；与MOCK组和si-NC组比较，si-DDX39A-1组和si-DDX39A-3组TE-1细胞中DDX39A蛋白表达水平明显降低（P<0.05），而si-DDX39A-2组TE-1细胞中DDX39A蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）。MOCK组和si-NC组TE-1细胞中DDX39A mRNA及蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。因此选取si-NC组、si-DDX39A-1组和si-DDX39A-3组的TE-1细胞进行后续实验。见表1和图4。

2.3　各组细胞增殖活性

CCK-8法检测结果显示：细胞初接种至96孔细胞培养板为0 h，各组细胞的增殖活性比较差异无统计学意义（P>0.05）。培养48和72 h时，与si-NC组比较，si-DDX39A-1组和si-DDX39A-3组TE-1细胞增殖活性明显降低（P<0.05）。见图5。

2.4　各组TE-1细胞迁移率和侵袭细胞数

与si-NC组（60.54% ± 3.52%） 比 较， si-DDX39A-1 组（10.27%±1.34%）和si-DDX39A-3组（12.54%± 1.55%）TE-1细胞迁移率明显降低（P<0.01）。见图6。Transwell小室实验检测结果显示：与si-NC组（158.66个±6.44个）比较， si-DDX39A-1组（41.20个±4.33个）和si-DDX39A-3组（32.66个± 5.55个）TE-1细胞侵袭细胞数明显减少（P<0.01）。见图7。

2.5　各组TE-1细胞中β-catenin、p-GSK3β、GSK3β、c-MYC、Cyclin D1和核内β-catenin蛋白表达水平

与si-NC组比较， si-DDX39A-1组和si-DDX39A-3组TE-1细胞中β-catenin、 Cyclin D1、 c-MYC和p-GSK3β及核内β-catenin蛋白表达水平明显降低（P<0.01），而GSK3β蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。见图8和9。

3 讨 论

由于食管癌发生发展的机制十分复杂，目前手术治疗和放化疗等传统疗法在食管癌治疗及预后等方面均具有局限性^［10］。而分子靶向治疗是当前研究的热点，其为食管癌的治疗提供了新的可能性。如何找到能用于早期诊断和治疗的靶点是当前研究的重点。本研究以食管癌TE-1细胞为研究对象，通过沉默细胞中DDX39A基因，研究Wnt/β-catenin信号通路相关信号靶蛋白的表达，观察细胞增殖、迁移和侵袭能力，并探讨其可能的作用机制。本研究结果显示：转染siRNA可降低TE-1细胞中DDX39A mRNA和蛋白表达水平，沉默DDX39A基因可抑制食管癌TE-1细胞增殖、迁移和侵袭能力，其可能通过抑制β-catenin的核易位，减少β-catenin表达，进而抑制下游c-MYC和Cyclin D1蛋白的表达，从而影响Wnt/β-catenin信号传导。

DDX39A是一种以三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）依赖性方式解开双链RNA的DEAD box RNA解旋酶，其可调控RNA的转录、剪接、输出、核糖体生物发生、端粒保护和翻译等多个方面^［11-12］。研究^［13］表明：DEAD box蛋白参与细胞增殖或肿瘤转化的关键过程，包括肿瘤细胞生长、细胞周期控制、细胞凋亡、RNA易位、细胞骨架重排和细胞迁移。研究^［14］显示：DDX39A在多种肿瘤组织中高表达，在乳腺癌中DDX39A高表达与其肿瘤的发生和预后不良存在密切关联，沉默DDX39A基因可抑制人乳腺癌MCF7细胞的增殖和侵袭能力。DDX39A表达升高导致胃癌患者预后不良^［15］；研究^［16］显示：在肝细胞癌中，沉默DDX39A基因的表达可抑制人肝癌细胞Huh1和Hep3B的迁移和侵袭能力，沉默DDX39A可抑制β-catenin在细胞核中的积累以及抑制Wnt信号传导，其机制可能是DDX39A通过调控Wnt/β-catenin信号传导，从而抑制肝癌的恶性发展。

Wnt/β-catenin信号传导失调已被证实与恶性肿瘤的发生有关^［17］。激活的Wnt/β-catenin信号传导促进细胞增殖和肿瘤干细胞更新，在恶性表型的发展中具有重要作用^［18］。p-GSK3β是Wnt通路的关键调节因子，通过影响β-catenin参与调控细胞增殖和凋亡^［19-20］。β-catenin是Wnt通路的关键组成部分^［21-22］，其可作为黏附结合蛋白和转录辅助调节因子发挥作用，与细胞黏附有关^［23］。研究^［24-25］显示：Wnt/β-catenin信号通路参与食管癌的发生发展，是通过将β-catenin转运到细胞核中与T细胞因子（T-cell factor，TCF）和淋巴细胞增强因子（lymphoid enhancer factor，LEF）家族转录因子结合，激活Wnt靶基因的转录从而促进癌症的转移。c-MYC和Cyclin D1基因会被β-catenin激活，使c-MYC和Cyclin D1的蛋白表达水平升高。Cyclin D1是一种与细胞周期调节相关的蛋白质，可作为细胞周期蛋白依赖性激酶的调节剂。Cyclin D1的扩增或过表达会改变细胞周期进程并导致肿瘤发生，而c-MYC可调控细胞周期S期，影响细胞周期从而调控肿瘤细胞的增殖^［26-28］。ZHANG等^［16］研究显示：DDX39A过表达与Wnt/β-catenin信号通路激活有关。本研究结果显示：沉默DDX39A后TE-1细胞β-catenin、pGSK-3β、c-MYC和Cyclin D1蛋白表达水平均降低。沉默DDX39A抑制β-catenin的核易位，使核内β-catenin蛋白表达水平降低。

综上所述，沉默DDX39A基因可抑制食管癌TE-1细胞增殖、迁移和侵袭能力，其可能是通过靶向抑制β-catenin表达，进而抑制下游靶蛋白c-MYC和Cyclin D1来实现的，靶向DDX39A可为食管癌的治疗提供新的思路。

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基金资助

河北省科技厅重点研发计划项目卫生健康创新专项(22377765D)

河北省卫健委2024年度医学科学研究指导性课题(20240286)

河北北方学院自然科学项目(XJ2023040)