基于复方胃炎合剂治疗慢性萎缩性胃炎作用机制的网络药理学和分子对接分析

Network pharmacology and molecular docking analysis based on mechanism of Compound Gastritis Mixture in treatment of chronic atrophic gastritis

摘要

目的 探讨复方胃炎合剂（CGM）治疗慢性萎缩性胃炎（CAG）的活性成分和作用靶点，联合分子对接分析和细胞实验验证其潜在机制。 方法 从中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）和Swiss Target Prediction数据库筛选CGM的药物活性成分，获取各药物成分相应的靶点。采用GeneCards和人类在线孟德尔遗传（OMIM）数据库筛选CAG对应的靶点。于Venny2.1.0网络平台中获取CGM与CAG的共同靶点，采用STRING在线平台对“药物-疾病”的共同靶点构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络，并筛选核心靶点。采用Cytoscape 3.9.1软件构建药物成分-疾病-靶点网络，并筛选药物核心成分。采用基因本体论（GO）功能和京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析CGM与CAG的共同靶点，AutoDock分析软件对预测的药物主要成分与核心靶点进行分子对接分析。采用脂多糖（LPS）诱导胃黏膜上皮细胞GES-1，构建CAG细胞模型。将GES-1细胞分为空白组（10%血清完全培养基）、模型组（10 mg·L^-1 LPS）和不同浓度CGM组（50、100、200、400、800和1 600 g·L^-1 CGM+10 mg·L^-1 LPS），共培育12、24和48 h，采用细胞计数试剂盒8（CCK-8）法检测各组GES-1细胞增殖活性。将GES-1细胞分为空白组（10%血清完全培养基）、模型组（10 mg·L^-1 LPS）和CGM组（1 600 g·L^-1 CGM+10 mg·L^-1 LPS），采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测各组GES-1细胞中白细胞介素（IL）-6、肿瘤坏死因子（TNF）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（AKT1）、IL-1β和表皮生长因子受体（EGFR）mRNA表达水平。 结果 筛选获得CGM成分198个，与CAG共有的靶点128个。CGM治疗CAG的药物成分主要为槲皮素、山柰酚和木犀草素，主要作用于IL-6、TNF、AKT1、IL-1β和EGFR等靶点。GO功能富集分析，排名前15位靶点主要集中于细胞凋亡、炎症反应和细胞增殖等生物学过程（BP），主要包括细胞质、细胞表面和大分子复合体等细胞组分（CC），主要发挥蛋白质、酶和泛素蛋白连接酶等分子功能（MF）。KEGG信号通路富集共获得158条通路，主要涉及癌症相关的通路、TNF信号通路、病毒感染、程度性细胞死亡受体-配体1（PD-L1）/程度性细胞死亡受体1（PD-1）通路、细胞凋亡、NOD样受体信号通路、Toll样受体信号通路、EGFR和IL-17信号通路等。关键靶点IL-6、TNF、IL-1β、AKT1和EGFR与药物核心成分槲皮素、山柰酚和木犀草素的结合能均<-5 kcal·mol^-1。CCK-8法检测，与空白组比较，细胞培养24和48 h后，模型组细胞增殖活性均明显降低（P<0.01），且48 h后细胞增殖活性抑制更明显，因此选择LPS诱导48 h为造模时间；与模型组比较，800和1 600 g·L^-1 GCM组细胞增殖活性均明显升高（P<0.01），1 600 g·L^-1 GCM组细胞增殖活性促进作用更明显，故选该药物干预浓度进行后续实验。RT-qPCR法检测，与空白组比较，模型组细胞中IL-6、TNF、IL-1β、AKT1和EGFR mRNA表达水平均明显升高（P<0.01）；与模型组比较，CGM组细胞中IL-6、IL-1β、AKT1和EGFR mRNA表达水平均明显降低（P<0.01）。 结论 GCM可以通过槲皮素、山柰酚和木犀草素等多个药物成分，作用于IL-6、TNF、AKT1、IL-1β和EGFR等多个靶点蛋白，并涉及多种与“炎-癌”有关的通路，起到防治CAG的作用。

