沉默生物节律基因TIMELESS对卵巢癌SK-OV-3细胞免疫逃逸的抑制作用及其机制

Inhibitory effect of silencing of circadian rhythm gene TIMELESS on immune escape of ovarian cancer SK-OV-3 cells and its mechanism

摘要

目的 探讨沉默生物节律基因TIMELESS（TIM）对卵巢癌细胞免疫逃逸的影响，并阐明其相关作用机制。 方法 分离CD8+T淋巴细胞，并采用流式细胞术进行鉴定，检测细胞中CD3+/CD8+细胞亚群比例。体外培养人卵巢癌SK-OV-3细胞，分别转染TIM小干扰RNA（siRNA）干扰质粒（si-TIM）、阴性对照质粒（si-NC）、程序性死亡配体1（PD-L1）过表达质粒（oe-PD-L1）及其阴性对照质粒（oe-NC），分为空白对照组（BC组，不进行转染）、si-NC组（转染si-NC）、si-TIM组（转染si-TIM）、si-NC+oe-NC组（转染si-NC和oe-NC）和si-TIM+oe-PD-L1（转染si-TIM和oe-PD-L1）组。采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法和Western blotting法检测SK-OV-3细胞中TIM mRNA及蛋白表达水平，验证TIM基因沉默情况。将转染后的SK-OV-3细胞与激活的CD8+T淋巴细胞共培养，分为BC组（单独培养SK-OV-3细胞）、BC/T组、si-NC/T组、si-TIM/T组、si-NC+oe-NC/T组和si-TIM+oe-PD-L1/T组，采用CCK-8法检测各组SK-OV-3细胞存活率，流式细胞术检测各组SK-OV-3细胞凋亡率和细胞表面PD-L1阳性表达率，酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测共培养上清液中干扰素γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平，乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测各组CD8+T淋巴细胞杀伤力，RT-qPCR法检测各组SK-OV-3细胞中TIM和PD-L1 mRNA表达水平，Western blotting法检测各组SK-OV-3细胞中TIM和PD-L1蛋白表达水平。 结果 免疫磁珠法分离后，CD8+T淋巴细胞（CD3+/CD8+）亚群比例为96.56%±0.59%，提示所提取CD8+T淋巴细胞纯度较高。与BC组比较，si-TIM组细胞中TIM mRNA和蛋白表达水平均明显降低（P<0.01），提示本研究成功获得TIM基因沉默的卵巢癌SK-OV-3细胞。CCK-8法，与BC组比较，BC/T组SK-OV-3细胞存活率明显降低（P<0.01）；与BC/T组比较，si-TIM/T组SK-OV-3细胞存活率明显降低（P<0.01）。流式细胞术，与BC组比较，BC/T组SK-OV-3细胞凋亡率明显升高（P<0.01）；与BC/T组比较，si-TIM/T组SK-OV-3细胞凋亡率明显升高（P<0.01）；与si-TIM/T组比较，si-TIM+oe-PD-L1/T组SK-OV-3细胞凋亡率明显降低（P<0.01）。与BC组比较，si-TIM组SK-OV-3细胞表面PD-L1阳性表达率明显降低（P<0.01）。ELISA法，与BC/T组比较，si-TIM/T组细胞培养上清液中IFN-γ和TNF-α水平均明显升高（P<0.01）；与si-TIM/T组比较，si-TIM+oe-PD-L1/T组细胞培养上清液中IFN-γ和TNF-α水平均明显降低（P<0.01）。LDH释放法，与BC/T组比较，si-TIM/T组CD8+T淋巴细胞杀伤力明显增强（P<0.01）；与si-TIM/T组比较，si-TIM+oe-PD-L1/T组CD8+T淋巴细胞杀伤力明显减弱（P<0.01）。RT-qPCR法和Western blotting法，与BC组比较，si-TIM组SK-OV-3细胞中PD-L1 mRNA和蛋白表达水平均明显降低（P<0.01）；与si-TIM组比较，si-TIM+oe-PD-L1组细胞中PD-L1蛋白表达水平明显升高（P<0.01）。 结论 TIM基因沉默可增强CD8+T淋巴细胞对卵巢癌SK-OV-3细胞的杀伤作用，抑制其免疫逃逸，其作用机制可能与调控PD-L1蛋白表达有关。

