KIAA1522对肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其机制

Effect of KIAA1522 on proliferation, migration, and invasion of lung cancer cells and its mechanism

摘要

目的 探讨KIAA1522对肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响，并阐明其信号机制。 方法 采用生物信息学方法分析75例人非小细胞肺癌（NSCLC）组织和癌旁正常肺组织中KIAA1522 mRNA及蛋白表达水平，免疫组织化学染色法检测NSCLC组织及癌旁正常肺组织中KIAA1522蛋白表达情况，Western blotting法检测在多种肺癌细胞系中KIAA1522蛋白表达水平。分别将KIAA1522-小干扰RNA（siRNA）和过表达质粒转染至肺癌H1299及A549细胞。KIAA1522-siRNA实验分为空白组、阴性对照组（si-NC组）、KIAA1522-siRNA#1组和KIAA1522-siRNA#2组；KIAA1522过表达实验分为对照组、空载对照组（OE-NC组，转染KIAA1522过表达空载质粒）、过表达KIAA1522组（OE-KIAA1522组，转染KIAA1522过表达质粒）、过表达KIAA1522+MK2206组［OE-KIAA1522+MK2206组，共转染KIAA1522过表达质粒和蛋白激酶B（AKT）信号通路抑制剂MK2206］和MK2206组（转染MK2206）。采用Western blotting法验证各组细胞转染效率，噻唑蓝（MTT）法检测各组肺癌细胞增殖活性，细胞划痕实验检测各组肺癌细胞迁移率，Transwell小室实验检测各组肺癌细胞中侵袭细胞数，Western blotting法检测各组细胞中磷酸化AKT（p-AKT）、总AKT（t-AKT）、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、血管内皮生长因子（VEGF）和上皮-间质转化（EMT）相关蛋白［波形蛋白（Vimentin）、N钙黏蛋白（N-cadherin）和E钙黏蛋白（E-cadherin）］蛋白表达水平。 结果 生物信息学方法分析，与癌旁正常肺组织比较，NSCLC组织中KIAA1522 mRNA和蛋白表达水平均明显升高（P<0.05或P<0.01）。免疫组织化学染色法，与癌旁正常肺组织比较，NSCLC组织中KIAA1522蛋白阳性表达率明显升高（P<0.05），且与TNM分期有关（P<0.01）。Western blotting法，与正常肺上皮细胞BEAS-2B比较，肺癌细胞系PC9、H1299、H460、A549、H1975和H226细胞中KIAA1522蛋白表达水平均明显升高（P<0.05或P<0.01）。与si-NC组比较，KIAA1522-siRNA#1组和KIAA1522-siRNA#2组H1299细胞中KIAA1522蛋白表达水平均明显降低（P<0.01）；与OE-NC组比较，OE-KIAA1522组A549细胞中KIAA1522蛋白表达水平明显升高（P<0.01）。MTT法，细胞培养24、48和72 h时，与si-NC组比较，KIAA1522-siRNA#1组和KIAA1522-siRNA#2组H1299细胞增殖活性均明显降低（P<0.01）；与OE-NC组比较，OE-KIAA1522组A549细胞增殖活性明显升高（P<0.05）；与OE-KIAA1522组比较，OE-KIAA1522+MK2206组A549细胞增殖活性明显降低（P<0.01）；与OE-KIAA1522+MK2206组比较，MK2206组A549细胞增殖活性明显降低（P<0.05）。细胞划痕实验，与si-NC组比较，KIAA1522-siRNA#1组和KIAA1522-siRNA#2组H1299细胞迁移率均明显降低（P<0.01）；与OE-NC组比较，OE-KIAA1522组A549细胞迁移率明显升高（P<0.01）；与OE-KIAA1522组比较，OE-KIAA1522+MK2206组A549细胞迁移率明显降低（P<0.05）；与OE-KIAA1522+MK2206组比较，MK2206组A549细胞迁移率明显降低（P<0.05）。Transwell小室实验，与si-NC组比较，KIAA1522-siRNA#1组和KIAA1522-siRNA#2组H1299细胞中侵袭细胞数明显减少（P<0.01）；与OE-NC组比较，OE-KIAA1522组A549细胞侵袭细胞数明显增多（P<0.01）；与OE-KIAA1522组比较，OE-KIAA1522+MK2206组A549细胞中侵袭细胞数明显减少（P<0.01）；与OE-KIAA1522+MK2206组比较，MK2206组A549细胞中侵袭细胞数明显减少（P<0.01）。Western blotting法，与si-NC组比较，KIAA1522-siRNA#1组和KIAA1522-siRNA#2组H1299细胞中p-AKT、Cyclin D1、Vimentin、N-cadherin及VEGF蛋白表达水平均明显降低（P<0.05或P<0.01），E-cadherin蛋白表达水平明显升高（P<0.01）；与OE-NC组比较，OE-KIAA1522组A549细胞中p-AKT、Cyclin D1、Vimentin、N-cadherin和VEGF蛋白表达水平均明显升高（P<0.05或P<0.01），E-cadherin蛋白表达水平明显降低（P<0.05）；与OE-KIAA1522组比较，OE-KIAA1522+MK2206组A549细胞中p-AKT、Cyclin D1、Vimentin、N-cadherin和VEGF蛋白表达水平均明显降低（P<0.05或P<0.01），E-cadherin蛋白表达水平明显升高（P<0.05）；与OE-KIAA1522+MK2206组比较，MK2206组A549细胞中Cyclin D1、Vimentin、N-cadherin和VEGF蛋白表达水平均明显降低（P<0.05或P<0.01），E-cadherin蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。 结论 KIAA1522蛋白可上调肺癌细胞中Cyclin D1、EMT相关蛋白和VEGF蛋白表达，促进肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，其作用机制与激活AKT信号通路有关。