Abstract

Objective To investigate the active ingredients and targets of Compound Gastritis Mixture （CGM） in the treatment of chronic atrophic gastritis （CAG） by network pharmacology method， and to validate the potential mechanism combined with molecular docking technology and cellular experiments. Methods The Traditional Chinese Medicine System Analysis Platform （TCMSP） and Swiss Target Prediction databases were used to select the herbal ingredients of CGM and the corresponding targets； the GeneCards and Online Mendelian Inheritance in Man （OMIM） database were used to screen the targets of CAG； the common targets of CGM and CAG were analyzed from the Venny2.1.0 platform； STRING online platform was used to construct protein-protein interaction （PPI） networks for common drug-disease targets and screen the core targets. Cytoscape 3.9.1 software was used to construct the drug-disease-target network and screen the drug core components； Gene Ontology （GO） fuctional， Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） signaling pathway enrichment analysis were used to analyze the common targets of CGM and CAG； and AutoDock analysis software was used to perform molecular docking analysis of predicted main components of the drugs and core targets. The gastric mucosal epithelial cells GES-1 were induced by lipopolysaccharide （LPS） to construct CAG cell model.The GES-1 cells were divided into blank group （10% serum complete medium），model group （10 mg·L^-1 LPS）， and different concentrations of CGM groups （50， 100， 200， 400， 800 and 1 600 g·L^-1 CGM+10 mg·L^-1 LPS）， and cells were incubated for 12， 24， and 48 h. The cell counting kit-8 （CCK-8） assay was used to detect the proliferation activities of GES-1 cells. The GES-1 cells were divided into blank group （10% serum complete medium）， model group （10 mg·L^-1 LPS） and CGM group（1 600 g·L^-1 CGM+10 mg·L^-1 LPS）. Real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR） method was used to detect the expression levels of interleukin（IL）-6， tumor necrosis factor （TNF）， serine/threonine protein kinase 1 （AKT1），IL-1β， and epidermal growth factor receptor （EGFR） mRNA in the cells in various groups. Results A total of 198 ingredients of CGM were screened， and 128 common targets with CAG were identified. The main herbal ingredients of CGM in treatment of CAG were quercetin， kaempferol， and lluteolin， which mainly acted on the core targets of IL-6， TNF， AKT1， IL-1β， and EGFR. The GO function enrichment analysis results showed that the top 15 targets mainly focused on biological processes（BP） such as apoptosis， inflammatory response and cell proliferation， mainly included cellular components （CC） such as cytoplasm， cell surface and macromolecular complexes， and mainly exerted molecular functions （MF）such as proteins， enzymes and ubiquitin-protein ligases. A total of 158 pathways were obtained from KEGG signaling pathway enrichment analysis， mainly involved cancer-related pathways， TNF signaling pathways， viral infection， programmed cell death-ligand 1（PD-L1）/ programmed cell death protein-1 （PD-1） pathways， apoptosis， NOD-like receptor signaling pathways， Toll-like receptor signaling pathways， EGFR， and IL-17 signaling pathways.The binding energies of the core targets IL-6， TNF， IL-1β， AKT1， and EGFR with main herbal ingredients quercetin， kaempferol， and luteolin were<-5 kcal·mol^-1. The CCK-8 assay results showed that compared with blank group， after 24 and 48 h of cell culture， the proliferation activities of the cells in model group were significantly decreased （P<0.01）， and the inhibition of the proliferation activity was more obvious after 48 h； therefore， 48 h was selected for the modeling time； compared with model group， the proliferation activities of cells in 800 and 1 600g·L^-1 GCM groups were significantly decreased （P<0.01）， and the promotion of cell proliferation activity was more obvious in 1 600g·L^-1 GCM group， so the intervening concentration of this drug was selected for the subsequent experiments. The RT-qPCR method results showed that compared with blank group， the expression levels of IL-6， TNF， IL-1β， AKT1， and EGFR mRNA in the cells in model group were significantly increased （P<0.01）； compared with model group， the expression levels of IL-6， IL-1β， AKT1 and EGFR mRNA in the cells in CGM group were significantly decreased （P<0.01）. Conclusion CGM may play a role in the prevention and treatment of CAG through multiple ingredients such as quercetin， kaempferol and lignocerol， acting on the multiple target proteins such as IL-6， TNF， AKT1， IL-1β， and EGFR， as well as involving a variety of “inflammatory-cancer-related” pathways.