Abstract

Objective To discuss the effect of circadion rhythm gene TIMELESS （TIM） silencing on immune escape of the ovarian cancer cells， and to clarify its related mechanism. Methods The CD8+T lymphocytes were isolated and identified by flow cytometry to detect the proportion of CD3+/CD8+ cell subsets. The human ovarian cancer SK-OV-3 cells were cultured in vitro and divided into interference plasmid transfected with TIM small interfering （siRNA） （si-TIM）， negative control plasmid （si-NC）， programmed death ligand 1 （PD-L1） over-expression plasmid （oe-PD-L1）， and negative control plasmid （oe-NC） groups. The cells were further divided into blank control group （BC group， non-transfection）， si-NC group （transfected with si-NC）， si-TIM group（transfected with si-TIM）， si-NC+oe-NC group （transfected with si-NC and oe-NC）， and si-TIM+oe-PD-L1 group （transfected with si-TIM and oe-PD-L1）. Real-time fluorescence quantitative PCR（RT-qPCR） and Western blotting methods were used to detect the expression levels of TIM mRNA and protein in the SK-OV-3 cells to verify TIM gene silencing. The transfected SK-OV-3 cells were co-cultured with activated CD8+T lymphocytes and divided into BC group （SK-OV-3 cells cultured alone）， BC/T group， si-NC/T group， si-TIM/T group， si-NC+oe-NC/T group， and si-TIM+oe-PD-L1/T group. CCK-8 method was used to detect the survival rates of the SK-OV-3 cells in various groups； flow cytometry was used to detect the apoptotic rates of the SK-OV-3 cells and positive expression rate of PD-L1 on surface of the cells in various groups； enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） method was used to detect the levels of interferon-γ （IFN-γ） and tumor necrosis factor-α （TNF-α） in the co-culture supernatant； lactate dehydrogenase （LDH） release assay was used to detect the cytotoxicity of the CD8+T lymphocytes in various groups； RT-qPCR method was used to detect the expression levels of TIM and PD-L1 mRNA in the SK-OV-3 cells in various groups； Western blotting method was used to detect the expression levels of TIM and PD-L1 proteins in the SK-OV-3 cells in various groups. Results After scparated with immune magnetic bead method， the proportion of CD8+T lymphocyte （CD3+/CD8+） subsets was （96.56%±0.59%）， indicating high purity of the extracted CD8+T lymphocytes. Compared with BC group， the expression levels of TIM mRNA and protein in the cells in si-TIM group were significantly decreased （P<0.01）， suggesting successful TIM gene silencing in the ovarian cancer SK-OV-3 cells. The CCK-8 results showed that compared with BC group， the survival rate of the SK-OV-3 cells in BC/T group was significantly decreased （P<0.01）； compared with BC/T group， the survival rate of the SK-OV-3 cells in si-TIM/T group was significantly decreased （P<0.01）. The flow cytometry results showed that compared with BC group， the apoptotic rate of the SK-OV-3 cells in BC/T group was significantly increased （P<0.01）； compared with BC/T group， the apoptotic rate of the SK-OV-3 cells in si-TIM/T group was significantly increased （P<0.01）； compared with si-TIM/T group， the apoptotic rate of the SK-OV-3 cells in si-TIM+oe-PD-L1/T group was significantly decreased （P<0.01）. Compared with BC group， the positive expression rate of PD-L1 on surface of the SK-OV-3 cells in si-TIM group was significantly decreased （P<0.01）. The ELISA results showed that compared with BC/T group， the levels of IFN-γ and TNF-α in the culture supernatant in si-TIM/T group were significantly increased （P<0.01）； compared with si-TIM/T group， the levels of IFN-γ and TNF-α in the supernatant in si-TIM+oe-PD-L1/T group were significantly decreased （P<0.01）. The LDH release assay results showed that compared with BC/T group， the cytotoxicity of the CD8+T lymphocytes in si-TIM/T group was significantly increased （P<0.01）； compared with si-TIM/T group， the cytotoxicity of the CD8+T lymphocytes in si-TIM+oe-PD-L1/T group was significantly weakened （P<0.01）. The RT-qPCR and Western blotting results showed that compared with BC group， the expression levels of PD-L1 mRNA and protein in the SK-OV-3 cells in si-TIM group were significantly decreased （P<0.01）； compared with si-TIM group， the expression level of PD-L1 protein in the cells in si-TIM+oe-PD-L1 group was significantly increased （P<0.01）. Conclusion TIM gene silencing enhances the cytotoxic effect of CD8+T lymphocytes on ovarian cancer SK-OV-3 cells and inhibits immune escape， and its mechanism may be related to the regulation of PD-L1 protein expression.