Abstract

Objective To discuss the effect of KIAA1522 on the proliferation， migration， and invasion of lung cancer cells， and to clarify its signaling mechanism. Methods Bioinformatics analysis was used to detect the expression levels of KIAA1522 mRNA and protein in 75 cases of human non-small cell lung cancer （NSCLC） tissues and adjacent normal lung tissues； immunohistochemical staining was used to detect the expression of KIAA1522 protein in NSCLC tissue and adjacent normal lung tissues； Western blotting method was used to detect the expression level of KIAA1522 protein in various lung cancer cell lines. KIAA1522-small interfering（siRNA） and over-expression plasmids were transfected into the lung cancer H1299 and A549 cells， respectively. The KIAA1522-siRNA experiment was divided into blank group， negative control group （si-NC group）， KIAA1522-siRNA#1 group， and KIAA1522-siRNA#2 group. The KIAA1522 over-expression experiment was divided into control group， empty vector control group （OE-NC group， transfected with KIAA1522 over-expression empty vector plasmid）， KIAA1522 overexpression group （OE-KIAA1522 group， transfected with KIAA1522 over-expression plasmid）， KIAA1522 over-expression+MK2206 group ［OE-KIAA1522+MK2206 group， co-transfected with KIAA1522 over-expression plasmid and protein kinase B （AKT） signaling pathway inhibitor MK2206］， and MK2206 group （transfected with MK2206）. Western blotting method was used to verify the transfection efficiencies of the cells in various groups； MTT assay was used to detect the proliferation activities of the lung cancer cells in various groups； cell scratch assay was used to detect the migration rates of lung cancer cells in various groups； Transwell chamber assay was used to detect the numbers of invasion lung cancer cells in various groups； Western blotting method was used to detect the expression levels of phosphorylated AKT （p-AKT）， total AKT （t-AKT）， cyclin D1 （Cyclin D1）， vascular endothelial growth factor （VEGF）， and epithelial-mesenchymal transition （EMT）-related proteins ［vimentin （Vimentin）， N-cadherin （N-cadherin）， and E-cadherin （E-cadherin）］ proteins in the cells in various groups. Results The bioinformatics analysis results showed that compared with adjacent normal lung tissue， the expression levels of KIAA1522 mRNA and protein in NSCLC tissue were significantly increased （P<0.05 or P<0.01）. The immunohistochemistry staining results showed that compared with adjacent normal lung tissue， the positive expression rate of KIAA1522 protein in NSCLC tissue was significantly increased （P<0.05） and was associated with TNM stage （P<0.01）. The Western blotting results showed that compared with normal lung epithelial cells BEAS-2B， the expression levels of KIAA1522 protein in lung cancer cell lines PC9， H1299， H460， A549， H1975， and H226 were significantly increased （P<0.05 or P<0.01）. Compared with si-NC group， the expression levels of KIAA1522 protein in the H1299 cells in KIAA1522-siRNA#1 group and KIAA1522-siRNA#2 group were significantly decreased （P<0.01）； compared with OE-NC group， the expression level of KIAA1522 protein in the A549 cells in OE-KIAA1522 group was significantly increased （P<0.01）. The MTT results showed that at 24， 48， and 72 h of cell culture， compared with si-NC group， the proliferation activities of the H1299 cells in KIAA1522-siRNA#1 group and