Graphical abstract

关键词

慢性萎缩性胃炎 / 复方胃炎合剂 / 网络药理学 / 分子对接分析 / 实验验证

Key words

Chronic atrophic gastritis / Compound Gastritis Mixture / Network pharmacology / Molecular docking analysis / Experiment verification

慢性萎缩性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）在人群中普遍存在，其无特异性的临床症状，胃黏膜组织病理以固有腺体萎缩和减少为主^［1］。CAG被认为是一种慢性炎症性感染疾病，其病程长，若不及早干预治疗，易出现胃黏膜和肠上皮的化生异常发育，向异型增生等胃癌前病变进展，增加其癌变概率^［2］，因此积极防治CAG具有重要意义。近年来，中医药应用于CAG的治疗得到较多关注，研究^［3］表明：中医药可通过减轻炎症、对抗幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori，Hp）、调控细胞增殖和凋亡及促进胃酸分泌等多种过程，改善CAG的黏膜病变。复方胃炎合剂（compound gastritis mixture，CGM）是在国医大师杨春波教授多年学术思想引领下，结合临床证素辨证调查，进一步优化的协定方，常应用于CAG的临床治疗，包含党参、黄芪、茯苓、白术、砂仁、半夏、陈皮、佩兰、三七、黄连、莪术、枳壳、白芍和甘草14味药，具有健脾益气、清热化湿及化瘀舒络的作用^［4-5］。研究^［5］显示：CGM治疗CAG患者临床疗效明显，不良反应少。研究^［6-7］显示：该方能够减轻CAG大鼠胃黏膜炎症反应，阻断其黏膜病理的恶性变转化。但CGM作为多种中药组成的复方制剂，存在多靶点和多机制的作用特点，因此，对于CGM治疗CAG的作用机制还应进行全面和多层次的深入探讨，以便更细致地说明该方在CAG治疗领域的适用性。网络药理学的研究方法可从系统、整体的角度，探讨中药复方治疗疾病的潜在分子靶点，并可结合分子对接分析进行初步验证，为阐明中药复方的复杂作用机制提供重要的技术支撑和科学依据^［8］。本研究采用网络药理学方法，系统性地分析CGM在治疗CAG时发挥作用的主要药物成分和涉及的靶点及信号通路，联合分子对接分析和细胞实验对预测的结果进行验证，以阐明CGM治疗CAG的潜在作用机制，并为其治疗CAG的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1　CGM药物活性成分和靶点预测

在中药系统药理数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine System Analysis Platform，TCMSP）数据库 （https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）^［9］中输入药名“党参、黄芪、茯苓、白术、砂仁、半夏、陈皮、佩兰、三七、黄连、莪术、枳壳、白芍、甘草”，搜索各药物的活性成分，并以口服生物利用度≥30%和类药性≥0.18进行筛选。在PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）^［10］中搜索各药物成分的“SMILES”格式，通过Swiss Target Prediction数 据 库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）^［11］预测相应的药物靶点，选择可靠度≥0.1，经过相应合并和去重，最终获得CGM的药物靶点。