Graphical abstract

关键词

卵巢癌 / 免疫逃逸 / TIMELESS基因 / CD8+T淋巴细胞 / 程序性死亡配体1

Key words

Ovarian cancer / Immune escape / TIMELESS gene / CD8+T lymphocytes / Programmed death ligand 1

卵巢癌是全球女性妇科癌症相关死亡的主要原因之一，由于疾病早期阶段缺乏特定的症状和体征，约75%的卵巢癌患者发展至晚期才被诊断，其中超过70%的患者对初级治疗无效，且5年复发率较高^［1］。晚期诊断和耐药性是导致卵巢癌高发病率及治疗失败的2个主要因素^［2］。目前，在妇科恶性肿瘤领域存在多种乳腺癌和卵巢癌潜在的治疗靶点，靶向治疗具有很好的应用前景^［3］。肿瘤免疫逃逸是肿瘤发生发展的重要环节，肿瘤细胞可以发展多种免疫抑制机制以对抗肿瘤免疫^［4］。程序性死亡配体1（programmed death-ligand 1，PD-L1）/程序性死亡受体1（programmed death receptor-1，PD-1）信号通路是肿瘤免疫抑制的重要组成部分，可以抑制T淋巴细胞活化，增强肿瘤细胞的免疫耐受性，从而实现肿瘤免疫逃逸^［5］。因此，靶向PD-L1/PD-1信号通路是一种具有较强吸引力的肿瘤治疗策略。生物节律分子TIMELESS（TIM）最初被认为是一种潜在的生物钟蛋白，现已被证实其为DNA复制叉的重要组成之一，可以保护DNA复制叉不在难以复制的区域停滞，并在DNA损伤中发挥重要保护和修复作用^［6］。TIM基因还可作为一种癌基因，在多种癌症中呈过度表达，使肿瘤细胞免受DNA损伤和化疗耐药性^［7］。研究^［8］显示：TIM基因缺失可激活结肠癌细胞的上皮-间质转化程序，并与结肠癌患者预后差有关。研究^［9-10］显示：TIM蛋白在人卵巢癌组织中高表达，沉默TIM基因可抑制卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭。研究^［11］显示：TIM蛋白高表达可增强PD-L1的转录水平，从而促进乳腺癌的侵袭性和恶性进展，有助于肿瘤免疫逃逸，而当其表达下调时，会增加CD8+T淋巴细胞的抗肿瘤活性。然而，TIM基因是否通过调节PD-L1影响卵巢癌细胞免疫逃逸尚不明确。因此，本研究探讨TIM基因沉默对卵巢癌细胞免疫逃逸的影响，并阐明其分子机制，以期为卵巢癌治疗策略的研究提供新思路。