KIAA1522-siRNA#2 group were significantly decreased （P<0.01）； compared with OE-NC group， the proliferation activity of the A549 cells in OE-KIAA1522 group was significantly increased （P<0.05）； compared with OE-KIAA1522 group， the proliferation activity of the A549 cells in OE-KIAA1522+MK2206 group was significantly decreased （P<0.01）； compared with OE-KIAA1522+MK2206 group， the proliferation activity of the A549 cells in MK2206 group was significantly decreased （P<0.05）. The cell scratch assay results showed that compared with si-NC group， the migration rates of the H1299 cells in KIAA1522-siRNA#1 group and KIAA1522-siRNA#2 group were significantly decreased （P<0.01）； compared with OE-NC group， the migration rate of the A549 cells in OE-KIAA1522 group was significantly increased （P<0.01）； compared with OE-KIAA1522 group， the migration rate of the A549 cells in OE-KIAA1522+MK2206 group was significantly decreased （P<0.05）； compared with OE-KIAA1522+MK2206 group， the migration rate of the A549 cells in MK2206 group was significantly decreased （P<0.05）. The Transwell chamber assay results showed that compared with si-NC group， the numbers of invasion H1299 cells in KIAA1522-siRNA#1 group and KIAA1522-siRNA#2 group were significantly decreased （P<0.01）； compared with OE-NC group， the number of invasion A549 cells in OE-KIAA1522 group was significantly increased （P<0.01）； compared with OE-KIAA1522 group， the number of invasion A549 cells in OE-KIAA1522+MK2206 group was significantly decreased （P<0.01）； compared with OE-KIAA1522+MK2206 group， the number of invasion A549 cells in MK2206 group was significantly decreased （P<0.01）. The Western blotting results showed that compared with si-NC group， the expression levels of p-AKT， Cyclin D1， Vimentin， N-cadherin， and VEGF proteins in the H1299 cells in KIAA1522-siRNA#1 group and KIAA1522-siRNA#2 group were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）， while the expression level of E-cadherin protein was significantly increased （P<0.01）； compared with OE-NC group， the expression levels of p-AKT， Cyclin D1， Vimentin， N-cadherin， and VEGF proteins in the A549 cells in OE-KIAA1522 group were significantly increased （P<0.05 or P<0.01）， while the expression level of E-cadherin protein was significantly decreased （P<0.05）； compared with OE-KIAA1522 group， the expression levels of p-AKT， Cyclin D1， Vimentin， N-cadherin， and VEGF proteins in the A549 cells in OE-KIAA1522+MK2206 group were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）， while the expression level of E-cadherin protein was significantly increased （P<0.05）； compared with OE-KIAA1522+MK2206 group， the expression levels of Cyclin D1， Vimentin， N-cadherin， and VEGF proteins in the A549 cells in MK2206 group were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）， while the expression level of E-cadherin protein was significantly increased （P<0.05）. Conclusion The KIAA1522 protein upregulates the expression of Cyclin D1， EMT-related proteins， and VEGF protein in lung cancer cells， promoting the proliferation， migration， and invasion of lung cancer cells， and its mechanism is related to the activation of the AKT signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

KIAA1522 / 癌， 非小细胞肺 / 蛋白激酶B / 细胞增殖 / 细胞侵袭

Key words

KKIAA1522 / Carcinoma， non-small-cell lung / Protein kinase B / Cell proliferation / Cell invasion