1.2　CAG疾病靶点预测

分别在GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）^［12］和人类在线孟德尔遗传（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）数据库（https：/omim.org/）^［13］输入疾病名称“chronic atrophic gastritis”，搜索疾病的靶点，其中GeneCards中选择“score>中位数”的结果，最后将2种数据库获得的结果进行合并，删除重复靶点。

1.3　药物-疾病共同靶点预测

在Venny2.1.0网络平台（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）获取CGM与CAG二者间的共同靶点，并绘制韦恩图。

1.4　蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络构建

在STRING在线平台（https：//cn.string-db.org/）^［14］中对药物-疾病的共同靶点进行PPI网络创建，“Homosapiens”为生物种类，置信度为>0.4。采用Cytoscape 3.9.1软件^［15］将PPI网络图进行可视化，应用拓扑分析方法计算度中心性（degree centrality，DC）等参数，筛选核心靶点。

1.5　药物成分-疾病-靶点网络图构建

采用Cytoscape 3.9.1软件^［15］构建药物成分-疾病-靶点网络，根据拓扑参数DC值选取CGM中发挥作用的核心成分。

1.6　基因本体论（Gene Ontology，GO）功能和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信号通路富集分析

将CGM与CAG的共同靶点输入至DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）^［16］，进行GO功能和KEGG信号通路富集分析，分别获取排名前15位GO功能富集分析和前30位KEGG信号通路富集分析的靶点，采用微生信网站（http：//www.bioinformatics.com.cn/）进行图像可视化。

1.7　分子对接分析

采 用 AutoDockTools（Version 1.5.7）软件，将DC值排名前3位的药物成分与排名前5位的作用靶点构建分子对接模型，采用Autodock Vina软件评估二者间的结合潜力^［17］。结合能越低，提示结合活性越高且构象越稳定，结合能<-5 kcal·mol^-1表明结合良好。最后，通过PyMOL（Version 2.5.4）软件将对接结果可视化。

1.8　细胞、药物、主要试剂和仪器

胃黏膜上皮细胞GES-1购于上海沪震实业有限公司。CGM药液：党参15 g、黄芪15 g、白术10 g、茯苓15 g、半夏9 g、佩兰9 g、陈皮9 g、砂仁6 g、枳壳10 g、莪术6 g、三七3 g、黄连3 g、白芍9 g和甘草3 g，均由福建中医药大学附属第二人民医院提供。取上述各药物的10倍剂量，并将其浸泡于8倍剂量的水中0.5 h，依次煎煮1.5、1.0和0.5 h，再将3次煎煮的药液进行合并、过滤后浓缩至其生药含量为1 600 g·L^-1，冷藏于4 ℃冰箱中备用。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）购自北京索莱宝公司，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（serine/threonine kinase protein 1，AKT1）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、白细胞介素（interleukin，IL）-6、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）和IL-1β抗体均购自英国Abcam公司，细胞计数试剂盒8（cell counting kit-8，CCK-8）试剂，TRIzol、SYBR Gree PCR试剂盒和逆转录试剂盒均购自上海赛默飞世尔科技有限公司。酶标分析仪购自北京普朗新技术有限公司，显微镜购自上海蔡康光学仪器有限公司，实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）检测仪购自美国ABI公司，低温冷冻离心机购自上海卢湘仪实验仪器有限公司。

1.9　CCK-8法检测各组GES-1细胞增殖活性

GES-1细胞采用含10%胎牛血清和1%青-链霉素双抗混合液的DMEM高糖培养基、于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养。选择处于对数生长期的细胞，于96孔细胞培养板中接种培养，每组各3个复孔，各孔细胞计数5×10³ 个，至细胞融合度约80%，将GES-1细胞分为空白组（10%血清完全培养基）、模型组（10 mg·L^-1 LPS）和不同浓度CGM组（50、100、200、400、800和1 600 g·L^-1 CGM+10 mg·L^-1 LPS），共培育12、24和48 h后，于各孔中加入配制好的CCK-8试剂100 µL，培养箱中再培育1 h。采用酶标仪于波长450 nm处检测吸光度（A）值，以A值代表各组细胞增殖活性，筛选最佳药物浓度和作用时间。

