鹿茸多肽对C2C12成肌细胞分化的调控作用及机制

Regulatory effect of velvet antler polypeptides on differentiation of C2C12 myoblasts and its mechanism

摘要

目的 探讨鹿茸多肽对C2C12成肌细胞分化过程中线粒体能量代谢效率的调控作用，并阐明其相关机制。 方法 采用生长培养基（GM）维持C2C12成肌细胞增殖，加入分化培养基（DM）诱导细胞分化，分化时间为1、3和5 d，分化的C2C12成肌细胞分为对照组和鹿茸多肽组，鹿茸多肽组加入80 mg·L^-1鹿茸多肽，对照组给予同等体积磷酸盐缓冲液（PBS）。采用细胞计数试剂盒8（CCK-8）法检测0、5、10、20、40、60、80、120、160和200 mg·L^-1鹿茸多肽处理后各组未分化细胞增殖率，免疫荧光法检测各组细胞融合指数，Western blotting法检测各组细胞中肌球蛋白、肌细胞生成素、泛醌氧化还原酶B8（NDUFB8）、线粒体编码细胞色素C氧化酶1（MT-CO1）和琥珀酸脱氢酶复合体黄蛋白亚基A（SDHA）蛋白表达水平，2'，7'-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）荧光探针法检测各组细胞中活性氧（ROS）水平，线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）检测各组细胞线粒体膜电位，试剂盒检测各组细胞中三磷酸腺苷（ATP）水平、葡萄糖摄取量和乳酸水平。 结果 与 0 mg·L^-1 鹿茸多肽处理组比较，60、80、120、160和200 mg·L^-1鹿茸多肽处理组未分化C2C12成肌细胞增殖率均明显升高（P<0.05）。免疫荧光法检测，与分化同期对照组比较，分化3和5 d鹿茸多肽处理组C2C12成肌细胞融合指数均明显降低（P<0.05），多核肌管细胞数量明显减少。Western blotting法，与分化同期对照组比较，分化1、3和5 d鹿茸多肽组细胞中肌球蛋白表达水平均明显降低（P<0.05），分化3和5 d鹿茸多肽组细胞中肌细胞生成素蛋白表达水平明显降低（P<0.05或P<0.01）；与分化同期对照组比较，分化5 d鹿茸多肽组细胞中NDUFB8和MT-CO1蛋白表达水平均明显降低（P<0.05或P<0.01），分化1、3和5 d鹿茸多肽组细胞SDHA蛋白表达水平均明显降低（P<0.05或P<0.01）。DCFH-DA荧光探针法，与分化同期对照组比较，分化5 d鹿茸多肽组细胞ROS水平明显降低（P<0.01）。JC-1试剂盒检测，与分化同期对照组比较，分化3和5 d鹿茸多肽组细胞线粒体膜电位均明显升高（P<0.05）。与分化同期对照组比较，分化1 d鹿茸多肽组细胞葡萄糖摄取量明显降低（P<0.01），分化5 d鹿茸多肽组细胞葡萄糖摄取量明显升高（P<0.05），分化1、3和5 d鹿茸多肽组细胞乳酸水平差异均无统计学意义（P>0.05）；分化1和3 d鹿茸多肽组细胞ATP水平均明显升高（P<0.05）。 结论 鹿茸多肽对C2C12成肌细胞分化具有抑制作用，其机制可能与鹿茸多肽降低线粒体氧化磷酸化复合体亚基表达，提高线粒体氧化磷酸化效率有关。