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是一种起源于支气管黏膜或肺泡上皮的恶性肿瘤，其复发率和转移率较高，远期疗效较差^［1］。近年来，肺癌的发病率和病死率均明显升高^［2］。探讨肺癌增殖、侵袭和转移的发生机制对肺癌的防治具有重要意义。

KIAA1522是一种介导细胞黏附的肌动蛋白连接蛋白，在多种人类肿瘤中高度表达^［3-7］。研究^［8-12］表明：KIAA1522可能通过蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）、细胞外信号调节激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）、Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）、核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）和Notch等信号通路，促进肿瘤细胞增殖、诱导上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），参与肿瘤的生长、侵袭和转移等过程。过度表达细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）可促进肿瘤异常增殖^［13］。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是促进血管新生的重要信号分子，可协助EMT促进肿瘤细胞向远处转移^［14］。目前，关于KIAA1522能否调控肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭尚未完全阐明。本研究探讨KIAA1522经AKT信号通路对肺癌细胞增殖、侵袭和迁移的调控作用及其对Cyclin D1、VEGF和EMT相关蛋白的影响，旨在为肺癌的诊断和临床治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1　一般资料

肺癌组织芯片购于上海芯超科技有限公司（产品批号：HLugA150CS04），含NSCLC组织和癌旁正常肺组织各75例。芯片包含患者年龄、性别、肿物最大径、分化程度、TNM分期和淋巴结转移等临床病理特征。

1.2　细胞、主要试剂和仪器

人正常肺上皮BEAS-2B细胞和人肺癌H1299、A549及H226细胞购自中国科学院上海细胞库，人肺癌PC9、H460和H1975细胞由锦州医科大学生命科学研究院惠赠。RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清购自美国CLARK Bioscience公司，KIAA1522-小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）购自苏州吉玛生物有限公司，KIAA1522过表达质粒（pcDNA3.1-3xFlag-KIAA1522）购自湖南丰晖生物有限公司，Lipofectamine 3000购自美国 Invitrogen公司，KIAA1522、磷酸化AKT（phosphorylated AKT，p-AKT）和总AKT（total AKT，t-AKT）购自北京博奥森生物技术有限公司，波形蛋白（Vimentin）、N钙黏蛋白（N-cadherin）、E钙黏蛋白（E-cadherin）和β-actin抗体购自美国SAB公司，Cyclin D1和VEGF购自沈阳万类生物技术有限公司，MK2206购自美国MCE公司，Matrigel基底胶购自美国BD公司，Transwell小室购自美国康宁生物技术有限公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，通用二步法试剂盒和DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。细胞CO₂培养箱（型号：150l）购自美国Thermo公司，垂直电泳仪和转膜仪器（型号：1645050）购自美国Bio-Rad公司，显影仪（型号：Amersham Imager 600）购自日本GE公司，数字切片扫描与应用系统（型号：Easy scan NFC）购自厦门麦克奥迪实业集团有限公司。

1.3　生物信息学方法分析NSCLC组织和癌旁正常肺组织中KIAA1522 mRNA及蛋白表达水平

利用基因表达谱交互分析网站（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）分析NSCLC组织和癌旁正常肺组织中KIAA1522 mRNA表达水平差异（http：//gepia.cancer-pku.cn/）。采用临床蛋白质组肿瘤分析协作组（Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium，CPTAC）数据库分析NSCLC组织和癌旁正常肺组织中KIAA1522蛋白表达水平差异（https：//cptac-data-portal.georgetown.edu/studies/）。

