BTK抑制剂BGB-3111联合硼替佐米对人多发性骨髓瘤细胞凋亡的影响及其机制

Effect of BTK inhibitor BGB-3111 combined with bortezomib on apoptosis of human multiple myeloma cells and its mechanism

摘要

目的 探讨泽布替尼（BGB-3111）联合硼替佐米（Btz）对人多发性骨髓瘤（MM）细胞凋亡的影响，并阐明其可能的机制。 方法 体外培养人MM U266、PS-R、RPMI8226、KMS28-PE、KMS28-BM和H929细胞，Western blotting法检测不同细胞中布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）蛋白表达水平。采用细胞计数试剂盒8（CCK-8）法检测0、10、20、30、40和50 μmol·L^-1 BGB-3111处理的RPMI8226、U266及KMS28-BM细胞存活率。取对数生长期RPMI8226、U266和KMS28-BM细胞，分为对照组、BGB-3111组、Btz组和BGB-3111+Btz组，采用流式细胞术检测各组细胞凋亡率，Western blotting法检测各组细胞中髓细胞白血病因子1（MCL-1）、B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相互作用细胞死亡介质蛋白（Bim）、磷酸化Bim（p-Bim）、P65、磷酸化P65（p-P65）、肿瘤坏死因子受体相关因子（TRAF）2和肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导蛋白3（A20）蛋白表达水平。U266细胞分为A20过表达组（A20-OE组）和空载对照组（EV组），2组细胞各分为对照组、BGB-311组、BTZ组和BGB-311+BTZ组，转染相应质粒，采用Western blotting法检测各组细胞转染效率，流式细胞术检测过表达A20后各组细胞凋亡率。 结果 Western blotting法检测，与KMS28-BM细胞比较，U266、RPMI8226和H929细胞中BTK蛋白表达水平均明显升高（P<0.05或P<0.01）。CCK-8法检测，与0 μmol·L^－1 BGB-3111组比较，10、20、30、40和50 μmol·L^-1 BGB-3111组RPMI8226细胞及U266细胞存活率均明显降低（P<0.05或P<0.01），20、30、40和50 μmol·L^-1 BGB-3111组KMS28-BM细胞存活率均明显降低（P<0.01）。与RPMI8226和U266细胞比较，20、30和40 μmol·L^-1 BGB-3111组KMS28-BM细胞存活率均明显升高（P<0.05），选取10 μmol·L^-1 BGB-3111用于后续实验。流式细胞术检测，与对照组比较，BGB-3111组、Btz组和BGB-3111+Btz组RPMI8226及U266细胞凋亡率均明显升高（P<0.05或P<0.01）；与BGB-3111组和Btz组比较，BGB-3111+Btz组RPMI8226及U266细胞凋亡率均明显升高（P<0.01）；与对照组比较，Btz组和BGB-3111+Btz组KMS28-BM细胞凋亡率均明显升高（P<0.01）；与BGB-3111组比较，BGB-3111+Btz组KMS28-BM细胞凋亡率明显升高（P<0.01）；与EV组细胞比较，Btz组和BGB-3111+Btz组中A20-OE细胞凋亡率均明显升高（P<0.01）。Western blotting法检测，与对照组比较，BGB-3111组、Btz组和BGB-3111+Btz组RPMI8226细胞及U266细胞中Bim蛋白表达水平均明显升高（P<0.05），Btz组和BGB-3111+Btz组RPMI8226细胞及U266细胞中MCL-1、p-Bim和Bcl-2蛋白表达水平均明显降低（P<0.05）；与BGB-3111组和Btz组比较，BGB-3111+Btz组RPMI8226细胞和U266细胞中Bim蛋白表达水平均明显升高（P<0.05），MCL-1、p-Bim和Bcl-2蛋白表达水平均明显降低（P<0.05）。与对照组比较，Btz组和BGB-3111+Btz组RPMI8226及U266细胞中p-P65蛋白表达水平均明显升高（P<0.05），TRAF2和A20蛋白表达水平均明显降低（P<0.05）；与BGB-3111组和Btz组比较，BGB-3111+Btz组RPMI8226和U266细胞中p-P65蛋白表达水平均明显升高（P<0.05），TRAF2和A20蛋白表达水平均明显降低（P<0.05）。与EV组比较，A20-OE组细胞中A20蛋白表达水平明显升高（P<0.01）。 结论 BGB-3111通过抑制BTK活性诱导MM细胞发生凋亡，并增强Btz的促凋亡作用，过表达A20增加MM细胞对联合用药的敏感性，其抗肿瘤作用可能与核因子κB（NF-κB）信号通路抑制有关。