1.10　RT-qPCR法检测各组GES-1细胞中IL-6、TNF、IL-1β、AKT1和EGFR mRNA表达水平

按照“1.9”中方法培养各组GES-1细胞，选择对数生长期GES-1细胞接种于96孔细胞培养板中培养24 h，将GES-1细胞分为空白组（10%血清完全培养基）、模型组（10 mg·L^-1 LPS）和CGM组（1 600 g·L^-1 CGM+10 mg·L^-1 LPS），收集各组细胞，依据SYBR Gree PCR试剂盒说明书进行PCR扩增，于冰上融化，反应体系：SYBRGreen Mix 12.5 μL、上游引物和下游引物各0.5 μL、cDNA模板2 μL和ddH₂O 9.5 μL，于冰上操作。反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃延伸45 s，共40个循环。分析熔解曲线，以GAPDH为内参，采用2^-△△Ct 法计算目的基因表达水平。引物序列见表1，PCR引物由复耕生物科技（上海）有限公司合成。

1.11　统计学分析

采用SPSS 26.0统计软件进行统计学分析。各组GES-1细胞增殖活性和细胞中IL-6、TNF、IL-1β、AKT1及EGFR mRNA表达水平均符合正态分布，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　CGM的药物活性成分及相应的靶点

通过检索获得CGM的药物活性成分，并删除无作用靶点的药物成分，去除重复，最后获得198个药物成分，1 120个对应靶点，共包含19个药物共同活性成分。见表2。

2.2　CAG疾病靶点及其与CGM的共同靶点

采用GeneCards和OMIM数据库检索CAG疾病相关的作用靶点，合并后去重获得疾病靶点共484个，应用Venny 2.1.0网站将其与1 120个药物成分靶点取交集，获取128个CGM与CAG的共同靶点。见图1。

2.3　PPI网络

将128个CGM与CAG的共同靶点导入STRING在线平台，去除游离节点后，获得PPI网络图，再将其导入Cytoscape 3.9.1软件进行图像可视化和拓扑分析。共包括128个节点，2 848条连接线，各节点的圆圈越大且颜色越红代表其对应的DC值越高。获得排名前10位的核心靶点，包括IL-6、 TNF、 AKT1、 IL-1β、 EGFR、 TP53、B细胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl2）、核因子KB1（nuclear factor-KB1，NFKB1）、信号转导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription，STAT3）和SRC，相关靶点可能是CGM治疗CAG的重要靶点。见图2。

2.4　药物成分-疾病-靶点网络图

药物成分-疾病-靶点网络显示出328个节点，2 638条连接线，右侧下方正方形为共同作用靶点，右侧上方菱形为疾病名称，左侧圆形为药物成分，左侧六边形为药物名称。计算每个节点的DC值，排名前3位的成分为槲皮素、山柰酚和木犀草素，此3种药物成分可能为GCM治疗CAG的主要药物成分。见图3。

2.5　GO功能和KEGG信号通路富集分析

将筛选获取的128个共同靶点输入至DAVID数据库中，共获得1 048个GO功能富集分析结果，包含831个生物学过程（biological process，BP）、76个细胞组分（cellular component，CC）和141个分子功能（molecular function，MF）。对排名前15位靶点进行GO功能富集分析，主要集中于细胞凋亡、炎症反应和细胞增殖等BP，主要包括细胞质、细胞表面和大分子复合体等CC，主要发挥蛋白质、酶和泛素蛋白连接酶等MF。KEGG信号通路富集共获得158条通路，可视化排名前30位的通路，主要涉及癌症相关的通路、TNF信号通路、病毒感染、程序性细胞死亡受体配体1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）/程序性细胞死亡受体1（programmed cell death protein-1，PD-1）通路、细胞凋亡、NOD样受体信号通路、Toll受体信号通路、EGFR和IL-17信号通路等。见图4。