1.4　免疫组织化学染色法检测NSCLC组织和癌旁正常肺组织中KIAA1522蛋白表达情况

NSCLC组织芯片烘片后常规脱蜡至水，于pH 6.0柠檬酸修复液中经高压抗原修复5 min，滴加内源性过氧化物酶阻断剂室温孵育10 min，磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）冲洗3次，一抗4 ℃冰箱过夜。次日PBS缓冲液冲洗3次，滴加反应增强液，37 ℃孵育30 min，PBS缓冲液洗涤3次，滴加酶标山羊抗小鼠/兔IgG聚合物，37 ℃孵育20 min，PBS缓冲液洗涤3次。新鲜配制的DAB溶液显色，苏木素复染3 min，自来水返蓝2 min，脱水透明后树脂封片。免疫组织化学染色结果判定标准：免疫组织化学染色评分=染色强度评分×阳性细胞数评分。染色强度计分标准：0分，细胞无显色；1分，细胞呈浅黄色（弱染色）；2分，细胞呈棕黄色（中等染色）；3分，细胞呈棕褐色（强染色）。阳性细胞数计分标准：0分，无阳性细胞；1分，阳性细胞<25%；2分，25%≤阳性细胞<50%；3分，阳性细胞≥50%。KIAA1522免疫组织化学得分<3分定义为阴性，得分≥3分定义为阳性。KIAA1522蛋白阳性表达率=KIAA1522蛋白阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.5　细胞培养和分组

正常肺上皮BEAS-2B细胞，肺癌PC9、H1299、H460、A549、H1975和H226细胞培养于10%胎牛血清及1%青-链霉素的RPMI-1640培养基中，37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中常规培养，选取对数生长期细胞进行传代和后续实验，实验至少重复3次，采用Western blotting法检测不同细胞中KIAA1522蛋白表达水平。KIAA1522-siRNA实验分为空白组、阴性对照组（si-NC组）、KIAA1522-siRNA#1组和KIAA1522-siRNA#2组。siRNA引物序列：KIAA1522-siRNA#1，上游引物5'-GCAGUCAGACCACAUCCUATT-3'，下游引物5'-UAGGAUGUGGUCUGACUGCTT-3'；KIAA1522-siRNA#2，上游引物5'-GCAUGUGC-AGAAGGAGCUUTT-3'，下游引物5'-AAGCUC-CUUCUGCACAUGCTT-3'；si-NC，上游引物5'- UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，下游引物5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。过表达KIAA1522实验分为对照组、空载对照组（OE-NC组，转染KIAA1522过表达空载质粒）、过表达KIAA1522组（OE-KIAA1522组，转染KIAA1522过表达质粒）、过表达KIAA1522+MK2206组（OE-KIAA1522+MK2206组，共转染KIAA1522过表达质粒和AKT信号通路抑制剂MK2206）和MK2206组（转染MK2206）。MK2206浓度为10 μmol·L^-1。

1.6　细胞转染

si-RNA转染：H1299细胞接种于6孔细胞培养板，待细胞密度为40%~50%时进行瞬时转染。取125 μL RPMI-1640无血清培养基与5.9 μL Lipofectamine 3000溶液充分混合。取125 μL RPMI-1640无血清培养基与3.7 μL si-RNA溶液充分混合。将稀释后的 Lipofectamine 3000试剂中缓慢加入稀释后的si-RNA，室温静置10~15 min后均匀滴入细胞中。4~6 h后，吸弃旧培养基，换为完全培养基继续培养。过表达质粒转染：于6孔细胞培养板中接种A549细胞，使其细胞密度为70%~90%时进行瞬时转染。取125 μL RPMI-1640无血清培养基与3.75 μL Lipofectamine 3000溶液充分混合。取125 μL RPMI-1640无血清培养基、2.5 μg质粒与5 μL Lipofectamine 3000溶液充分混合。将稀释后的 Lipofectamine 3000试剂中缓慢加入稀释后的质粒，室温静置10~15 min后均匀滴加入细胞中。4~6 h后，吸弃旧培养基，换为完全培养基继续培养，采用Western blotting法验证各组细胞转染效率。

1.7　噻唑蓝（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium，MTT）法检测各组肺癌细胞增殖活性

细胞转染24 h后，收集H1299和A549细胞，按每孔4×10³个细胞的密度接种于96孔细胞培养板，每组设置5个复孔，继续培养24、48和72 h。避光加入20 μL 5 g·L^-1 MTT溶液，继续培养4 h后，吸出MTT溶液，加入150 μL二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液，室温溶解15 min，稍振荡。于波长490 nm处测定吸光度（A）值，以A值代表相应时间点的细胞增殖活性。