Abstract

Objective To discuss the effect of zanubrutinib （BGB-3111） combined with bortezomib （Btz） on the apoptosis of the human multiple myeloma （MM） cells， and to clarify its possible mechanism. Methods The human MM cell lines U266， PS-R， RPMI8226， KMS28-PE， KMS28-BM， and H929 were cultured in vitro. Western blotting method was used to detect the expression level of Bruton’s tyrosine kinase （BTK） protein in various cells； cell counting kit-8（CCK-8） method was used to detect the survival rates of the RPMI8226， U266， and KMS28-BM cells after treated with 0， 10， 20， 30， 40， and 50 μmol·L⁻¹ BGB-3111. The RPMI8226， U266， and KMS28-BM cells at the logarithmic growth phase were selected and divided into control group， BGB-3111 group， Btz group， and BGB-3111+Btz group. Flow cytometry was used to detect the apoptotic rates of the cells in various groups； Western blotting method was used to detect the expression levels of myeloid cell leukemia 1 （MCL-1）， B-cell lymphoma-2（Bcl-2）， Bcl-2-interacting mediator of cell death （Bim）， phosphorylated Bim （p-Bim）， P65， phosphorylated P65 （p-P65）， tumor necrosis factor receptor-associated factor （TRAF） 2， and tumor necrosis factor alpha-induced protein 3 （A20） in different kinds of cells. The U266 cells were divided into A20 overexpression group （A20-OE group） and empty vector control group （EV group）. Each group was further divided into control group， BGB-3111 group， Btz group， and BGB-3111+Btz group. The corresponding plasmids were transfected； Western blotting method was used to detect the transfection efficiency of the cells in various groups； flow cytometry was used to detect the apoptotic rates of the cells in various groups after over-expression of A20. Results The Western blotting results showed that compared with KMS28-BM cells， the expression levels of BTK protein in the U266， RPMI8226， and H929 cells were significantly increased （P<0.05 or P<0.01）. The CCK-8 results showed that compared with 0 μmol·L⁻¹ BGB-3111 group， the survival rates of the RPMI8226 and U266 cells in 10， 20， 30， 40， and 50 μmol·L⁻¹ BGB-3111 groups were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）， and the survival rates of the KMS28-BM cells in 20， 30， 40， and 50 μmol·L⁻¹ BGB-3111 groups were significantly decreased （P<0.05）. Compared with RPMI8226 and U266 cells， the survival rates of the KMS28-BM cells in 20， 30， and 40 μmol·L⁻¹ BGB-3111 groups were significantly increased （P<0.05）. Therefore， 10 μmol·L⁻¹ BGB-3111 was selected for subsequent experiments. The flow cytometry results showed that compared with control group， the apoptotic rates of the RPMI8226 and U266 cells in BGB-3111 group， Btz group， and BGB-3111+Btz group were significantly increased （P<0.05 or P<0.01）； compared with BGB-3111 group and Btz group， the apoptotic rates of the RPMI8226 and U266 cells in BGB-3111+Btz group were significantly increased （P<0.01）； compared with control group， the apoptotic rates of the KMS28-BM cells in Btz group and BGB-3111+Btz group were significantly increased （P<0.01）； compared with BGB-3111 group， the apoptotic rate of the KMS28-BM cells in BGB-3111+Btz group was significantly increased （P<0.01）； compared with EV group， the apoptotic rates of the cells in A20-OE group in Btz group and BGB-3111+Btz group were significantly increased （P<0.05）. The Western blotting results showed that compared with control group， the expression levels of Bim protein in the RPMI8226 and U266 cells in BGB-3111 group， Btz group， and BGB-3111+Btz group were significantly increased （P<0.05）， while the expression levels of MCL-1， p-Bim， and Bcl-2 proteins in the RPMI8226 and U266 cells in Btz group and BGB-3111+Btz group were significantly decreased （P<0.05）； compared with BGB-3111 group and Btz group， the expression levels of Bim protein in the RPMI8226 and U266 cells in BGB-3111+Btz group were significantly increased （P<0.05）， while the expression levels of MCL-1， p-Bim， and Bcl-2 proteins were significantly decreased （P<0.05）. Compared with control group， the expression levels of p-P65 protein in the RPMI8226 and U266 cells in Btz group and BGB-3111+Btz group were significantly increased （P<0.05）， while the expression levels of TRAF2 and A20 proteins were significantly decreased （P<0.05）； compared with BGB-3111 group and Btz group， the expression levels of p-P65 protein in the RPMI8226 and U266 cells in BGB-3111+Btz group were significantly increased （P<0.05）， while the expression levels of TRAF2 and A20 proteins were significantly decreased （P<0.05）. The flow cytometry results showed that compared with EV group， the expression level of A20 protein in A20-OE group cells was significantly increased （P<0.01）. Conclusion BGB-3111 induces apoptosis in the MM cells by inhibiting BTK activity and enhances the pro-apoptotic effect of Btz. Over-expression of A20 increases the sensitivity of the MM cells to the combined treatment. The antitumor effect may be related to the inhibition of the nuclear factor kappa B （NF-κB） signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

