蜡样芽孢杆菌cytK和nhe毒素基因双重核酸试纸条快速检测方法的建立及其评价

摘要

目的:采用聚合酶链式反应（PCR）和胶体金技术建立1种蜡样芽孢杆菌cytK和nhe2种毒素基因双重核酸试纸条快速检测方法,并对其特异性、灵敏度、重复性和稳定性进行评价。方法:采用煮沸法提取蜡样芽孢杆菌DNA,以蜡样芽孢杆菌细胞毒素cytK和非溶血性肠毒素nhe为靶基因设计特异性引物,通过克隆转化鉴定PCR产物,确定胶体金标记链霉亲和素、质量控制线（C线）、cytK检测线（T₁）和nhe检测线（T₂）最佳标记量,组装核酸试纸条并对其特异性、灵敏度、重复性和稳定性进行评价。结果:蜡样芽孢杆菌DNA浓度为248 mg·L^-1,纯度为1.8～2.0;经克隆转化和测序比对,PCR产物与GenBank数据库中已登记的蜡样芽孢杆菌cytK和nhe相似性均为100%。在pH为7.0的条件下,每200μL胶体金溶液中链霉亲和素最佳标记量为6.0μL;质量控制线（C线）最佳标记量为2.00 g·L^-1,cytK基因检测线（T1）最佳标记量为0.550 g·L^-1,nhe基因检测线（T₂）最佳标记量为0.2 g·L^-1。特异性检测,仅蜡样芽孢杆菌组显示阳性结果,试纸条与金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌无交叉反应,与电泳结果一致;灵敏度检测,当双重核酸试纸条中蜡样芽孢杆菌DNA浓度降至10^-2 mg·L^-1时,可观察到C线、T1线和T₂线3个条带,检测限为琼脂糖凝胶电泳(10^-1mg·L^-1)的1/10;重复性检测,由不同实验室不同人员对试纸条进行验证,结果一致;稳定性检测,在第6、9和12个月进行试纸条稳定性验证,稳定性良好。结论:本研究建立的双重核酸试纸条法可以同时检测蜡样芽孢杆菌cytK和nhe毒素基因,灵敏度高,特异性强,可实现快速可视化检测。

关键词

蜡样芽孢杆菌 / cytK / nhe / 双重核酸试纸条