2.6　分子对接分析

各靶点IL-6、TNF、IL-1β、AKT1和EGFR与药物成分槲皮素、山柰酚及木犀草素的结合能均<-5 kcal·mol^-1，表明所选活性成分与靶蛋白之间的结合良好。见表3和图5。

2.7　各组细胞增殖活性

与空白组比较，细胞培养24和48 h后，模型组细胞增殖活性均明显降低（P<0.01），且48 h后细胞增殖活性抑制更明显，因此选择LPS诱导48 h为造模时间。见图6。与模型组比较，800和1 600 g·L^-1 CGM组细胞增殖活性均明显升高（P<0.01），1 600 g·L^-1 GCM组细胞增殖活性促进作用更明显，故选择该药物干预浓度进行后续实验。见图7。

2.8　各组细胞中IL-6、TNF、IL-1β、AKT1和EGFR mRNA表达水平

与空白组比较，模型组细胞中IL-6、TNF、IL-1β、AKT1和EGFR mRNA表达水平均明显升高（P<0.01）。与模型组比较，CGM组细胞中IL-6、IL-1β、AKT1和EGFR mRNA表达水平均明显降低（P<0.01）；TNF mRNA表达水平降低，但差异无统计学意义（P>0.05）。见表4。

3 讨 论

CAG作为一种胃黏膜癌前状态，及早干预治疗或可逆转其黏膜萎缩的病理改变，有助于防治胃癌的发生^［1］。多年来福建中医药大学附属第二人民医院脾胃病科在国医大师杨春波教授主张的“脾胃湿热”相关理论的指导下，致力于CAG等胃黏膜病变的系列研究，且在临床诊治中取得了明显效果^［18］。结合福州本地的气候环境，本课题组在临床辨治时发现，多数CAG患者表现为复合证型，其在脾胃虚弱的基础上，常兼夹湿、热和瘀等病理因素，加重胃络的损伤，促进CAG的进展。CGM常被应用于脾虚湿热兼瘀证CAG患者的临床治疗中，其方中君药党参和黄芪均可健脾益气；臣药以炒白术增补脾胃之气、茯苓健脾渗湿；配以佐药半夏、佩兰、陈皮、砂仁行气燥湿兼和胃，莪术、枳壳消积散瘀，三七化瘀通络，黄连清热燥湿，白芍酸甘养阴，防止过用温燥之品而有损阴液；使药甘草，可调和诸药，本方药物配伍，以期分化湿热而恢复脾胃健运之功，兼顾逐瘀通络，进而逆转CAG等胃黏膜病变，以防止其进一步癌变^［5］。然而，CGM治疗CAG的具体分子机制尚有待进一步探讨。

CGM方中共有198个主要活性成分，可作用于128个对应的靶点蛋白进而达到治疗CAG的目的。经分析预测得出槲皮素、山柰酚和木犀草素为其中的重要药物成分。研究^［19-20］显示：槲皮素强大的抗氧化活性可直接清除活性氧（reactive oxygen species，ROS），进而改善胃黏膜的氧化损伤，还可降低TNF-α诱导的基质金属蛋白酶9（matrix metalloprot eindse-9，MMP-9）表达，减轻胃黏膜上皮细胞炎症反应及阻断细胞迁移。山柰酚可抑制促炎因子IL-6和促进抗炎因子IL-10的分泌，也可增加过氧化氢酶（catalase，CAT）水平以对抗氧化应激，进而修复胃黏膜的损伤^［21］。木犀草素可通过激活细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡或抑制上皮-间充质转化等过程，阻断癌变的进展^［22］；同时，木犀草素在有效根除Hp感染方面也具有一定的潜力^［23］。