多发性骨髓瘤 / 布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂 / 硼替佐米 / 肿瘤坏死因子α诱导蛋白3 / 核因子κB

Key words

Multiple myeloma / Bruton’s tyrosine kinase inhibitor / Bortezomib / Tumor necrosis factor alpha-induced protein 3 / Nuclear factor kappa B

多发性骨髓瘤（multiplemyeloma，MM）是一种起源于骨髓中终末分化浆细胞的恶性肿瘤，位居血液系统恶性肿瘤发病率的第2位^［1-2］。蛋白酶体抑制剂硼替佐米（bortezomib，Btz）能够提高MM患者生存率，但大部分患者仍然无法治愈，主要是由于患者对Btz产生了获得性耐药，因此迫切需要寻找更为有效的治疗方法提高患者生存率^［3］。Btz在MM中的主要作用机制是抑制20S蛋白水解核心的凝乳蛋白酶样位点，进而发挥多种作用，如阻断核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路的激活、阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡等^［4］。VO等^［5］研究发现：至少约45% MM患者存在NF-κB信号通路的改变，而肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）诱导蛋白3（TNF-α-induced protein 3，A20）是NF-κB信号通路的下游靶基因，具有修饰泛素并调节NF-κB信号通路负反馈信号的诱导酶，能够负反馈抑制NF-κB信号通路^［6-7］。

A20是多种癌症的关键调节因子，其在浸润性乳腺癌中表达上调，敲除A20会增加乳腺癌细胞对放疗和化疗的敏感性^［8］，但在胶质瘤^［9］、肝细胞癌^［10］、低分化头颈癌和未分化鼻咽癌^［11］等实体肿瘤中起非致瘤作用。A20也是B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤中易缺失及失活的肿瘤抑制因子^［12］，其在肿瘤中的功能依赖于细胞类型。

MM患者具有特殊的骨髓微环境，布鲁顿酪氨酸激酶（Bruton’s tyrosine kinase，BTK）是一种胞质酪氨酸激酶，对B淋巴细胞瘤的增殖与肿瘤微环境中各成分的关联性较为重要，在B淋巴细胞发育、分化和B细胞抗原受体（B cell antigen receptor，BCR）信号传导中发挥重要作用^［13-14］。2019年11月，美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准泽布替尼（zanubrutinib，BGB-3111）上市，其作为BTK的二代选择性抑制剂对BTK的抑制表现出更高的选择性和更强的效果，可以抑制多种慢性淋巴瘤细胞白血病（chronic lymphoma leukemia，CLL）和弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell Lymphoma，DLBCL）细胞增殖^［15］。在MM中联合应用Btz和BGB-3111对MM细胞凋亡的影响及其机制的报道较少。因此，本研究探讨BGB-3111和Btz联合用药对MM细胞凋亡率、凋亡相关蛋白和NF-κB信号通路相关蛋白的作用，分析过表达A20后人MM细胞的凋亡情况及其可能的作用机制，为MM的治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1　细胞、主要试剂和仪器