Abstract

Objective To discuss the regulatory effect of velvet antler polypeptide on mitochondrial energy metabolism efficiency during myoblast differentiation， and to clarify its related mechanism. Methods The C2C12 myoblasts were maintained in growth medium （GM） and then induced to differentiate in differentiation medium（DM） for 1， 3， and 5 d. The differentiated C2C12 myoblasts were divided into control group and velvet antler polypeptide group. The VAP group was treated with 80 mg·L^-1 velvet antler polypeptide， while the control group was given an equal volume of phosphate buffer saline （PBS）. Cell counting kit-8 （CCK-8） method was used to detect the proliferation rate of the undifferentiated cells in various groups after treated with 0， 5， 10， 20， 40， 60， 80， 120， 160， and 200 mg·L^-1 velvet antler polypeptide； immunofluorescence staining was used to detect the fusion indexes of the cells in various groups； Western blotting method was used to detect the expression levels of myosin， myogenin， myogenin：ubiquinone oxidoreductase subunit B8 （NDUFB8）， mitochondrially encoded cytochrome c oxidase Ⅰ （MT-CO1）， and succinate dehydrogenase complex flavoprotein subunit A （SDHA） proteins in the cells in various groups； 2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate （DCFH-DA） fluorescence probe assay was used to detect the reactive oxygen species （ROS） level in the cells in various groups； JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit was used to detect the mitochondrial membrane potential of the cells in various groups； commercial kits were used to detect the adenosine triphosphate （ATP） level， glucose uptake， and lactate level in the cells in various groups. Results The CCK-8 results showed that compared with 0 mg·L^-1 velvet antler polypeptide group， the proliferation rates of undifferentiated C2C12 myoblasts in 60， 80， 120， 160， and 200 mg·L^-1 velvet antler polypeptide groups were significantly increased （P<0.05）. The immunofluorescence results showed that compared with control group at the same differentiation stage， the fusion indices of the C2C12 myoblasts in velvet antler polypeptide group at 3 and 5 d of differentiation were significantly decreased （P<0.05）， and the number of multinucleated myotubes was significantly decreased. The Western blotting results showed that compared with control group at the same differentiation stage， the expression levels of myosin in the cells in velvet antler polypeptide group at 1， 3， and 5 d of differentiation were significantly decreased （P<0.05）； the expression levels of myogenin protein in the cells in velvet antler polypeptide group at 3 and 5 d of differentiation were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）. Compared with control group at the same differentiation stage， the expression levels of NDUFB8 and MT-CO1 proteins in the cells in velvet antler polypeptide group at 5 d of differentiation were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）； the expression levels of SDHA protein in the cells in velvet antler polypeptide group at 1， 3， and 5 d of differentiation were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）. The DCFH-DA results showed that compared with control group at the same differentiation stage， the ROS level in velvet antler polypeptide group at 5 d of differentiation was significantly decreased （P<0.01）. The JC-1 assay results showed that compared with control group at the same differentiation stage， the mitochondrial membrane potentials in the cells in velvet antler polypeptide group at 3 and 5 d of differentiation were significantly increased （P<0.05）. Compared with control group at the same differentiation stage， the glucose uptake in the cells in velvet antler polypeptide group at 1 d of differentiation was significantly decreased （P<0.01）， and the glucose uptake at 5 d of differentiation was significantly increased （P<0.05）； there were no significant differences in lactate levels in the cells in velvet antler polypeptide group at 1， 3， and 5 d of differentiation （P>0.05）； the ATP levels in velvet antler polypeptide group at 1 and 3 d of differentiation were significantly increased （P<0.05）. Conclusion Velvet antler polypeptide inhibits the differentiation of the C2C12 myoblasts， and its mechanism may be related to the down-regulation of mitochondrial oxidative phosphorylation complex subunit expression and the improvement of mitochondrial oxidative phosphorylation efficiency.

Graphical abstract

关键词

鹿茸多肽 / 成肌细胞分化 / 线粒体 / 衰老 / 肌肉退行性疾病

Key words

Velvet antler polypeptide / Myoblast differentiation / Mitochondria / Aging / Muscular degenerative diseases

随着人口老龄化的加剧，衰老相关研究成为医学研究的热点，特别是在肌肉健康领域。骨骼肌是人体质量最大的器官，约占体质量的30%~40%，骨骼肌的功能变化直接影响人体健康^［1］。衰老相关的肌肉退行性疾病是人类最常见的肌肉萎缩类型，随着年龄的增长，骨骼肌的逐渐丧失会对机体多种生理功能产生负面影响，包括运动、呼吸、视力、体温调节和代谢稳态^［2-4］。尽管导致衰老相关的肌肉退行性疾病机制较为复杂，但其中最核心的问题可能是肌肉细胞损伤和再生的失衡。