1 材料与方法

1.1　细胞、主要试剂和仪器

人卵巢癌细胞系SK-OV-3细胞购自美国模式培养物研究所（American type culture collection，ATCC）。RPMI-1640培养基和人白细胞介素2（interleukin-2，IL-2）重组蛋白购自赛百慷（上海）生物技术股份有限公司，Dynabeads^TM Untouched™人CD8+T淋巴细胞试剂盒、Lipofectamine 3000转染试剂、CD8-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）、CD3-藻红蛋白（phycoerythrin，PE）和PD-L1-PE抗体购自美国ThermoFisher Scientific公司，T Cell TransAct购自德国Miltenyi公司，CCK-8试剂盒和AnnexinⅤ/FITC凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，干扰素γ（interferon-γ，INF-γ）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）检测试剂盒购自武汉云克隆科技股份有限公司，乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）细胞毒性检测试剂盒、TRIzol试剂和RIPA裂解液购自上海碧云天生物技术股份有限公司，逆转录试剂盒和SYBR Green Master Mix购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，兔抗人PD-L1抗体、兔抗人TIM抗体、兔抗人GAPDH抗体和二抗购自英国Abcam公司，TIM小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）干扰质粒（si-TIM）、阴性对照质粒（si-NC）、PD-L1过表达质粒（oe-PD-L1）及其阴性对照质粒（oe-NC）由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。流式细胞仪购自美国Beckman公司，酶标仪购自美国Bio Tek公司，实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR， RT-qPCR）仪购自瑞士Roche公司，电泳仪和电泳槽购自北京六一生物科技有限公司。

1.2　CD8+T淋巴细胞分离及鉴定

收集健康体检者外周血，梯度离心获得人外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。根据Dynabeads™ Untouched™人CD8+T淋巴细胞试剂盒说明书，采用免疫磁珠法分离，即取500 µL（约含5×10⁷个细胞）PBMC，加入100 µL抗体混合物，于4 ℃孵育20 min；加入磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤细胞，离心弃上清液；加入500 µL免疫磁珠，轻轻倾斜和旋转，室温反应15 min；加入2 mL PBS缓冲液，将细胞放置于磁力架上静置2 min，收集上清液。向磁珠中加入2 mL PBS缓冲液，经磁力架吸附后，再次收集上清液，将2次收集的上清液混合，1 200 r·min^-1离心5 min，收集细胞沉淀即为CD8+T淋巴细胞。采用流式细胞术对CD8+T淋巴细胞进行鉴定，检测细胞中CD3+/CD8+细胞亚群比例。

1.3　细胞转染、分组和共培养

收集SK-OV-3细胞接种于6孔细胞培养板中，每孔约含2×10⁵个细胞，将SK-OV-3细胞分为空白对照组（BC组）、si-NC 组、 si-TIM 组、 si-NC + oe-NC 组 和si-TIM+oe-PD-L1组，采用Lipofectamine 3000转染试剂分别将si-TIM、si-NC、oe-PD-L1和oe-NC分别转染至除BC组外的相应组SK-OV-3细胞中，BC组不进行转染，转染48 h后收集细胞。采用RT-qPCR法和Western blotting法检测SK-OV-3细胞中TIM mRNA及蛋白表达水平，验证卵巢癌SK-OV-3细胞中TIM基因沉默情况。于CD8+T淋巴细胞培养基中补充20 μg·L^-1 IL-2重组蛋白，采用T Cell TransAct试剂刺激CD8+T淋巴细胞活化。取转染后的各组SK-OV-3细胞与活化的CD8+T淋巴细胞按照1∶10的比例于Transwell小室中进行间接共培养，并将其分为BC组（单独培养SK-OV-3细胞）、BC/T组、si-NC/T组、si-TIM/T组、si-NC+oe-NC/T组和si-TIM+oe-PD-L1/T组，共培养时间为24 h。