人MM细胞U266（野生型，对Btz敏感细胞）、PS-R（对Btz耐药的U266细胞）、RPMI8226、KMS28-PE、KMS28-BM、H929和HEK293T细胞均由吉林大学第一医院肿瘤精准医学实验室提供。RPMI-1640培养液、胎牛血清和青-链霉素双抗（美国Gibico公司），Annexin Ⅴ-FITC/PI双染流式试剂（天津三箭生物技术股份有限公司），BGB-3111（德国Sigma公司），Btz（美国Selleck公司），二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（德国Merck公司），质粒提取试剂盒（德国QIAGEN公司），Lipofectamine^TM3000和Opti-MEM（美国Thermo公司），psPAX2和pMD2.G（美国Addgene公司），BTK抗体、GAPDH、β-Tubulin、髓细胞白血病因子1（myeloid cell leukemin-1，MCL-1）、P65/磷酸化P65（phosphorylated P65，p-P65）、肿瘤坏死因子受体相关因子（TNF receptor-associated factor， TRAF）2、 B细胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）和Bcl-2相互作用细胞死亡介质蛋白（Bcl-2 interaction mmediator of cell death，Bim）/磷酸化Bim（phosphorylated Bim，p-Bim）（位点为Ser69）（美国CST公司）。蛋白电泳仪（美国Bio-Rad公司），流式细胞分析仪（美国BD公司）。

1.2　细胞培养及分组

U266、PS-R、RPMI8226、KMS28-PE、KMS28-BM和H929细胞采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养。取处于对数生长期的RPMI8226、U266和KMS28-BM细胞，分为对照组、BGB-3111组（10 μmol·L^-1 BGB-3111）、Btz组（3 nmol·L^-1 Btz）和BGB-3111+Btz组，对照组加入与干预组药物同体积的DMSO。KMS28-BM细胞采用相同分组，Btz作用浓度为5 nmol·L^-1。RPMI8226和U266细胞作用24 h，KMS28-BM细胞作用48 h。

1.3　质粒转染和A20过表达细胞制备

将配制好的LB培养基高压后，取成品菌液5 µL加入5 mL LB培养基中，于摇床上37 ℃、220 r·min^-1恒温培养12~16 h。获取菌液，按质粒提取试剂盒说明书操作，提取质粒进行转染，转染步骤按照Lipofectamine^TM 3000 说明书进行。利用HEK 293T细胞制备慢病毒包装液，将其培养至可转染的密度后去除旧培养基，采用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）清洗1次。配置转染液，A液：1 μg DNA+1 μg psPAX2+0.5 μg pMD2.G+5 µL P3000加入125 µL Opti-MEM中；B液：3.75 µL Lipofectamine^TM 3000+125 µL Opti-MEM；分别混匀于试验台内静置5 min后，将A液与B液混合，室温孵育15 min。处理好的转染试剂加入培养板中，置于细胞培养箱中培养，48 h后收病毒液。将过滤好的病毒液与合适密度U266细胞悬液按1∶1比例混合，放入6孔细胞培养板中培养48 h以上，采用Western blotting法检测细胞转染效率，荧光显微镜观察到细胞均带有荧光标记即为成功转染。将转染后的U266细胞分为A20过表达组（A20-OE组）和空载对照组（EV组），2组细胞各分为对照组、BGB-3111组、Btz组和BGB-3111+Btz组，处理条件同U266细胞，流式细胞术检测细胞凋亡情况，实验重复3次。

