赤芍活性成分联合应用对粪肠球菌的抑制作用及其机制

Inhibitory effect of combined application of active components of Paeoniae Rubra Radix on Enterococcus faecalis and its mechanism

摘要

目的 探讨赤芍活性成分芍药苷（PF）、原花青素（PC）和绿原酸（CA），联合应用对粪肠球菌（E.faecalis）及生物膜的抑制作用，并阐明其作用机制。 方法 采用微量稀释法检测CA、PC和PF对E.faecalis的最小抑菌浓度（MIC）及最小杀菌浓度（MBC），棋盘稀释法检测赤芍3种活性成分联合应用部分抑菌浓度指数（FICI）和部分杀菌浓度指数（FBCI）。实验分为对照组、高浓度单药组（PF-10组、PC-6组和CA-10组）及药物联合应用组（CA-2+PC-1组、CA-2+PC-2组、PF-4+PC-2组、PF-6+PC-2组、PF-4+CA-4组和PF-6+CA-4组）。结晶紫染色检测3种活性成分联合应用各组E.faecalis生物膜形成情况，扫描电镜（SEM）观察赤芍3种活性成分联合应用各组E.faecalis生物膜形态表现，点板试验检测赤芍3种活性成分联合应用对各组E.faecalis浮游菌和生物膜的抑制作用，SEM观察赤芍3种活性成分联合应用各组E.faecalis胞膜损伤情况，试剂盒检测赤芍3种活性成分联合应用各组E.faecalis浮游菌和生物膜中腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）水平。 结果 赤芍3种活性成分中PC的MIC为4 g·L^-1，MBC为6 g·L^-1；CA的MIC为8 g·L^－1，MBC为10 g·L^-1；PF的MIC和MBC均>10 g·L^-1，选取PF浓度为10 g·L^-1。PC与CA联合应用具有协同作用，PC与PF联合应用具有相加作用，CA与PF联合应用具有相加作用。结晶紫染色，与对照组比较，PF-10组、PC-6组、CA-10组和各药物联合应用组E.faecalis生物膜形成量均明显降低（P<0.01）；与PF-10组比较，PC-6组、CA-10组、CA-2+PC-1组、CA-2+PC-2组、PF-4+PC-2组、PF-6+PC-2组和PF-6+CA-4组E.faecalis生物膜形成量均明显降低（P<0.05或P<0.01）。扫描电镜观察，对照组E.faecalis生物膜较厚，细菌之间紧密连接，形态规则，且细胞膜完整；PF-10组、PC-6组和CA-10组E.faecalis生物膜厚度明显降低，细菌间的排列变得相对疏松；各药物联合应用组可见E.faecalis生物膜均明显减少乃至完全消失，高倍镜下可见生物膜结构完全消失，细菌碎片相互黏附聚集，失去原有的细菌形态。点板试验，与对照组比较，作用5、10和30 min后PF-10组、PC-6组及CA-10组E.faecalis浮游菌菌落明显减少，提示其对E.faecalis的杀伤作用逐渐增强；各药物联合应用组中，PC与CA联合应用在5 min内可见E.faecalis浮游菌菌落明显减少，对E.faecalis浮游菌菌落的杀伤作用较强。与PC组和CA组比较，作用5、10和30 min后各药物联合应用组E.faecalis浮游菌菌落未见明显减少；与对照组比较，作用30和60 min后PF-10组、PC-6组及CA-10组E.faecalis生物膜菌落逐渐减少，提示高浓度单药组对E.faecalis生物膜中细菌表现出逐渐增强的杀伤作用。其中PC-6组生物膜杀伤效果最为明显，在处理30 min后未见菌落形成；在各药物联合应用组中，作用30 min后CA-2+PC-2组E.faecalis生物膜仅见少许菌落，提示其可有效杀伤生物膜中的细菌；与PC-6组和CA-10组比较，各药物联合应用组在低浓度即可达到高浓度单药组的杀伤效果。扫描电镜观察，对照组E.faecalis呈椭圆形，且细胞膜完整；PF组E.faecalis形态改变，细胞膜完整性受损；CA组大部分E.faecalis细胞膜相对完整，但E.faecalis表面出现皱缩和凹陷现象，少数E.faecalis细胞膜完整性遭到破坏；PC组E.faecalis细胞膜的完整性破坏最为严重，导致内容物外泄，细胞碎片相互聚集形成絮状结构；各药物联合应用组E.faecalis细胞膜破裂、内容物外泄和细菌残片聚集，尤其是PC与CA联合应用时，可观察到E.faecalis细胞膜的完整性破坏最为明显，内容物完全外泄；PF与CA联合应用时，可观察到细菌表面凹坑和皱缩，偶见细胞膜破裂。试剂盒检测，与对照组比较，各组E.faecalis浮游菌及生物膜中ATP水平均明显降低（P<0.01）；与PF-10组比较，CA-10组、CA-2+PC-2组、PF-4+CA-4组和PF-6+CA-4组E.faecalis浮游菌中ATP水平均明显降低（P<0.05或P<0.01），CA-10组和CA-2+PC-2组E.faecalis生物膜中ATP水平均明显降低（P<0.05或P<0.01）。 结论 赤芍活性成分PF、PC和CA联合应用对E.faecalis及生物膜形成具有明显抑制作用，3种活性成分两两联合应用均有一定的协同或相加作用，其中PC与CA联合应用协同作用最为明显，作用机制可能与破坏E.faecalis胞膜完整性和抑制细菌中ATP水平有关。