1.4　CCK-8法检测各组SK-OV-3细胞存活率

于96孔细胞培养板下室中以每孔1×10³个细胞的密度接种SK-OV-3细胞，建立上述共培养体系，共培养24 h后，取出CD8+T淋巴细胞，于含有SK-OV-3细胞的孔内加入10 µL CCK-8溶液，继续培养2 h。采用酶标仪于波长450 nm处测定吸光度（A）值，计算各组细胞存活率。细胞存活率=（实验孔A值-空白孔A值）/（对照孔A值-空白孔A值）×100%。

1.5　流式细胞术检测各组SK-OV-3细胞凋亡率

收集共培养体系中的SK-OV-3细胞，1 000 r·min^-1离心5 min，弃上清，加入结合缓冲液调整细胞浓度为2×10⁶ mL^-1。取100 µL细胞悬液，加入5 µL AnnexinⅤ/FITC和5 µL PI溶液孵育5 min。加入400 µL PBS缓冲液，混匀后于流式细胞仪上检测细胞凋亡率。细胞凋亡率=早期细胞凋亡率+晚期细胞凋亡率。

1.6　流式细胞术检测各组SK-OV-3细胞表面PD-L1阳性表达率

收集共培养体系中的SK-OV-3细胞，1 000 r·min^-1离心5 min，弃上清，加入PBS缓冲液重悬细胞沉淀，并调整细胞密度为2×10⁶ mL^-1。加入5 µL PD-L1-PE抗体室温避光孵育30 min。PBS缓冲液洗涤细胞，加入400 µL PBS缓冲液重悬后于流式细胞仪上检测PD-L1阳性表达率。

1.7　酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法检测各组共培养体系细胞培养上清液中IFN-γ和TNF-α水平

收集共培养体系中细胞培养上清液，按照ELISA试剂盒说明书加入标准品、样本和检测液等进行反应，加入底物溶液进行显色，最后加入终止液终止反应。采用酶标仪于波长450 nm处测定A值，根据标准曲线计算共培养体系细胞培养上清液中IFN-γ和TNF-α水平。

1.8　LDH释放法检测各组CD8+T淋巴细胞杀伤力

以SK-OV-3细胞为靶细胞，CD8+T淋巴细胞为效应细胞，将其分为靶细胞自然释放组（100 µL SK-OV-3细胞悬液+100 µL细胞培养液）、效应细胞自然释放组（100 µL CD8+T淋巴细胞悬液+ 100 µL细胞培养液）、自然杀伤组（100 µL CD8+T淋巴细胞悬液+100 µL SK-OV-3细胞悬液，即上述共培养体系）和靶细胞最大释放组（100 µL SK-OV-3细胞悬液+10 µL LDH释放试剂+90 µL细胞培养液）。37 ℃孵育1 h后，离心收集120 µL细胞培养上清液，加入60 µL LDH检测液，室温避光孵育30 min。采用酶标仪于波长490 nm处测定A值，计算CD8+T淋巴细胞杀伤力。CD8+ T淋巴细胞杀伤力=（自然杀伤组A值-靶细胞自然释放组A值-效应细胞自然释放组A值）/（靶细胞最大释放组A值-靶细胞自然释放组A值）×100%。

1.9　RT-qPCR法检测各组SK-OV-3细胞中TIM和PD-L1 mRNA表达水平

收集BC组、si-NC组和si-TIM组SK-OV-3细胞，加入TRIzol试剂进行裂解并提取细胞总RNA。使用逆转录试剂盒获取cDNA，以cDNA为模板，采用SYBR Green Master Mix配置PCR反应体系，反应程序：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共40个循环。引物序列：TIM上游引物5'-GTTTTGGCAATCTGCCTAAGGA-3'，TIM下游引物5'-GCAGCTCATACAAGGTTT-CACT-3'；PD-L1上游引物5'-TTTGCTGAACG-CCCCATA-3'，PD-L1下游引物5'-TGCTTGTC-CAGATGACTTCG-3'；GAPDH上游引物5'-AC-AACTTTGGTATCGTGGAAGG-3'，GAPDH下游引物5'-GCCATCACGCCACAGTTTC-3'。以GAPDH为内参基因，采用2^—△△Ct法计算细胞中TIM和PD-L1 mRNA表达水平。