1.4　细 胞 计 数 试 剂 盒 8 （cell counting kit-8，CCK-8）

法检测不同浓度BGB-3111处理的MM细胞存活率　取处于对数生长期的RPMI8226、U266和KMS28-BM细胞，调整细胞密度为每孔3×10⁵个细胞，接种于96孔细胞培养板中，分别给予0、10、20、30、40和50 μmol·L^-1 BGB-3111处理24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续孵育4 h，无菌操作，期间每隔1 h取出培养板，震荡5 min。采用酶标仪于波长450 nm处测定吸光度（A）值，实验重复3次。细胞存活率=（实验孔A值-空白孔A值）/（对照孔A值-空白孔A值）×100%。

1.5　Annexin Ⅴ-FITC/PI双染法检测各组MM细胞凋亡率

细胞计数后以每孔3×10⁵个细胞的密度接种于12孔细胞培养板中，分组处理后收集细胞，于室温1 500 r·min^-1离心5 min后，冷PBS缓冲液悬浮细胞，反复洗涤2次，弃上清，加入300 μL 1×Binding Buffer 悬 浮 细 胞，再 加 入 5 μL Annexin Ⅴ-FITC混匀后，室温避光孵育15 min，随后加入5 μL PI 染色并补加200 μL 1×Binding Buffer，流式细胞术检测细胞凋亡率，最后采用FlowJo V7.6软件分析数据，实验重复3次。其中，Annexin V⁺PI^－代表早期凋亡细胞群，Annexin V⁺PI⁺代表晚期凋亡细胞群。细胞凋亡率=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.6　Western blotting法检测各组MM细胞中凋亡相关蛋白表达水平

收集处于对数生长期的PS-R、U266、H929、KMS28-PE、KMS28-BM和RPMI8226细胞。使用预冷的PBS缓冲液清洗3次，RIPA裂解液提取总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，加入蛋白质上样缓冲液，95 ℃煮沸5 min，-20 ℃保存备用。恒压200 V、45 min SDS-PAGE电泳后，将蛋白转移至PVDF膜上，5% BSA中室温封闭1 h，根据BTK、MCL-1、Bim、p-Bim、P65、p-P65、TRAF2、A20和Bcl-2相对分子质量裁膜，4 ℃孵育12 h，TBST溶液清洗3次后，相应二抗室温孵育1 h，TBST溶液清洗后滴加ECL液化学发光，应用成像系统采集，Image J软件分析蛋白条带灰度值，以β-Tubulin为内参，计算目的蛋白表达水平，实验重复3次。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。

1.7　统计学分析

采用SPSS 20.0统计软件和GraphPad prism10.0软件进行统计学分析及绘图。各组细胞存活率和细胞凋亡率以及细胞中MCL-1、Bim、p-Bim、P65、p-P65、TRAF2、A20和Bcl-2蛋白表达水平均符合正态分布，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　不同MM细胞中BTK蛋白表达水平

与KMS28-BM细胞比较，U266、RPMI8226和H929细胞中BTK蛋白表达水平均明显升高（P<0.05或P<0.01），PS-R细胞中BTK蛋白表达水平升高，但差异无统计学意义（P>0.05）。KMS28-PE细胞中不表达BTK蛋白。见图1。

2.2　不同浓度BGB-3111处理的MM细胞存活率

与0 μmol·L^-1 BGB-3111组比较，10、20、30、40和50 μmol·L^-1 BGB-3111组RPMI8226及U266细胞存活率均明显降低（P<0.05或P<0.01），10 μmol·L^-1 BGB-3111组KMS28-BM细胞存活率降低，但差异无统计学意义（P>0.05），20、30、40和50 μmol·L^-1 BGB-3111组KMS28-BM细胞存活率均明显降低（P<0.01）。与RPMI8226和U266 细 胞 比 较，20、 30 和 40 μmol·L^-1 BGB-3111组KMS28-BM细胞存活率均明显升高（P<0.05）。见表1。10 μmol·L^-1 BGB-3111作用于RPMI8226、U266和KMS28-BM细胞时，其对3种细胞活性抑制作用较弱，便于观察联合用药效果，因此选取10 μmol·L^-1 BGB-3111用于后续实验。2.3　各组MM细胞凋亡率　与对照组比较，BGB-3111 组、 Btz 组 和 BGB-3111 + Btz 组RPMI8226及U266细胞凋亡率均明显升高（P<0.05或P<0.01）；与BGB-3111组和Btz组比较，BGB-3111+Btz组RPMI8226和U266细胞凋亡率均明显升高（P<0.01）。与对照组比较，Btz组和BGB-3111+Btz组KMS28-BM细胞凋亡率均明显升高（P<0.01），BGB-3111组KMS28-BM细胞凋亡率差异无统计学意义（P>0.05）；与BGB-3111组比较，BGB-3111+Btz组KMS28-BM细胞凋亡率明显升高（P<0.01）；与Btz组比较，BGB-3111+Btz组KMS28-BM细胞凋亡率差异无统计学意义（P>0.05）。与EV组细胞比较，Btz组和BGB-3111+Btz组A20-OE细胞凋亡率均明显升高（P<0.01）；BGB-3111组A20-OE细胞和EV细胞凋亡率比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图2~5。