Abstract

Objective To discuss the inhibitory effects of combined application of chlorogenic acid （CA）， procyanidin （PC）， and paeoniflorin （PF）， the active components of Paeoniae Radix Rubra， on Enterococcus faecalis （E.faecalis） and its biofilm， and to clarify the mechanism. Methods The minimal inhibitory concentration （MIC） and minimal bactericidal concentration （MBC） of CA， PC， and PF against E.faecalis were detected by microdilution method； the fractional inhibitory concentration index （FICI） and fractional bactericidal concentration index （FBCI） of the three active components of Paeoniae Radix Rubra in combination were detected by checkerboard dilution method. The experiment was divided into control group， high concentration of single-drug groups （PF-10 group， PC-6 group， and CA-10 group）， and drug combination groups （CA-2+PC-1 group， CA-2+PC-2 group， PF-4+PC-2 group， PF-6+PC-2 group， PF-4+CA-4 group， and PF-6+CA-4 group）. Crystal violet staining was used to detect the biofilm formation of E.faecalis in various groups after treated with three active components in combination； scanning electron microscope （SEM） was used to observe the morphology of E.faecalis biofilm in various groups after treated with three active components in combination； spot assay was used to detect the inhibitory effects of three active components in combination on E.faecalis planktonic bacteria and biofilm in various groups； SEM was used to observe the damage to E.faecalis cell membrane in various groups after treated with three active components in combination； kit was used to detect the adenosine triphosphate （ATP） levels in E.faecalis planktonic bacteria and biofilm in various groups after treated with three active components in combination. Results Among the three active components of Paeoniae Radix Rubra, the MIC of PC was 4 g·L⁻¹ and the MBC was 6 g·L⁻¹； the MIC of CA was 8 g·L⁻¹ and the MBC was 10 g·L⁻¹； the MIC and MBC of PF were both >10 g·L⁻¹, and the concentration of PF was selected as 10 g·L⁻¹. The combination of PC and CA showed synergistic effects, the combination of PC and PF showed additive effects, and the combination of CA and PF showed additive effects. The crystal violet staining results showed that compared with control group, the biofilm formations of E.faecalis in PF-10 group, PC-6 group, CA-10 group, and drug combination groups were significantly decreased （P<0.05）； compared with PF-10 group, the biofilm formations of E.faecalis in PC-6 group， CA-10 group， CA-2+PC-1 group， CA-2+PC-2 group， PF-4+PC-2 group， PF-6+PC-2 group， and PF-6+CA-4 group were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）. The SEM results showed that in control group, the E.faecalis biofilm was thick, with tightly connected bacteria, regular morphology, and intact cell membranes; in PF-10 group, PC-6 group, and CA-10 group, the thickness of E.faecalis biofilm was significantly reduced, and the arrangement of bacteria became relatively loose; in all drug combination groups, the E.faecalis biofilm was significantly reduced or even completely disappeared, and under high magnification, the biofilm structure was completely absent, with bacterial fragments adhering and aggregating, losing their original bacterial morphology. The spot assay results showed that compared with control group, the colonies of E.faecalis