1.10　Western blotting法检测各组SK-OV-3细胞中TIM和PD-L1蛋白表达水平

收集各组转染后的SK-OV-3细胞，加入RIPA裂解液提取蛋白质。蛋白质浓度定量后，经SDS-PAGE电泳分离，将蛋白转移至PVDF膜上。使用含5%脱脂奶粉封闭液浸泡PVDF膜，室温封闭2 h。加入TIM抗体（1∶10 000）、PD-L1抗体（1∶1 000）和GAPDH抗体（1∶2 500）浸泡PVDF膜，4 ℃孵育过夜。加入二抗室温孵育1 h，最后加入化学发光试剂进行显影曝光。采用Image J软件分析蛋白条带灰度值，以GAPDH为内参，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。

1.11　统计学分析

采用SPSS 23.0统计软件进行统计学分析。各组SK-OV-3细胞存活率和细胞凋亡率，细胞表面PD-L1阳性表达率，共培养体系细胞培养上清液中IFN-γ和TNF-α水平及CD8+T淋巴细胞杀伤力，细胞中TIM和PD-L1mRNA及蛋白表达水平，均符合正态分布，以x\pm s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　人外周血CD8+T淋巴细胞鉴定

免疫磁珠法分离前，人外周血中CD8+T淋巴细胞（CD3+/CD8+）亚群比例为24.43%±2.76%；免疫磁珠法分离后，CD8+T淋巴细胞（CD3+/CD8+）亚群比例为96.56%±0.59%，提示所提取CD8+T淋巴细胞的纯度较高。见图1。

2.2　各组SK-OV-3细胞中TIM mRNA和蛋白表达水平

与BC组（1.00±0.08）比较，si-NC组细胞中TIM mRNA（0.97±0.05）和蛋白表达水平差异均无统计学意义（P>0.05），si-TIM组细胞中TIM mRNA（0.26±0.08）和蛋白表达水平均明显降低（P<0.01），提示本研究成功获得TIM基因沉默的卵巢癌SK-OV-3细胞。见图2。

2.3　各组SK-OV-3细胞存活率

与BC组（100.00%±10.44%）比较，BC/T组SK-OV-3细胞存活率（79.69%±3.23%）明显降低 （P<0.01）；与BC/T组比较，si-NC/T组SK-OV-3细胞存活率（80.17%±5.47%）差异无统计学意义（P>0.05），si-TIM/T组SK-OV-3细胞存活率（47.94%±3.94%）明显降低（P<0.01）。

与BC/T组（100.00%±5.46%）比较，si-NC+oe-NC/T组SK-OV-3细胞存活率（98.38%± 2.92%）差异无统计学意义（P>0.05），si-TIM/T组SK-OV-3细胞存活率（61.13%±4.44%）明显降低（P<0.01）；与si-TIM/T组比较，si-TIM+oe-PD-L1/T组SK-OV-3细胞存活率（87.52%± 4.16%）明显升高（P<0.01）。

2.4　各组SK-OV-3细胞凋亡率

与BC组（4.41%±0.57%）比较，BC/T组SK-OV-3细胞凋亡率（15.29%±1.03%）明显升高（P<0.01）；与BC/T组比较，si-NC/T组SK-OV-3细胞凋亡率（15.77%±0.94%）差异无统计学意义（P>0.05），si-TIM/T组SK-OV-3细胞凋亡率（24.71%±1.51%） 明显升高（P<0.01）。见图3。