2.4　各组MM细胞中MCL-1、p-Bim、Bim和Bcl-2蛋白表达水平

与对照组比较，BGB-3111组、Btz组和BGB-3111+Btz组RPMI8226及U266细胞中Bim蛋白表达水平均明显升高（P<0.05），Btz组和BGB-3111+Btz组RPMI8226及U266细胞中MCL-1、p-Bim以及Bcl-2蛋白表达水平均明显降低（P<0.05），BGB-3111组RPMI8226和U266细胞中MCL-1、p-Bim及Bcl-2蛋白表达水平差异均无统计学意义（P>0.05）；与BGB-3111组和Btz组比较，BGB-3111+Btz组RPMI8226和U266细胞中Bim蛋白表达水平均明显升高（P<0.05），MCL-1、p-Bim和Bcl-2蛋白表达水平均明显降低（P<0.05）。见图6。

2.5　各组MM细胞中P65、p-P65、TRAF2和A20蛋白表达水平

与对照组比较，Btz组和BGB-3111+Btz组RPMI8226及U266细胞中p-P65蛋白表达水平均明显升高（P<0.05），TRAF2和A20蛋白表达水平均明显降低（P<0.05），BGB-3111组RPMI8226和U266细胞中P65、p-P65、TRAF2和A20蛋白表达水平差异均无统计学意义（P>0.05）；与BGB-3111组和Btz组比较，BGB-3111+Btz组RPMI8226和U266细胞中p-P65蛋白表达水平均明显升高（P<0.05），TRAF2和A20蛋白表达水平均明显降低（P<0.05）；各组RPMI8226和U266细胞中P65蛋白表达水平差异均无统计学意义（P>0.05）。与EV组比较，A20-OE组细胞中A20蛋白表达水平明显升高（P<0.01）。见图7和8。

3 讨 论

BTK属于胞质酪氨酸蛋白激酶（tyrosine-protein kinase，TEC）家族，是人类第二大非受体激酶家族，除T淋巴细胞外，其在造血系统的所有细胞中均有表达^［16］。BCR信号通路上游Src家族激酶激活BTK后，反馈至磷酸化磷脂酶Cγ（phosphorylated phospholipase-Cγ，PLCγ），导致钙离子动员和NF-κB/丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信号通路激活，相关信号促进增殖和存活相关基因的表达^［10-11］。目前靶向BTK治疗血液肿瘤多集中于部分淋巴瘤的治疗。本研究结果显示：RPMI8226和H929细胞高表达BTK蛋白，U266和PS-R细胞低表达BTK蛋白，KMS28-PE和KMS28-BM细胞不表达BTK蛋白，且不表达BTK蛋白的MM细胞对BGB-3111的抑制作用不敏感。流式细胞术检测结果显示：在表达BTK蛋白的MM细胞中，BGB-3111能够增强Btz的促凋亡作用，而在不表达BTK蛋白的MM细胞中联合用药效果较差，几乎全部为Btz单药的作用，提示MM细胞中BTK蛋白表达水平对BGB-3111的效应起重要作用。共价BTK抑制剂依鲁替尼能够有效抑制BCR信号，在CLL小鼠模型中产生明显的抗肿瘤反应，尽管存在这种靶向抑制机制，但不良反应较多，而且逐渐出现耐药^［17］。BGB-3111具有更高的选择性，同时极大地降低了脱靶效应，不良反应少^［18］，与Btz的联合应用于淋巴瘤的治疗中具有潜在的优势，然而在MM中的作用机制尚未完全阐明。