planktonic bacteria in PF-10 group, PC-6 group, and CA-10 group were significantly reduced after treated for 5, 10, and 30 min, indicating gradually enhanced bactericidal effects; among drug combination groups, the combination of CA and PC significantly reduced the colonies of E.faecalis planktonic bacteria within 5 min, showing strong bactericidal effects. Compared with CA group and PC group, the colonies of E.faecalis planktonic bacteria in all drug combination groups showed no significant reduction after treated for 5, 10, and 30 min； compared with control group, the colonies of E.faecalis biofilm in PF-10 group, PC-6 group, and CA-10 group were gradually decreased after the treated for 30 and 60 min, suggesting that the high concentration of single-drug groups exhibited gradually enhanced bactericidal effects on E.faecalis in biofilm. Among them, the biofilm-killing effect of PC-6 group was the most significant, with no colony formation observed after treated for 30 min； in drug combination groups, only a few colonies of E.faecalis biofilm were observed in CA-2+PC-2 group after treated for 30 min, indicating effective killing of bacteria in biofilm; compared with PC-6 group and CA-10 group, all drug combination groups achieved the bactericidal effects of high concentration of single-drug groups at low concentrations. The SEM results showed that in control group, E.faecalis exhibited an oval shape with intact cell membranes; in PF group, bacterial morphology was altered, and cell membrane integrity was damaged； in CA group, most bacterial cell membranes remained relatively intact, but the bacterial surface showed shrinkage and depression, with a few bacteria exhibiting disrupted cell membrane integrity； in PC group, the integrity of bacterial cell membranes was most severely damaged, leading to leakage of cellular contents and aggregation of cell fragments into flocculent structures; in all drug combination groups, E.faecalis exhibited ruptured cell membranes, leakage of contents, and aggregation of bacterial debris, especially in the combination of CA and PC, where the most severe disruption of bacterial cell membrane integrity and complete leakage of contents were observed; in the combination of PF and CA, bacterial surface pits and shrinkage were observed, with occasional cell membrane rupture. The kit results showed that compared with control group, the ATP levels in E.faecalis planktonic bacteria and biofilm in various groups were significantly decreased （P<0.01）； compared with PF-10 group, the ATP levels in E.faecalis planktonic bacteria in CA-10 group, CA-2+PC-2 group， PF-4+CA-4 group, and PF-6+CA-4 group were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）， and the ATP levels in E.faecalis biofilm in CA-10 group and CA-2+PC-2 group were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）. Conclusion The combined application of PF， PC， and CA， the active components of Paeoniae Radix Rubra， exhibits significant inhibitory effects on E.faecalis and its biofilm formation. The pairwise combinations of three active components show synergistic or additive effects， with the combination of CA and PC demonstrating the most significant synergistic effect. The underlying mechanism may be related to the disruption of E.faecalis cell membrane integrity and inhibition of bacterial ATP levels.