与BC/T组（15.47%±0.84%）比较， si-NC+ oe-NC/T组SK-OV-3细胞凋亡率（14.93%± 1.04%）差异无统计学意义（P>0.05），si-TIM/T组SK-OV-3细胞凋亡率（25.73%±1.41%）明显升高（P<0.01）；与si-TIM/T组比较，si-TIM+ oe-PD-L1/T组SK-OV-3细胞凋亡率（17.43%± 0.92%）明显降低（P<0.01）。见图4。

2.5　各组SK-OV-3细胞表面PD-L1蛋白阳性表达率

与BC组（44.10%±1.79%）比较，si-NC组SK-OV-3细胞表面PD-L1蛋白阳性表达率（43.08%±2.15%）差异无统计学意义（P>0.05），si-TIM组SK-OV-3细胞表面PD-L1蛋白阳性表达率（21.16%±2.45%）明显降低（P<0.01）。见图5。

2.6　各组共培养体系细胞上清液中IFN-γ和TNF-α水平

与BC/T组比较，si-NC/T组细胞培养上清液中IFN-γ和TNF-α水平差异无统计学意义（P>0.05），si-TIM/T组细胞上清液中IFN-γ和TNF-α水平明显升高（P<0.01）。见表1。

与BC/T组比较，si-NC+oe-NC/T组细胞培养上清液中IFN-γ和TNF-α水平差异无统计学意义（P>0.05），si-TIM/T组细胞培养上清液中IFN-γ和TNF-α水平明显升高（P<0.01）。与si-TIM/T组比较，si-TIM+oe-PD-L1/T组细胞培养上清液中IFN-γ和TNF-α水平明显降低（P<0.01）。见表2。

2.7　各组CD8+T淋巴细胞杀伤力

与BC/T组（13.97%±1.19%）比较，si-NC/T组CD8+T淋巴细胞杀伤力（14.19%±2.34%）差异无统计学意义（P>0.05），si-TIM/T组CD8+T淋巴细胞杀伤力 （22.67%±1.49%） 明显增强 （P<0.01）。

与 BC/T 组 （14.27% ± 1.94%） 比 较，si-NC+oe-NC/T组CD8+T淋巴细胞杀伤力（14.14%±0.87%）差异无统计学意义（P>0.05），si-TIM/T组CD8+T淋巴细胞杀伤力（23.72% ± 1.00%） 明 显 增 强（P<0.01）；与 si-TIM/T 组 比 较， si-TIM+oe-PD-L1/T 组CD8+T淋巴细胞杀伤力（18.32%±1.37%）明显减弱（P<0.01）。

2.8　各组SK-OV-3细胞中PD-L1 mRNA和蛋白表达水平

与BC组（1.01±0.13）比较，si-NC组SK-OV-3细胞中PD-L1 mRNA（1.04±0.08）和蛋白表达水平差异均无统计学意义（P>0.05），si-TIM组SK-OV-3细胞中PD-L1 mRNA（0.56±0.09）和蛋白表达水平均明显降低（P<0.01）。见图6。

与BC组比较，si-NC+oe-NC组SK-OV-3细胞中PD-L1蛋白表达水平差异无统计学意义（P>

0.05），si-TIM组细胞中PD-L1蛋白表达水平明显降低（P<0.01）；与si-TIM组比较，si-TIM+ oe-PD-L1组细胞中PD-L1蛋白表达水平明显升高（P<0.01）。见图7。

3 讨 论

肿瘤免疫逃逸已成为肿瘤治疗的最大障碍之一，深入了解肿瘤免疫逃逸机制是进一步完善临床治疗策略的关键^［12］。T淋巴细胞是适应性免疫系统的基础，然而由幼稚T淋巴细胞分化为功能性效应CD8+T淋巴细胞需要通过主要组织相容性复合物分子、共刺激和细胞因子呈递的抗原结合T淋巴细胞受体信号才能有效启动。研究^［13］显示：在细胞因子刺激后，T淋巴细胞与肿瘤细胞的相互作用更强。IL-2等细胞因子可增强T淋巴细胞肿瘤免疫能力^［14］。CD8+T淋巴细胞是肿瘤免疫的最终效应物，大部分形式的有效肿瘤免疫疗法均涉及CD8+T淋巴细胞的效应功能^［14-15］。研究^［16-18］显示：促进CD8+T淋巴细胞对癌细胞的杀伤作用有助于抑制肿瘤免疫逃逸。本研究结果显示：SK-OV-3细胞存活率降低，细胞凋亡率升高，提示活化的CD8+T淋巴细胞具有明显的抗肿瘤作用。若进一步增强CD8+T淋巴细胞的杀伤作用，将可能发挥更强大的肿瘤免疫功能。