1.8　细胞划痕实验检测各组肺癌细胞迁移率

收集对数生长期H1299和A549细胞，按每孔4×10⁵个细胞的密度接种于6孔细胞培养板。转染24 h后，待细胞生长至90%左右，用200 µL枪头划痕，PBS缓冲液洗涤3次。0 h时显微镜下拍照记录，继续培养24 h后拍照，观察细胞迁移情况。实验重复3次。细胞迁移率=（0 h划痕面积-24 h后划痕面积）/0 h划痕面积×100%。

1.9　Transwell小室实验检测各组肺癌细胞侵袭细胞数

Matrigel胶与RPMI-1640培养液按1∶9混合，上室加入80 μL，置于37 ℃、5% CO₂培养箱孵育30 min以上，待其聚合成胶。转染24 h后，无血清培养基重悬H1299和A549细胞至5×10⁵ mL^-1，上室每孔加入200 μL细胞悬液，下室加入600 μL完全培养基。24 h后吸去上室培养基，PBS缓冲液洗涤2次，75%甲醇固定30 min，PBS缓冲液洗涤2次，0.1%结晶紫染色20 min，PBS缓冲液洗涤2次。用棉签擦去上室未透膜的细胞，晾干小室。倒置显微镜下，随机抽取5个视野拍照并计数。

1.10　Western blotting法检测各组细胞中AKT通路相关蛋白

转染48 h后加入细胞裂解液，冰上充分裂解30 min，离心分离上清液，BCA试剂盒检测蛋白浓度。蛋白质通过SDS-PAGE电泳分离，转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1~2 h后，分别加入一抗KIAA1522、Cyclin D1、Vimentin、E-cadherin、VEGF、p-AKT、t-AKT（1∶1 000）和N-cadherin（1∶500），4 ℃摇床过夜孵育。次日，TBST溶液洗去一抗，室温孵育二抗（1∶5 000）1 h。TBST溶液洗去二抗，滴加ECL发光试剂，显影曝光。采用Image J软件分析蛋白条带灰度值，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/β-actin蛋白条带灰度值。

1.11　统计学分析

采用SPSS 26.0统计软件进行统计学分析。NSCLC患者临床病理特征（年龄、性别、肿物最大径、分化程度、TNM分期和淋巴结转移）及NSCLC组织和癌旁正常肺组织中KIAA1522蛋白表达情况均以例数（百分率）［（n（%）］表示，组间比较采用χ²检验。各组肺癌细胞增殖活性、细胞迁移率、侵袭细胞数和细胞中KIAA1522、AKT、Cyclin D1、VEGF及EMT相关蛋白表达水平均符合正态分布，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　NSCLC组织和癌旁正常肺组织中KIAA1522 mRNA及蛋白表达水平

与癌旁正常肺组织比较，NSCLC组织中KIAA1522 mRNA和蛋白表达水平均明显升高（P<0.05或P<0.01）。见图1。

2.2　NSCLC组织和癌旁正常肺组织中KIAA1522蛋白阳性表达率

与癌旁正常肺组织（25.31%）比较，NSCLC组织中KIAA1522蛋白阳性表达率（64.24%）明显升高（P<0.05）。NSCLC组织KIAA1522蛋白表达与TNM分期有关（P<0.01）。见图2和表1。

2.3　正常肺上皮细胞和不同肺癌细胞中KIAA1522蛋白表达水平

与正常肺上皮BEAS-2B细胞比较，肺癌PC9、H1299、H460、A549、H1975和H226细胞中KIAA1522蛋白表达水平均明显升高（P<0.05或P<0.01）。其中，H1299细胞中KIAA1522蛋白表达水平最高，A549细胞中KIAA1522蛋白表达水平较低。见图3。

2.4　各组肺癌细胞中KIAA1522蛋白表达水平

与空白组比较，si-NC组H1299细胞中KIAA1522蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）；与si-NC组比较，KIAA1522-siRNA#1组和KIAA1522-siRNA#2组H1299细胞中KIAA1522蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。见图4。与对照组比较，OE-NC组A549细胞中KIAA1522蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）；与OE-NC组比较，OE-KIAA1522组A549细胞中KIAA1522蛋白表达水平明显升高（P<0.01）。见图5。