Graphical abstract

关键词

赤芍活性成分 / 粪肠球菌 / 绿原酸 / 原花青素 / 芍药苷

Key words

Active components of Paeoniae Radix Rubra / Enterococcus faecalis / Chlorogenic acid / Procyanidin / Paeoniflorin

牙髓炎和根尖周炎是与根管内病原微生物感染密切相关的炎症性疾病。目前临床上主要治疗方法是根管治疗，而根管治疗的成功率约为80%^［1］。在引发根尖持续感染的细菌中，粪肠球菌（Enterococcus faecalis，E.faecalis）是主要代表菌，E.faecalis是一种革兰阳性兼性厌氧菌，该菌对根管常用消毒药物具有高耐药性，并且可耐高温、干燥和饥饿及强碱性环境，在根管再治疗病例中检出率高达90%^［2-3］。E.faecalis以生物膜形式存在，能够产生多种毒力因子，如表面黏附素和明胶酶，相关因子促进细菌的黏附、定植、生物膜形成和组织损伤^［4-5］。多数抗生素难以有效阻止和根除其生物膜形成^［6］。因此，从根管系统中消除E.faecalis并探索新型抗E.faecalis药物对于提高根管治疗的成功率至关重要。

次氯酸钠（sodium hypochlorite，NaOCl）是根管治疗中的常用冲洗剂，但高浓度NaOCl可能损害牙根尖周组织，导致炎症和疼痛，并侵蚀牙本质，降低牙齿机械性能^［7］。氯己定（chlorhexidine，CHX）具有广谱杀菌活性，但无法溶解牙髓组织，可能引起牙齿变色和过敏等不良反应^［8］。因此，研究安全有效的抗菌药物是口腔医学的重要任务。目前，25%的现代药物来源于植物，相关药材活性成分被视为合成药物更安全和更健康的替代品。赤芍作为吉林的道地药材，具备良好的抗菌潜能。研究^［9-11］显示：赤芍对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和牙龈卟啉单胞菌等均具有抑制作用。赤芍活性成分包括芍药苷（paeoniflorin，PF）、原花青素（proanthocyanidins，PC）和绿原酸（chlorogenic acid，CA）。其中PF对多种病原微生物表现出明显的抑制作用，尤其针对大肠杆菌和白色念珠菌等具有明显效果^［12］。CA是一种活性多酚，具有强大的杀菌能力和龋齿细菌及抗牙周炎致病菌的功效^［13］。PC具有广泛的抗菌性能，不仅对龋齿细菌具有显著的抑制作用，且对病毒同样有效^［14-15］。YANG等^［16］发现：PC能够杀死生物膜内的E.faecalis，并增强牙本质胶原基质的生物稳定性，但其具体作用机制尚未完全阐明。并且PF、PC和CA联合应用是否对E.faecalis具有协同抑菌效果国内外尚未见报道。因此，本研究探讨赤芍活性成分PF、PC和CA两两联合应用对E.faecalis浮游菌及生物膜的协同抑菌作用，并阐明其作用机制，为开发更有效的化学冲洗剂提供科学依据。

1 材料与方法

1.1　细菌、药物、主要试剂和仪器

E.faecalis ATCC29212（中国科学院）。CA、PC和PF（上海麦克林生化科技有限公司）。脑心浸液肉汤（brain-heart infusion broth，BHI）和琼脂粉（青岛海博生物技术有限公司），含1%蔗糖脑心浸出液培养基（brain-heart infusion broth with 1% sucrose，BHIS），结晶紫（北京索莱宝科技有限公司），BacTiter-Lumi^TM发光法微生物细胞活力检测试剂盒（BTL试剂盒，上海碧云天生物技术股份有限公司），其他试剂均购自上海麦克林生化科技有限公司。多功能酶标仪（美国Bio-Tek公司），高压灭菌锅（上海申安医疗器械厂），水浴箱（上海精宏实验室设备有限公司），恒温培养箱（美国Thermo公司）。

1.2　细菌复苏及培养

本研究采用E.faecalis ATCC 29212标准菌株。菌株由-80 ℃冰箱取出后，于超净工作台内加入10 mL灭菌BHI液体培养基中混匀。使用无菌接种环取样，接种至固体BHI琼脂培养基，37 ℃培养24 h形成菌落。随后，挑取单个菌落接种至新无菌BHI液体培养基，同样条件培养24 h制备菌液。将菌液培养至对数生长中期，作为菌液配制使用。

1.3　微孔板稀释法检测赤芍3种活性成分对E.faecalis 的最小抑菌浓度 （minimum inhibitory concentration，MIC）和最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration， MBC）

配制2倍浓度的BHI培养基，加入菌液使菌液浓度为 2×10⁶ CFU·mL^-1。分别配制2倍浓度的活性成分备用液，PF浓度为4、8、12、16和20 g·L^-1，CA浓度为4、8、12、16和20 g·L^-1，PC浓度为2、4、8和12 g·L^-1。于96孔细胞培养板中加入菌液和药物各100 µL，使菌液终浓度为1×10⁶ CFU·mL^-1，PF终浓度为2、4、6、8和10 g·L^-1；CA终浓度为2、4、6、8和10 g·L^-1；PC终浓度为1、2、4和6 g·L^-1，阴性对照为磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）和菌液各100 µL。37 ℃孵育24 h后观察，96孔细胞培养板中清亮无混浊的最低药物浓度即为单独用药的MIC。从清亮微孔吸取10 µL菌液滴在BHI琼脂上，37 ℃培养24 h，无菌落生长的最低药物浓度即为单独用药的MBC。