C2C12成肌细胞由小鼠的肌肉卫星细胞（muscle satellite stem cells，MuSCs）激活，能够在体外培养的环境下进行增殖。在含10%血清的培养液中能够自我复制，并且维持干性。在2%马血清的培养条件下，达到一定程度融合度的C2C12成肌细胞开始分化并融合，于3~5 d形成多核肌管细胞，多核肌管细胞的形成是C2C12成肌细胞分化的主要标志之一。C2C12成肌细胞的特点使其成为肌细胞分化研究的经典细胞模型^［5-6］。研究^［5］显示：在C2C12成肌细胞分化过程中线粒体生物合成明显增加，线粒体数量明显高于未分化的成肌细胞，线粒体氧化磷酸化复合体亚基线粒体编码的细胞色素C氧化酶Ⅰ（mitochondrially encoded cytochrome c oxidase Ⅰ，MT-CO1）和泛醌氧化还原酶B8（ubiquinone oxidoreductase subunit B8，NDUFB8）等表达水平明显升高，氧化磷酸化效率明显高于未分化的成肌细胞。研究^［6］显示：利用鱼藤酮和噻吩甲酰三氟丙酮抑制C2C12成肌细胞线粒体氧化磷酸化效率，导致多核肌管细胞形成减少，细胞的融合指数降低，成肌细胞分化标志物肌球蛋白和肌细胞生成素表达减少，从而抑制成肌细胞分化。因此，线粒体氧化磷酸化的效率可能是调控成肌细胞分化的关键机制之一，但仍需进一步深入探索。

鹿茸作为典型的动物药，其在中药领域的应用已有超过2 000年的历史，鹿茸在我国及亚洲其他国家主要被用于增强性功能和延缓衰老^［7］。鹿茸多肽作为鹿茸的主要活性成分，约占鹿茸湿重的60%，含有丰富的蛋白质、氨基酸和磷脂等对机体有利的营养物质^［8］。鹿茸多肽具有抗氧化、抗衰老和免疫调节等多种对人体有益的功能。研究^［7］显示：在强迫游泳实验中，给予鹿茸多肽的小鼠游泳时间明显长于对照组小鼠。以C2C12成肌细胞作为体外细胞模型的研究^［9］显示：鹿茸多肽能够明显上调细胞中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和过氧化氢酶（catalase，CAT）活 性 及 谷 胱 甘 肽（glutathione，GSH）/氧化型GSH（oxidized GSH，GSSG）比值，有效抑制氧化应激对成肌细胞产生的损伤作用。但鹿茸多肽对成肌细胞分化的调控作用尚未完全阐明。因此，本研究通过构建体外C2C12成肌细胞分化模型，探讨线粒体能量代谢效率影响成肌细胞分化的机制，为鹿茸多肽的抗衰老应用提供参考。

1 材料与方法

1.1　细胞、主要试剂和仪器

C2C12成肌细胞（中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库），DMEM培养液（美国Gibco公司），胎牛血清（以色列Biological Industies公司），马血清（江苏科维生物技术有限公司），0.25%胰蛋白酶和磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）（武汉赛维尔生物科技有限公司），细胞计数试剂盒8（cell counting kit-8，CCK-8）检测试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），葡萄糖检测试剂盒和乳酸检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），NDUFB8和琥珀酸脱氢酶复合体黄蛋白亚基A（succinate dehydrogenase complex flavoprotein subunit A，SDHA）一抗（杭州景杰生物科技股份有限公司），MT-CO1一抗（武汉爱博泰克生物科技有限公司），肌球蛋白、肌细胞生成素和β-actin一抗、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记山羊抗兔二抗及HRP标记山羊抗小鼠二抗（武汉三鹰生物技术有限公司）。多功能酶标仪（德国Omega公司），倒置荧光显微镜和倒置光学显微镜（日本Olympus公司），流式细胞仪（美国BD公司），NanoDrop分光光度计（美国Thermo Scientific公司）。