为进一步研究联合用药对MM细胞凋亡的影响及其机制，本研究采用Western blotting法检测凋亡相关蛋白表达情况，结果显示：与单药组比较，联合用药组细胞中MCL-1、Bcl-2和p-Bim蛋白表达水平明显降低，Bim蛋白表达水平明显升高，提示BGB-3111通过抑制Bim的磷酸化，增加其蛋白稳定性，使MM细胞对Btz诱导的凋亡更加敏感。Btz可通过下调MCL-1诱导凋亡，可能是两药联合作用的机制之一，抗凋亡蛋白Bcl-2下调提示MM细胞的抗凋亡作用减弱，BGB-3111与Btz联合应用效果更佳，可进一步促进MM细胞凋亡，与贾晓辉^［19］在套细胞淋巴瘤中的研究结果一致。

尽管慢性淋巴瘤和MM代表的肿瘤分别处于B淋巴细胞分化的不同阶段，但其在病理上均与NF-κB异常活化有关^［20］。NF-κB通常以二聚体形式存在，受到炎症刺激后κB抑制蛋白a（inhibitor of kappa B alpha，IκBa）被κB抑制蛋白（inhibitor of kappa B，IκB）激酶磷酸化，磷酸化IκB入核调控靶基因的转录，促进肿瘤发生^［21］。Btz抑制泛素化IκBa通过蛋白酶体降解，IκBa则通过结合P65，使其无法入核发挥转录因子作用，导致P65和p-P65滞留于胞质，从而无法发挥转录因子的作用^［21-22］。本研究结果显示：与单药组比较，联合用药组p-P65蛋白表达水平升高；在Btz和联合用药的作用下A20蛋白表达下调，可能是因NF-κB信号通路的抑制导致其表达下调。TRAF2作为NF-κB途径的上游调节分子，其下调反映出NF-κB途径被抑制。

在NF-κB信号通路的启动过程中，各种炎症因子的作用导致肿瘤坏死因子受体相关因子家族（tumor necrosis factor receptor associated factors，TRAFs）向受体募集。其中TRAF2通过一个蛋白复合物募集，该蛋白复合物由多个接头蛋白组成，包括受体相互作用蛋白1（receptor interacting protein 1，RIP1）、泛素连接酶凋亡抑制蛋白（cellular inhibitor of apoptosis protein，cIAP）1和cIAP2。cIAP促进在RIP1和TRAF2上及在自身上进行赖氨酸（lysin，Lys）63连接的多泛素化，Lys63连接的多泛素链与NF-κB的必须调节分子NEMO、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤易位蛋白（mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation protein，MALT1）等分子结合，进一步激活NF-κB信号通路传导，A20通过从各种靶分子上切割Lys63连接的多泛素链来负性调节NF-κB信号通路^［23-24］。SCHMITZ等^［25］研究发现：A20是霍奇金淋巴瘤和原发性纵隔B细胞淋巴瘤的肿瘤抑制基因。异常NF-κB活化的一个基本特性是抑制凋亡反应。研究^［26］显示：稳定表达微小RNA（microRNA，miR）-125a/b的DLBCL更能抵抗凋亡作用，而A20表达的重建恢复了miR-125a/b表达产生的抗凋亡特性。在幽门螺旋杆菌感染的胃上皮细胞中，A20负调控NF-κB信号通路并破坏抗凋亡基因的表达^［27］。本研究结果显示：在A20过表达的U266细胞中，Btz组和BGB-3111+Btz组细胞凋亡率明显升高，与LORK等^［23］和SCHMITZ等^［25］的研究结果一致。

综上所述，BGB-3111通过抑制BTK活性诱导MM细胞发生凋亡，并增强Btz的促凋亡作用，过表达A20增加MM细胞对联合用药的敏感性，其抗肿瘤作用可能与抑制NF-κB信号通路有关。

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基金资助

吉林省科技厅自然科学基金项目(20190201163JC)