1.4　棋盘稀释法检测赤芍3种活性成分联合应用部分抑菌浓度指数（fractional inhibitory concentration index，FICI） 和部分杀菌浓度指数（fractional bactericidal concentration index，FBCI）

配制2倍浓度的BHI培养基，加入菌液使浓度为2×10⁶ CFU·mL^-1。分别配制4倍浓度的活性成分备用液，PF浓度为8、16、24、32和40 g·L^-1，CA浓度为8、16、24、32和40 g·L^-1，PC浓度为4、8、16和24 g·L^-1。96孔细胞培养板中加入100 µL菌液及3种活性成分中2种各50 µL，使菌液终浓度为1×10⁶ CFU·mL^-1，PF终浓度为2、4、6、8和10 g·L^-1，CA终浓度为2、4、6、8和10 g·L^-1，PC终浓度为1、2、4和6 g·L^－1，阴性对照为PBS缓冲液和菌液。37 ℃ 孵育24 h。选取清亮无混浊孔（即联合用药MIC）计算FICI，清亮无混浊孔中吸取10 µL菌液滴在BHI琼脂上，37 ℃下培养24 h无菌落生长孔（即联合用药MBC）计算FBCI。其计算公式^［17-18］如下：

FICI=（A种药物联合用药的MIC/A种药物单独用药的MIC）+（B种药物联合用药的MIC/B种药物单独用药的MIC）；

FBCI=（A种药物联合用药的MBC/A种药物单独用药的MBC）+（B种药物联合用药的MBC/B种药物单独用药的MBC）。

A代表CA、PC和PF中的任一成分，B指代除A外的2种成分中的1种，三者两两联合进行检测。协同作用为FICI≤0.5，相加作用为0.5<FICI≤1.0，不相干作用为1.0<FICI≤2.0，拮抗作用为FICI≥2^［19］。

后续分组采用了单药时的MBC值作为阳性对照，分别为PF-10、PC-6和CA-10，联合应用采用FICI低值孔或FBCI低值孔作为实验组，分别为CA-2+PC-1、CA-2+PC-2、PF-4+PC-2、PF-6+ PC-2、PF-4+CA-4和PF-6+CA-4。

1.5　实验分组

药物联合效应检测分组为基于“1.4”结果的联合用药MIC和联合用药MBC值，药物联合应用组为CA-2+PC-1组（2 g·L^-1 CA+1 g·L^-1 PC）、 CA-2 + PC-2 组（2 g·L^-1 CA + 2 g·L^-1 PC）、 PF-4 + PC-2 组（4 g·L^-1 PF + 2 g·L^-1 PC）、 PF-6 + PC-2 组 （6 g·L^-1 PF + 2 g·L^-1 PC）、 PF-4 + CA-4 组 （4 g·L^-1 PF + 4 g·L^-1 CA） 和 PF-6 + CA-4组 （ 6 g·L^-1 PF+ 4 g·L^-1 CA）组。选取高浓度单药组，即基于“1.3”结果的PF-10组（10 g·L^-1 PF）、PC-6组（6 g·L^-1 PC）和CA-10组（10 g·L^-1 CA）作为阳性对照组，阴性对照组（对照组）为PBS缓冲液和菌液。

1.6　结晶紫染色检测赤芍3种活性成分联合应用各组E.faecalis生物膜形成情况

配制2倍浓度BHIS培养基，加入菌液使菌液浓度为2×10⁶ CFU·mL^-1。依照“1.5”分组对应的浓度，配制2倍的药液。于24孔细胞培养板中加入500 µL BHIS菌液和500 µL对应药液，即可获取菌液浓度为1×10⁶ CFU·mL^-1，含目标浓度药物的BHIS。各组37 ℃下培养24 h，甲醇固定15 min，0.1%结晶紫（V/W）染色5 min，PBS缓冲液漂洗，无水乙醇溶解结晶紫，采用酶标仪于波长595 nm处测定吸光度（A）值，代表生物膜形成量。