1.2　C2C12成肌细胞分化模型制备和细胞分组

利用生长培养基（growth medium，GM）复苏C2C12成肌细胞，取细胞生长状态良好且细胞融合度达70%~80%的细胞进行传代，以每孔5×10⁵个细胞的密度接种于6孔细胞培养板。铺板后的细胞在GM中增殖培养24 h，细胞融合度达90%时，弃GM并用PBS缓冲液洗涤3次，加入分化培养基（differentiation medium，DM）诱导细胞分化。分化的成肌细胞分为对照组和鹿茸多肽组，鹿茸多肽组加入80 mg·L^-1鹿茸多肽，对照组给予同等体积PBS缓冲液，连续培养7 d，每日更换DM培养液，细胞均于37 ℃、5% CO₂的培养箱中进行培养。GM为含有1%青-链霉素和10%胎牛血清的DMEM培养液，DM为含有1%青-链霉素和2%马血清的DMEM培养液。

1.3　CCK-8法检测各组未分化细胞增殖率

将处于对数生长期的C2C12成肌细胞消化离心，计数后以每孔1×10⁴个细胞的密度接种于96孔细胞培养板中，培养12 h后分别加入0、5、10、20、40、60、80、120、160和200 mg·L^-1鹿茸多肽处理，培养24 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液，将细胞培养孔板置于37 ℃、5% CO₂培养箱中孵育2 h，采用多功能酶标仪于波长450 nm处测定吸光度（A）值，计算细胞增殖率。细胞增殖率=［（药物孔A值-空白孔A值）/（对照孔A值-空白孔A值）］×100%。

1.4　免疫荧光法检测各组细胞融合指数

分别取各组分化后3和5 d的细胞爬片，弃置培养基，1 mL PBS缓冲液清洗3次；加入4%多聚甲醛固定液室温静置15 min；1 mL PBS缓冲液清洗3次；加入0.2% Triton X-100 PBS缓冲液，室温静置60 min，1 mL PBS缓冲液清洗3次；加入500 μL的5% BSA封闭液，室温静置60 min；加入300 μL肌球蛋白一抗，4 ℃过夜；1 mL PBS缓冲液清洗5次，每次5 min；荧光二抗孵育细胞爬片1 h，于避光条件下使用PBS缓冲液对爬片进行清洗，清洗5次，每次5 min；加入200 μL 0.5 mg·L^-1 Hochest染液，室温静置5 min；1 mL PBS缓冲液清洗3次；最后加入抗淬灭荧光封片剂封片，荧光显微镜观察并收集图像，计数总细胞核数和多核肌管细胞核数，计算细胞融合指数。细胞融合指数=（多核肌管细胞的细胞核数/总细胞核数）×100%。

1.5　Western blotting法检测各组细胞中肌球蛋白、肌细胞生成素、NDUFB8、MT-CO1和SDHA蛋白表达水平

将处于对数生长期的细胞消化离心，计数后以每孔5×10⁵个细胞的密度接种于6孔细胞培养板。弃培养液，预冷PBS缓冲液洗涤3次，每孔加入200 μL RIPA裂解液（加入蛋白酶抑制剂），冰上裂解20 min，细胞刮收集样品后超声处理，冰浴静置40 min，14 000 r·min^-1、4 ℃离心10 min，取上清加入上样缓冲液，BCA试剂盒定量后，沸水煮10 min使蛋白充分变性。SDS-PAGE电泳，电泳结束后转膜30 min，取出膜后5%脱脂奶粉于室温条件下置于摇床上封闭1 h，一抗（1∶1 000）过夜，TBST溶液洗膜3次，每次清洗10 min，二抗（1∶5 000）室温孵育2 h，TBST溶液洗膜3次，每次清洗10 min，显影。采用Image J软件分析蛋白条带灰度值，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。

1.6　2'，7'-二氯荧光素二乙酸酯（2'，7'- dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA）荧光探针法检测各组细胞中ROS水平