昼夜节律是影响真核生物和原核生物生理的一个基本生物学过程，昼夜节律紊乱可能增加患肿瘤风险，并影响癌症患者对治疗的反应^［19］。生物节律基因表达失调在恶性肿瘤的发生发展中起重要作用^［20］。TIM基因因其参与生物节律和细胞周期而被广泛研究，该基因与多种恶性肿瘤的发展及预后存在关联，可能是泛癌患者的前瞻性预后和免疫生物标志物^［21］。研究^［22］显示：TIM基因在宫颈癌中高表达，调节细胞增殖和顺铂敏感性，敲除TIM基因可诱导细胞凋亡和细胞衰老。但关于TIM基因表达与肿瘤免疫逃逸之间关系的研究较少。DONG等^［11］研究发现：癌细胞中的TIM基因可通过抑制CD8+T淋巴细胞浸润和免疫活性参与免疫抑制。肿瘤微环境中的CD8+T淋巴细胞被激活后分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等细胞因子，并在肿瘤微环境中传播，参与肿瘤免疫反应^［23］。本研究结果显示：SK-OV-3细胞中TIM基因沉默后，与之共培养的CD8+T淋巴细胞分泌的IFN-γ和TNF-α水平升高，且CD8+T淋巴细胞对SK-OV-3细胞杀伤力也明显增强。TIM基因沉默后进一步抑制SK-OV-3细胞增殖，促进细胞凋亡，提示沉默TIM基因可抑制卵巢癌细胞免疫逃逸，但具体机制还需进一步明确。

PD-L1是一个被广泛研究的免疫检查点，通过抑制CD8+T淋巴细胞的免疫活性，在促进恶性肿瘤的免疫逃逸中发挥重要作用^［24-25］。PD-1主要由CD4+和CD8+T淋巴细胞表达，其配体PD-L1广泛表达于各种细胞，包括肿瘤细胞。阻断PD-L1/PD-1信号通路可能有助于恢复T淋巴细胞介导的抗肿瘤免疫，因此，PD-L1/PD-1可能是卵巢癌的重要治疗靶点^［26］。然而，目前针对PD-L1/PD-1信号通路的抗体并未表现出较好的临床疗效，其有效率仅为10%~15%^［27］。与单一治疗比较，免疫检查点抑制剂与小分子抑制剂的联合治疗显示出更好的疗效^［28］。研究^［29］显示：沉默卵巢癌细胞中PD-L1基因的表达后，肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显减弱。而高表达TIM基因会增强肿瘤细胞中PD-L1基因表达水平^［11］。本研究结果显示：沉默TIM基因后卵巢癌SK-OV-3细胞中PD-L1基因表达下调，SK-OV-3细胞中PD-L1基因过表达会部分抑制TIM基因沉默对CD8+T淋巴细胞杀伤力及细胞因子分泌的促进作用，同时也逆转了TIM基因沉默对SK-OV-3细胞增殖和凋亡的影响，提示TIM基因沉默可能通过下调PD-L1基因表达抑制SK-OV-3细胞免疫逃逸。

综上所述，TIM基因沉默可通过调节PD-L1基因表达抑制卵巢癌细胞免疫逃逸，从而抑制细胞增殖，并诱导细胞凋亡。

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基金资助

江苏省卫健委省妇幼保健科研项目(F202207)