1.7　扫描电镜观察赤芍3种活性成分联合应用各组E.faecalis生物膜形态表现

配制2倍浓度BHIS培养基，加入菌液使菌液浓度为2×10⁶ CFU·mL^-1。依照“1.5”分组对应的浓度，配制2倍的药液。无菌玻片置于24孔细胞培养板中，加入500 µL BHIS菌液及500 µL对应药液，即可获取菌液浓度为1×10⁶ CFU·mL^-1，含目标浓度药物的BHIS。于37 ℃环境下培养24 h后吸出每孔中的液体，2.5%戊二醛固定24 h，梯度（25%、50%、75%、95%和无水乙醇）脱水、干燥和喷金，扫描电镜下观察各组E.faecalis生物膜形态表现。

1.8　点板试验检测赤芍3种活性成分联合应用对各组E.faecalis浮游菌和生物膜中菌落生长情况

实验分组同“1.5”。E.faecalis浮游菌中菌落生长情况检测：配制2倍浓度BHI培养基，加入菌液使菌液浓度为2×10⁶ CFU·mL^-1。依照“1.5”分组对应的浓度，配制2倍的药液。96孔细胞培养板加入50 µL菌液和50 µL药物，于37 ℃条件下处理1、5和10 min后，取10 μL菌液于BHI琼脂上点板，37 ℃培养24 h后观察菌落生长情况。生物膜中菌落生长情况检测：96孔细胞培养板加入菌液浓度为1×10⁶ CFU·mL^-1 BHIS菌液，37 ℃培养24 h以形成1日龄E.faecalis生物膜。吸除原培养液，在生物膜中加入50 µL 2倍浓度BHI培养基和50 µL 2倍浓度的“1.5”中对应浓度药物处理15和30 min后，加入PBS缓冲液，充分刮取和离散生物膜，梯度稀释1×10⁴倍后，取10 µL稀释菌液于BHI琼脂上点板，37 ℃下培养24 h后观察菌落生长情况，生长菌落即为未被杀伤的存活细菌，菌落越稀疏代表药物杀伤效果越强。

1.9　扫描电镜观察赤芍3种活性成分联合应用各组E.faecalis细菌胞膜损伤情况

实验分组同“1.5”。配制2倍浓度BHI培养基，加入菌液使菌液浓度为2×10⁶ CFU·mL^-1。依照“1.5”分组对应的浓度，配制2倍浓度的药液。10 mL离心管中加入5 mL菌液和5 mL药液，37 ℃下培养15和30 min。吸取10 µL至玻片上晾干，2.5%戊二醛固定24 h，梯度（25%、50%、75%、95%和无水乙醇）脱水、干燥和喷金。扫描电镜下观察各组E.faecalis形态表现。

1.10　试剂盒检测赤芍3种活性成分联合应用各组E.faecalis浮游菌和生物膜中腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）水平

参照BTL试剂盒说明书操作，实验分组同“1.5”。配制2倍浓度BHI培养基，加入菌液使菌液浓度为2×10⁶ CFU·mL^－1。依照“1.5”分组对应的浓度，配制2倍浓度的药液。使50 µL菌液与50 µL药液共培养于96孔细胞培养板中，37 ℃下培养1 h。每孔加入100 μL BTL，避光孵育20 min，采用多功能酶标仪以化学发光法检测浮游菌中ATP水平。

96孔细胞培养板中加入菌液浓度为1×10⁶ CFU·mL^-1 BHIS菌液，37 ℃下培养24 h以形成1日龄E.faecalis生物膜。吸除原培养液，在生物膜中加入50 μL培养基与50 μL不同浓度药液共培养，于37 ℃下培养1 h。每孔加入100 μL BTL，室温下避光孵育20 min，采用多功能酶标仪以化学发光法检测生物膜中ATP水平。ATP水平以荧光强度表示，荧光强度越低，代表ATP水平越低，即药物抑制作用越强。

1.11　统计学分析

采用GraghPad Prism 10.0统计软件进行统计学分析。各组E.faecalis生物膜形成量和浮游菌及生物膜中ATP水平均呈正态分布，以x±s表示。多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用Tukey’s多重检验。以P<0.05为差异有统计学意义。每部分实验至少进行3次重复。

2 结 果

2.1　赤芍3种活性成分的MIC和MBC

赤芍3种活性成分中PC的MIC为4 g·L^-1，MBC为6 g·L^-1；CA的MIC为8 g·L^-1，MBC为10 g·L^-1；PF的MIC和MBC均>10 g·L^-1。由于PF单价较高且使用浓度较大，造成费效比偏高，因此后续实验选取PF浓度为10 g·L^-1。