2.5　各组细胞增殖活性

细胞培养24、48和72 h时，与si-NC比较，KIAA1522-siRNA#1组和KIAA1522-siRNA#2组H1299细胞增殖活性均明显降低（P<0.01）。见表2。细胞培养24、48和72 h时，与OE-NC组比较，OE-KIAA1522组A549细胞增殖活性明显升高（P<0.01）；与OE-KIAA1522组比较，OE-KIAA1522+MK2206组A549细胞增殖活性明显降低（P<0.01）；与OE-KIAA1522+MK2206组比较，MK2206组A549细胞增殖活性明显降低（P<0.05）。见表3。

2.6　各组细胞迁移率

与si-NC组（38.18%±5.23%）比较，KIAA1522-siRNA#1组和KIAA1522-siRNA#2组H1299细胞迁移率（12.63%±3.02%和6.55%±1.04%）均明显降低（P<0.01）。见图6。与 OE-NC 组（13.07% ± 3.30%） 比 较，OE-KIAA1522组A549细胞迁移率（31.55%± 2.95%）明显升高（P<0.01）；与OE-KIAA1522组比较，OE-KIAA1522+MK2206组A549细胞迁移率（17.79%±7.15%）明显降低（P<0.05）；与OE-KIAA1522+MK2206组比较，MK2206组A549细胞迁移率（3.27%±1.20%）明显降低（P<0.05）。见图7。

2.7　各组细胞中侵袭细胞数

与si-NC组（280.00个± 14.11个） 比 较， KIAA1522-siRNA#1 组 和KIAA1522-siRNA#2组H1299细胞中侵袭细胞数（106.70个±17.47个和68.67个±12.01个）明显减少（P<0.01）；与OE-NC组（185.70个± 12.01个）比较，OE-KIAA1522组A549细胞中侵袭细胞数（404.70个±13.5个）明显增多（P<0.01）； 与 OE-KIAA1522 组 比 较，OE-KIAA1522+MK2206组A549细胞中侵袭细胞数（210.70个±20.31个）明显减少（P<0.01）；与OE-KIAA1522+MK2206组比较，MK2206组A549细胞中侵袭细胞数（44.33个±5.13个）明显减少（P<0.01）。见图8。

2.8　各组细胞中AKT通路相关蛋白表达水平

与si-NC 组 比 较，KIAA1522-siRNA#1 组 和KIAA1522-siRNA#2组H1299细胞中p-AKT、Cyclin D1、Vimentin、N-cadherin及VEGF蛋白表 达 水 平 均 明 显 降 低（P<0.05或P<0.01），E-cadherin蛋白表达水平明显升高（P<0.01）；各组细胞中t-AKT蛋白表达水平比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见图9。与OE-NC组比较，OE-KIAA1522组A549细胞中p-AKT、Cyclin D1、Vimentin、N-cadherin和VEGF蛋白表达水平升高（P<0.05或P<0.01），E-cadherin蛋白表达水平明显降低（P<0.05）；与OE-KIAA1522组比较，OE-KIAA1522+MK2206组A549细胞中p-AKT、Cyclin D1、Vimentin、N-cadherin和VEGF蛋白表达水平均明显降低（P<0.05或P<0.01），E-cadherin蛋白表达水平明显升高（P<0.05）；与OE-KIAA1522+MK2206组比较，MK2206组A549 细 胞 中 p-AKT、 Cyclin D1、 Vimentin、N-cadherin和VEGF蛋白表达水平均明显降低（P<0.05或P<0.01），E-cadherin蛋白表达水平明显升高（P<0.05）；各组细胞中t-AKT蛋白表达水平比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见图10。

3 讨 论

肺癌是全球发病率和病死率最高的恶性肿瘤^［15］。肺癌的发病机制十分复杂，恶性转移是肺癌患者死亡率较高的主要原因。阐明肺癌侵袭与转移的分子机制，确定有效的干扰靶点，对提高肺癌的诊断率和患者生存质量具有重要意义。KIAA1522参与细胞微丝骨架的多聚化、重排和细胞间黏附等过程，通过重塑细胞骨架，调节细胞黏附，促进细胞的运动和转移^［3］。KIAA1522在多种恶性肿瘤过度表达，如结直肠癌^［10］、肝癌^［4］、卵巢癌^［16］、食管癌^［11］和胰腺癌^［17］等，调节细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移及血管生成等病理过程，促进肿瘤的发生发展。