将处于对数生长期的细胞消化离心，计数后以每孔5×10⁵个细胞的密度接种于6孔细胞培养板。待细胞融合度达到90%，更换分化培养液，分别在细胞分化1、3和5 d时检测细胞中ROS水平。每孔加入配制好的1 mL DCFH-DA（无血清培养液1∶1 000稀释），置于37 ℃、5% CO₂培养箱中避光孵育20 min，吸弃上清液，采用无血清DMEM培养液洗涤细胞3次，采用不含有EDTA的0.25%胰酶消化细胞，1 200 r·min^-1室温离心5 min，弃上清，加入500 μL PBS缓冲液重悬细胞，200目滤网过滤后，采用流式细胞术检测细胞中绿色荧光强度。采用流式细胞仪自带软件分析ROS水平，固定荧光强度阈值，以超过阈值细胞百分率代表ROS水平。

1.7　JC-1试剂盒检测各组细胞线粒体膜电位

将处于对数生长期的细胞消化离心，计数后以每孔5×10⁵个细胞的密度接种于6孔细胞培养板。待细胞融合度达到90%，更换分化培养液，分别在细胞分化1、3和5 d时检测线粒体膜电位。每孔加入1 mL JC-1染色液，置于37 ℃培养箱中避光孵育20 min，孵育期间配制染色缓冲液并置于冰上预冷，孵育结束后，用预冷染色缓冲液清洗2次，用不含有EDTA的0.25%胰酶消化细胞，1 200 r·min^-1室温离心5 min，500 μL PBS缓冲液吹打混匀，200目滤网过滤后，流式细胞仪检测细胞中红色和绿色荧光强度，计算细胞线粒体膜电位。红色荧光强度越强，线粒体膜电位越高；绿色荧光强度越强，线粒体膜电位越低。线粒体膜电位=红色荧光强度/绿色荧光强度。

1.8　采用试剂盒检测各组细胞中ATP水平

将处于对数生长期的细胞消化离心，计数后以每孔5×10⁵个细胞的密度接种于6孔细胞培养板。待细胞融合度达到90%，更换分化培养液，分别在细胞分化1、3和5 d时检测细胞中ATP水平。每孔加入200 μL ATP裂解液裂解细胞，4 ℃、11 000 r·min^-1离心5 min，收集上清液于新EP管中；酶标板中加100 μL ATP检测工作液，室温静置5 min后加2 μL样品，混匀；使用多功能酶标仪中检测绿色荧光强度。以绿色荧光强度代表细胞中ATP水平，绿色荧光越强，ATP水平越高；绿色荧光强度越弱，ATP水平越低。

1.9　采用试剂盒检测各组细胞葡萄糖摄取量

96孔细胞培养板中每孔分别加入2 μL蒸馏水（空白孔）、2 μL标准液（标准孔）和2 μL样品（样品孔），样品包括各组细胞的培养液上清和新鲜培养液。每孔加入200 μL葡萄糖检测液，37 ℃避光孵育10 min，使用多功能酶标仪于波长505 nm处测定A值。葡萄糖水平（mmol·L^-1）=［（样品孔A值-空白孔A值）/（标准孔A值-空白孔A值）］×标准液浓度。葡萄糖摄取量=新鲜培养液葡萄糖水平-培养液上清葡萄糖水平。

1.10　采用试剂盒检测各组细胞培养上清中乳酸水平

96孔细胞培养板每孔分别加入2 μL蒸馏水（空白孔）、2 μL标准液（标准孔）和2 μL细胞培养液上清（样品孔），加入100 μL酶工作液，加入20 μL底物，37 ℃避光孵育10 min，加入200 μL终止液，采用多功能酶标仪于波长530 nm处测定A值。乳酸水平（mmol·L^-1）=［（样品孔A值-空白孔A值）/（标准孔A值-空白孔A值）］×标准液浓度。