2.2　赤芍3种活性成分联合应用的FICI和FBCI

PC与CA联合应用时，PC的MIC值为1 g·L^-1，MBC为2 g·L^-1，CA的MIC和MBC均为2 g·L^-1，FICI=0.500，提示PC与CA联合应用具有协同作用。PC与PF联合应用时，PC的MIC和MBC均为2 g·L^-1，PF的MIC为4 g·L^-1，MBC为6 g·L^-1，FICI<0.900，提示PC与PF联合应用具有相加作用。CA与PF联合应用时，CA的MIC和MBC均为4 g·L^-1，PF的MIC为4 g·L^-1，MBC为6 g·L^-1，FICI<0.900，提示CA与PF联合应用具有相加作用。见图1和表1。

2.3　各组E.faecalis生物膜形成情况

与对照组比较，PF-10组、PC-6组、CA-10组和各药物联合应用组E.faecalis生物膜形成量均明显降低（P<0.01）。与PF-10组比较，PC-6组、CA-10组、CA-2+PC-1组、CA-2+PC-2组、PF-4+PC-2组、PF-6+PC-2组和PF-6+CA-4组E.faecalis生物膜形成量均明显降低（P<0.05或P<0.01），PF-4+ CA-4组E.faecalis生物膜形成量差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.4　各组E.faecalis生物膜形态表现

对照组E.faecalis生物膜较厚，细菌之间紧密连接，形态规则，且细胞膜完整；PF-10组、PC-6组和CA-10组E.faecalis生物膜厚度明显降低，细菌间的排列相对疏松；各药物联合应用组可见E.faecalis生物膜均明显减少乃至完全消失，高倍镜下可见E.faecalis生物膜结构完全消失，细菌碎片相互黏附聚集，失去原有的细菌形态。各药物联合应用组与PF-10组、PC-6组和CA-10组达到同样抑制生物膜的效果，结果与生物膜形成抑制的测定结果一致。见图2。

2.5　各组E.faecalis浮游菌和生物膜杀伤情况

与对照组比较，作用5、10和30 min后PF-10组、PC-6组及CA-10组E.faecalis浮游菌菌落明显减少，提示其对E. faecalis的杀伤作用逐渐增强。各药物联合应用组中，CA与PC联合应用在5 min内可见E.faecalis浮游菌菌落明显减少，提示其对E.faecalis浮游菌菌落的杀伤作用较强。与CA和PC组比较，作用5、10和30 min后各药物联合应用组E.faecalis浮游菌菌落未见明显减少，提示其对E.faecalis的杀伤效果并不明显。见图3。

与对照组比较，作用30和60 min后PF-10组、PC-6组及CA-10组E.faecalis生物膜菌落逐渐减少，提示高浓度单药组对E.faecalis生物膜中细菌表现出逐渐增强的杀伤作用。其中PC-6组E.faecalis生物膜杀伤效果最为明显，在处理30 min后未见菌落形成。在药物联合应用组中，作用30 min后CA-2+ PC-2组E.faecalis生物膜仅见少许菌落，提示其可有效杀伤生物膜中的细菌。与PC-6组和CA-10组比较，各药物联合应用组在低浓度即可达到高浓度单药组的杀伤效果。见图4。

2.6　各组E.faecalis生物膜损伤情况

对照组E.faecalis呈椭圆形，且细胞膜完整。PF组E.faecalis形态改变，细胞膜完整性受损；CA组大部分E.faecalis细胞膜相对完整，但E.faecalis表面出现皱缩和凹陷现象，少数E.faecalis细胞膜完整性遭到破坏；PC组E.faecalis细胞膜的完整性破坏最为严重，导致内容物外泄，细胞碎片相互聚集形成絮状结构；各药物联合应用组E.faecalis细胞膜破裂、内容物外泄和细菌残片聚集的现象，尤其是PC与CA联合应用时，可观察到E.faecalis细胞膜的完整性破坏最为明显，内容物完全外泄；PF与CA联合应用时，可观察到E.faecalis表面凹坑和皱缩，偶见细胞膜破裂。见图5。