本研究中生物信息学数据分析结果显示：肺癌组织中KIAA1522 mRNA和蛋白表达水平明显升高。组织芯片染色结果证实：NSCLC组织中KIAA1522蛋白阳性表达率明显高于癌旁正常肺组织，与生物信息学数据库分析结果一致。KIAA1522蛋白表达水平与肺癌TNM分期有关，提示KIAA1522可能与肿瘤的恶性进展有关联。为明确KIAA1522对肺癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响，本研究筛选了KIAA1522表达较高的肺癌H1299细胞和表达较低的A549细胞进行体外实验；沉默KIAA1522后，与对照组比较，肺癌H1299细胞增殖活性、细胞迁移率和侵袭细胞数及细胞中AKT磷酸化水平明显降低；肺癌A549细胞过表达KIAA1522则促进了细胞增殖、迁移和侵袭及AKT磷酸化，且AKT信号通路特异性抑制剂MK2206可阻断上述作用。本研究结果提示：KIAA1522可能通过激活AKT信号通路，促进肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

EMT赋予了肿瘤细胞的高运动性和侵袭性^［18］。EMT启动过程的关键环节是上皮细胞间的紧密连接、黏附连接和桥粒间隙连接的破坏，细胞失去极性，上皮细胞的肌动蛋白重组，细胞获得运动性和侵袭能力^［19］。KIAA1522作为黏附连接蛋白，在很大程度上参与了EMT过程，导致肺癌细胞与邻近细胞及细胞外基质的黏附连接不甚紧密，易脱离细胞群，从而促进EMT发生，增加肿瘤的转移能力。研究^［20］显示：结直肠癌细胞过表达KIAA1522可能诱导EMT发生，促进细胞侵袭和迁移。

VEGF介导的血管形成在肿瘤侵袭和迁移中扮演重要角色。新生血管的形成给肿瘤细胞提供了营养支持，便于其局部侵袭和远处转移^［21］。研究^［22］表明：VEGF在癌症中高表达，并与肿瘤的迁移、侵袭和EMT有关。Cyclin D1是反映细胞增殖活性相关的主要标志物。JIANG等^［8］研究表明：过表达KIAA1522通过Wnt/β-catenin信号通路上调Cyclin D1，进而促进肝细胞癌增殖。Cyclin D1、VEGF和EMT相关蛋白是AKT信号通路的下游关键因子^［23］。本研究结果显示：沉默KIAA1522可导 致 肺 癌 H1299 细 胞 中 Cyclin D1、Vimentin、N-cadherin和VEGF蛋白表达抑制，E-cadherin表达上调；过表达KIAA1522则可促进肺癌A549 细胞中Cyclin D1、Vimentin、N-cadherin和VEGF蛋白表达上调，抑制E-cadherin表达，AKT信号通路抑制剂MK2206可阻断上述作用。以上结果提示，KIAA1522可能通过激活AKT信号通路，上调Cyclin D1、VEGF和EMT蛋白表达，促进肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。Cyclin D1和VEGF是肿瘤发生发展的重要分子。ZHAO等^［13］研究显示：AKT磷酸化可刺激Cyclin D1的表达，引起EMT发生，增加肺癌细胞的侵袭转移。ZHENG等^［24］研究证实：VEGF能调节EMT进程和肺癌细胞的转移。HAN等^［25］研究发现：胃癌组织中Cyclin D1水平与VEGF mRNA和蛋白表达水平呈正相关关系。由此可见，上述蛋白之间彼此作用，共同促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移。但Cyclin D1、VEGF和EMT相关蛋白之间的相互关系还需要进一步研究。

综上所述， KIAA1522可能通过AKT信号通路促进肺癌细胞的EMT进程，并调节Cyclin D1和VEGF蛋白，从而增强肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。靶向KIAA1522及其下游蛋白有望成为肺癌治疗的新靶点。

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基金资助

吴阶平医学基金会研究基金项目(320.6750.2020-06-68)