1.11　统计学分析

采用GraphPad 8.0统计软件进行统计学分析。各组细胞增殖率、细胞融合指数、细胞中成肌细胞分化标志物蛋白和氧化磷酸化相关蛋白表达水平、细胞中ROS水平、线粒体膜电位、ATP水平、葡萄糖摄取量、培养液上清中乳酸水平均符合正态分布，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　各组未分化C2C12成肌细胞增殖率

与0 mg·L^-1鹿茸多肽处理组比较，60、80、120、160和200 mg·L^-1鹿茸多肽处理组未分化C2C12成肌细胞增殖率均明显升高（P<0.05），5、10、20和40 mg·L^-1鹿茸多肽处理组未分化C2C12成肌细胞增殖率差异均无统计学意义（P>0.05）。见图1。

2.2　各组成肌细胞融合指数

与分化同期对照组（22.11%±2.20%和39.51%±1.81%）比较，分化3和5 d鹿茸多肽处理组成肌细胞融合指数（18.21%±1.38%和31.68%±0.91%）均明显降低（P<0.05），多核肌管细胞数量明显减少。见图2和3。

2.3　各组分化细胞中成肌细胞分化标志物蛋白表达水平

与分化同期对照组比较，分化1、3和5 d鹿茸多肽组细胞中肌球蛋白表达水平均明显降低（P<0.05），分化1 d鹿茸多肽组细胞中肌细胞生成素蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05），分化3和5 d鹿茸多肽组细胞中肌细胞生成素蛋白表达水平均明显降低（P<0.05或P<0.01）。见图4。

2.4　各组分化细胞中NDUFB8、MT-CO1和SDHA蛋白表达水平

与分化同期对照组比较，分化1和3 d鹿茸多肽组细胞中NDUFB8和MT-CO1蛋白表达水平差异均无统计学意义（P>0.05），分化5 d鹿茸多肽组细胞中NDUFB8和MT-CO1蛋白表达水平均明显降低（P<0.05或P<0.01）；分化1、3和5 d鹿茸多肽组细胞中SDHA蛋白表达水平均明显降低（P<0.05或P<0.01）。见图5。

2.5　各组细胞ROS水平

与分化同期对照组（10.50%±1.91%、22.60%±0.11%和23.95%± 1.17%）比较，分化1和3 d鹿茸多肽组细胞ROS水平（16.5%±2.01%和23.48%±1.58%）差异均无统计学意义（P>0.05），分化5 d鹿茸多肽组ROS水平（17.28%± 1.32%）明显降低（P<0.01）。见图6。

2.6　各组分化细胞中线粒体膜电位

与分化同期对照组（0.16±0.02、0.53±0.01和1.66±0.06）比较，分化1 d鹿茸多肽组细胞线粒体膜电位（0.18±0.01）差异无统计学意义（P>0.05），分化3和5 d鹿茸多肽组细胞线粒体膜电位（0.63±0.06和2.13±0.11）均明显升高（P<0.05）。见图7。

2.7　各组细胞葡萄糖摄取量、乳酸水平和ATP水平

与分化同期对照组比较，分化1 d鹿茸多肽组细胞葡萄糖摄取量明显降低（P<0.01），分化3 d鹿茸多肽组细胞葡萄糖摄取量差异无统计学意义（P>0.05），分化5 d鹿茸多肽组细胞葡萄糖摄取量明显升高（P<0.05）；分化1、3和5 d鹿茸多肽组细胞乳酸水平差异均无统计学意义（P>0.05）；分化1和3 d鹿茸多肽组细胞ATP水平均明显升高（P<0.05），分化5 d鹿茸多肽组细胞ATP水平差异无统计学意义（P>0.05）。见图8。

3 讨 论

随着人口老龄化加速，肌少症、心血管疾病和肿瘤等慢性疾病发病率也明显升高^［1，3］。与衰老相关的肌少症是人类最常见的肌肉萎缩类型，研究^［10］显示：线粒体功能障碍导致的能量代谢异常和ROS产生增加是导致衰老相关肌少症发病的主要机制之一。研究^{［8，11-12］}显示：鹿茸多肽具有抗氧化、抗衰老和抗炎等广泛作用。本研究结果显示：与对照组比较，当鹿茸多肽作用浓度>60 mg·L^-1时，能够明显促进C2C12成肌细胞增殖，提示鹿茸多肽能够明显增强C2C12成肌细胞活力。