2.7　各组E.faecalis浮游菌和生物膜中ATP水平

与对照组比较，各组E.faecalis浮游菌及生物膜中ATP水平均明显降低（P<0.01）。与PF-10组比较，CA-10组、CA-2+PC-2组、PF-4+CA-4组和PF-6+CA-4组E.faecalis浮游菌中ATP水平均明显降低（P<0.05或P<0.01），CA-10组和CA-2+PC-2组E.faecalis生物膜中ATP水平均明显降低（P<0.05或P<0.01）。见表3。

3 讨 论

E.faecalis是导致根管治疗失败的主要微生物之一。植物提取物对E.faecalis具有显著的抗菌效果。COSTA等^［20］研究表明：胡椒巴西木和乌木的提取物能够有效抑制根管内E.faecalis活性。IBRAHIM等^［21］研究也验证了黑桑叶提取物和油橄榄叶提取物对E. faecalis具有良好的抗菌性能，进一步证实了植物提取物中的活性成分在抗微生物治疗中的巨大潜力。中药复方中多种活性成分可协同作用，增强药物疗效并减少不良反应。研究^［22-23］显示：PC与银杏黄酮等成分结合，能够发挥协同抗氧化作用；其与羧甲基厚棉结合，表现出协同抗菌活性。CA和咖啡酸与磷霉素联合应用，对耐药性细菌有协同抑制作用^［24］。相关研究进一步证实中药复方中活性成分协同作用的重要性。本研究结果显示：阳性对照组具有较好的抗E.faecalis浮游菌的能力，而PF在浓度超过10 g·L^-1时才表现出对E.faecalis的轻微抑制作用。而PC与CA在联合应用时，其MIC均明显降低，提示PC和CA在联合作用时对E.faecalis及其生物膜具有明显的协同作用。TRENTIN等^［25］研究发现：PC通过改变细菌表面的疏水性，在其表层构建了一层亲水性涂层，有效阻止了细菌间的黏附，进而减弱生物膜的形成能力。本研究结果显示：PC与CA在联合应用时在较低浓度下能够明显抑制E.faecalis生物膜形成，与TRENTIN等^［25］研究结果一致。

ULREY等^［26］研究显示：PC作用于铜绿假单胞菌后，可下调ATP合酶及参与DNA和RNA合成的蛋白质表达，进而引发细胞代谢功能紊乱。研究^［27］表明：CA处理金黄色葡萄球菌能减少其结合凝固酶与游离凝固酶的产生，减少纤维蛋白原向纤维蛋白的转变，最终影响该菌黏附能力和致病力。本研究结果显示：PF、PC和CA作用后，E.faecalis细胞内ATP水平明显降低，提示药物可能通过抑制细菌中ATP水平，从而发挥抑菌作用。

PC通过多种途径发挥其抗菌作用，包括与微生物的基本生命结构——原生质体相结合，与金属离子形成络合物，抑制关键酶的活性，改变细胞膜的通透性，减少微生物获取必需营养物质的能力，调整周围环境的酸碱度及干扰微生物的黏附和侵染过程，从而表现出较强的抗菌效果^［28］。研究^［25］显示：PC对蛋白质的络合作用导致不溶性聚集体的形成，此聚集体可以通过扫描电镜图像可视化。本研究结果显示：PC应用于E.faecalis后，细菌细胞膜的完整性遭到破坏，细菌形态发生改变，甚至裂解成碎片，周围出现不溶性的絮状物。同时，在扫描电镜下可观察到CA和PF可使部分E.faecalis细胞膜表面出现凹坑、皱缩、空洞和轻微的破坏作用。提示CA和PF对E.faecalis菌体细胞膜具有一定的破坏作用，与SU等^［29］研究结果一致。但CA对E.faecalis生物膜的破坏作用较PC更小。且PC与CA在联合应用时对细胞的破坏效果更为明显，可能是由于低浓度PC先行破坏细菌的黏附和聚集，进而发挥强大的破膜作用，可以帮助CA快速进入细菌细胞膜内部，产生快速有效的杀菌效应，极大地提升了对E.faecalis的抑制作用。通过细胞膜破坏和抑制细菌中ATP水平进一步增强抗菌效果。

综上所述，赤芍3种活性成分PF、PC和CA联合应用，通过破坏细胞膜和抑制细菌中ATP水平2种机制，对E.faecalis及其生物膜菌具有较好的抑制作用，为根管治疗领域提供了新的治疗策略。

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基金资助

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