对128个共同靶点进行PPI网络分析，依据DC值推测IL-6、TNF、IL-1β、AKT1和EGFR为CGM作用于CAG的核心靶点。CAG发生发展过程中伴有多种促炎细胞因子的释放，包括TNF-α、IL-1β和IL-6，均对胃黏膜病变的产生有重要调节作用。IL-6参与多种炎症反应过程，通过信号受体亚基糖蛋白130调节细胞增殖、存活和血管生成等，被认为是连接“炎-癌”之间的重要介质^［24］。TNF与IL-6具有基因多态性，与胃肠道Hp感染相关性疾病有密切联系^［25］；同时，TNF作为细胞调节因子，可促进IL-1β和IL-6等炎性细胞因子释放，加剧CAG的黏膜炎性损伤^［26］。IL-1β不仅参与胃黏膜炎症反应，还可调节胃酸分泌，同时其表达增强也可能增加Hp感染的风险^［27］。AKT1作为丝氨酸苏氨酸激酶之一，可激活与其相关的磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K）/AKT通路，降低抑癌因子人第10号染色体缺失的磷酸酶（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosom ten，PTEN）的表达及自噬活性，进而诱导CAG发生^［28］。EGFR为表皮生长因子受体，可促进Hp诱导的胃上皮细胞的DNA损伤^［29］；同时，EGFR表达水平升高可激活其介导的丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase， ERK）、Janus激酶（Janus kinase 1，JAK1）/STAT1通路，促进胃上皮细胞的异常增殖、凋亡和分化，增加癌变风险^［30-31］。

GO功能和KEGG信号通路富集分析结果显示：CGM除参与TNF和EGFR信号通路，还可涉及与癌症相关、PD-1/PD-L1、NOD样受体、Toll样受体和IL-17等多条信号通路，调节细胞凋亡、分化、炎症和癌症等病变异常进展的多种生物学过程。研究^［32］显示：PD-1/PD-L1为程序性细胞死亡的相关通路，已被证实在癌症过程中具有重要作用，该通路的激活可通过诱导T淋巴细胞的凋亡进而抑制免疫反应，促进癌细胞的免疫逃逸，利于肿瘤微环境的形成。Toll样受体和NOD样受体均为模式识别受体，当暴露于不同的病原体成分时可激活细胞内信号传导的级联反应，诱导慢性炎症和细胞焦亡的发生，与CAG的发生发展产生紧密联系^［33-34］。IL-17可影响组织炎症和黏膜损伤，同时IL-17在胃癌组织中高表达，其信号传导通过激活自噬过程而诱导胃癌细胞的自我更新，与癌细胞的分化能力关系密切^［35］。提示CGM改善或延缓CAG进展的作用机制多涉及“炎-癌”相关的多条信号通路和多种生物过程。

本研究结果显示：关键靶蛋白IL-6、TNF、IL-1β、AKT1和EGFR与药物成分槲皮素、山奈酚和木犀草素之间均可稳定结合。采用LPS诱导GES-1细胞，构建CAG细胞模型进一步行体外实验验证，结果显示：CGM可提高LPS抑制的GES-1细胞增殖活性，同时降低胃炎细胞中IL-6、TNF、IL-1β、AKT1和EGFR mRNA表达水平，抑制CAG病变细胞的异常增殖。提示分子对接分析及细胞实验的验证结果与网络药理学预测的结果一致。然而，由于中药复方制剂的复杂性与网络信息分析技术的局限性，本研究无法概括CGM治疗CAG完整的药理作用。因此，未来仍需更多的实验研究进行深入探索。

综上所述，CGM可通过槲皮素、山柰酚和木犀草素等多种药物成分，作用于IL-6、TNF、IL-1β、AKT1和EGFR等靶蛋白，参与TNF和EGFR等多种信号通路以调控炎症反应、癌细胞的增殖及凋亡等过程，发挥治疗CAG的作用。

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基金资助

国家自然科学基金项目(82174365)

福建省科技厅自然科学基金项目(2023J01821)

中国中医科学院科技创新工程学部委员学术传承与传播专项(CI2022E017XB)

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