成熟的骨骼肌细胞是一种由细胞融合形成的合胞体，在成肌细胞分化过程中，最关键的步骤是成肌细胞相互融合，形成多核肌管细胞^［15］，伴随着分化标志物肌球蛋白和肌细胞生成素蛋白表达水平升高^［16］。本研究结果显示：与同期对照组比较，鹿茸多肽处理3和5 d多核肌管细胞数量及细胞融合指数明显降低，提示鹿茸多肽能够抑制C2C12成肌细胞的分化；与同期对照组比较，肌球蛋白和肌细胞生成素蛋白表达水平明显降低，提示鹿茸多肽通过降低C2C12成肌细胞分化标志物的表达抑制C2C12成肌细胞的分化。

既往研究^［17-18］表明：在C2C12成肌细胞分化过程中线粒体生物合成明显增加，线粒体数量明显高于未分化的成肌细胞，氧化磷酸化效率明显大于未分化的成肌细胞。而与年轻肌肉组织比较，衰老肌肉组织中线粒体数量明显减少，氧化磷酸化效率降低，ROS水平升高。细胞内ROS水平是由ROS产生和清除双重因素决定的，ROS作为氧化磷酸化的副产物，其生成量是由氧化磷酸化效率决定的；而细胞主要通过SOD和CAT等抗氧化酶清除ROS^［10］。ROS水平升高被认为是导致细胞衰老或损伤的关键因素之一^［20］。既往研究^{［12，21］}主要通过靶向清除ROS抑制细胞衰老或逆转细胞损伤，但未能从根本上解决线粒体功能异常导致的ROS水平升高。研究^［9］显示：鹿茸多肽主要通过提高细胞内抗氧化酶的表达和活性，降低ROS水平来减缓或者在一定程度上逆转细胞衰老。因此，改善线粒体功能，提高氧化磷酸化效率可能通过促进能量生成和降低ROS生成双向作用减缓细胞衰老或逆转细胞损伤。本研究结果显示：与同期对照组比较，鹿茸多肽能够明显降低C2C12成肌细胞分化过程中ROS的产生，提高线粒体膜电位。线粒体膜电位不仅为线粒体ATP产生所必需的势能，同时也为细胞核DNA编码线粒体蛋白的输入提供势能。膜电位的升高通过促进胞核DNA编码的氧化磷酸化复合体亚基进入线粒体与线粒体DNA编码氧化磷酸化复合体亚基的组装，提高氧化磷酸化效率^［22-23］。ROS水平降低和线粒体膜电位升高提示鹿茸多肽可能通过提高线粒体氧化磷酸化功能抑制C2C12成肌细胞分化。研究^［13-14］显示：糖酵解和氧化磷酸化是细胞利用葡萄糖产生能量的最为关键的2条途径，且氧化磷酸化产生能量的效率显著高于糖酵解。糖酵解途径的终产物是乳酸，由细胞分泌至培养液上清中。本研究结果显示：鹿茸多肽组细胞氧化磷酸化复合体亚基NDUFB8、SDHA和MT-CO1蛋白的表达水平明显低于同期对照组，提示鹿茸多肽处理后C2C12成肌细胞分化过程中氧化磷酸化复合体数量明显减少。本研究中乳酸水平未出现改变，ATP水平升高，提示鹿茸多肽处理后，分化的成肌细胞利用相对较少的氧化磷酸化复合体产生更多的ATP，鹿茸多肽通过提高氧化磷酸化效率，抑制C2C12成肌细胞分化。

综上所述，鹿茸多肽对C2C12成肌细胞分化具有抑制作用，其机制可能与鹿茸多肽降低线粒体氧化磷酸化复合体亚基表达，提高线粒体氧化磷酸化效率有关。

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基金资助

吉林省科技厅医药健康领域项目(20210204014YY)