草苁蓉环烯醚萜苷对大鼠肝脏癌前病变的抑制作用及其机制

Inhibitory effect of iridoid glycosides from Boschniakia rossica on hepatic preneolasia of rats and its mechanism

摘要

目的 研究草苁蓉环烯醚萜苷（IGBR）对大鼠肝脏癌前病变的防治作用，并阐明其可能的作用机制。 方法 选取30只Wistar大鼠，按照改良Solt-Faber法构建大鼠肝脏癌前病变模型。将制模成功后的大鼠随机分为假手术组、模型组和IGBR组，每组10只。取各组大鼠肝组织观察其形态表现，检测各组大鼠肝脏质量、肝脏指数和肝脏再生度，HE染色法观察各组大鼠肝组织病理形态表现，免疫组织化学法检测各组大鼠肝组织中谷胱甘肽-S-转移酶（GST）-Pi蛋白表达情况，比色法检测各组大鼠肝组织和肝线粒体中γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物岐化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和GST活性及丙二醛（MDA）水平，Western blotting法检测各组大鼠肝组织中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Ⅰ型胶原蛋白α1链（ColⅠα1）、基质金属蛋白酶（MMP）13、MMP2、组织金属蛋白酶抑制剂（TIMP）1、TIMP2、转化生长因子β1（TGF-β1）、TGF-β1受体（TβR）、抗DPP同源物（Smad）2/3、Smad4和Smad7蛋白表达水平。 结果 与假手术组比较，模型组大鼠肝脏质量和肝脏指数升高（P<0.05）；与模型组比较，IGBR组大鼠肝脏质量、肝脏指数和肝再生度均有下降趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。HE染色法，假手术组大鼠肝小叶结构完整清晰，肝细胞体积大、胞质丰富、嗜酸性，肝细胞以中央静脉为中心单行排列呈条索状向四周放射状排列，肝板间有不规则肝窦，仅于汇管区有少许胶原纤维存在和少量的炎症细胞浸润，肝细胞无变性坏死；模型组大鼠肝细胞失去正常排列，肝小叶结构消失，汇管区有以卵圆细胞为主的小细胞增生，纤维隔内有大量胶原沉积，有较明显纤维组织增生，肝细胞胞浆疏松，发生广泛的变性水肿，水样变性、气球样变性甚至灶状坏死，肝小叶中见增生的嗜碱性肝细胞形成细胞增生区，其细胞胞浆透亮，细胞核位于细胞中央，体积不大，染色质丰富，有1或2个明显核仁，肝小叶内还可见体积增大，细胞核和细胞浆着色浅而透明呈毛玻璃样的透明肝细胞灶；IGBR组大鼠肝小叶结构基本存在，可见肝细胞炎性病变减轻，水肿较轻，可见较多点状坏死或灶状坏死，核异型性大，可见病理性核分裂象或双核。免疫组织化学法，GST-Pi蛋白阳性灶为胞浆染色，呈棕黄色的圆形或类圆形结节；模型组大鼠肝组织中可观察到GST-Pi蛋白阳性灶，提示大鼠肝脏癌前病变模型制作成功。IGBR组大鼠肝组织中可观察到散在的GST-Pi蛋白阳性灶，较模型组明显减少。与假手术组比较，模型组大鼠肝组织中γ-GT活性升高（P<0.05）；与模型组比较，IGBR组大鼠肝组织中γ-GT活性降低（P<0.05）。与假手术组比较，模型组大鼠肝组织和肝线粒体中GST活性及MDA水平升高（P<0.05），SOD、CAT和GSH-Px活性降低（P<0.05）；与模型组比较，IGBR组大鼠肝组织和肝线粒体中GST活性及MDA水平降低（P<0.05），SOD、CAT和GSH-Px活性升高（P<0.05）。Western blotting法，与假手术组比较，模型组大鼠肝组织中α-SMA、ColⅠα1、TIMP1和TIMP2蛋白表达水平升高（P<0.05），MMP13和MMP2蛋白表达水平降低（P<0.05），TIMP1/MMP13和TIMP2/MMP2比值升高（P<0.05）；与模型组比较，IGBR组大鼠肝组织中α-SMA、ColⅠα1和TIMP2蛋白表达水平降低（P<0.05），MMP13和MMP2蛋白表达水平升高（P<0.05），TIMP1/MMP13和TIMP2/MMP2比值降低（P<0.05）。与假手术组比较，模型组大鼠肝组织中TGF-β1、Smad2/3和Smad4蛋白表达水平升高（P<0.05）；与模型组比较，IGBR组大鼠肝组织中TGF-β1、Smad2/3和Smad7蛋白表达水平降低（P<0.05）。 结论 IGBR对大鼠肝脏癌前病变和肝纤维化具有抑制作用，其机制可能与其增强肝组织抗氧化能力、抑制TGF-β/Smad信号通路及调控TIMP/MMP平衡有关。

Abstract

Objective To investigate the preventive and therapeutic effects of iridoid glycosides from Boschniakia rossica （IGBR） on precancerous lesions of liver cancer in rats， and to clarify its possible mechanism. Methods Thirty Wistar rats were selected and the precancerous liver lesion model was established using the modified Solt-Faber method. The rats were randomly divided into sham operation group， model group， and IGBR group， and there were 10 rats in each group. The morphology of liver tissue of the rats in various groups were observed； the liver weights， liver indexes and liver regeneration degrees of the rats in various groups were measured； HE staining was used to observe the pathomorphology of liver tissue of the rats in various groups； immunohistochemistry method was used to detect the expression of glutathione-S-transferase（GST）-Pi protein in liver tissue of the rats in various groups； colorimetric method was used to detect the activities of γ-glutamyl transpeptidase （γ-GT）， catalase （CAT）， superoxide dismutase （SOD）， glutathione peroxidase （GSH-Px） and glutathione S-transferase （GST）， and the level of malondialdehyde （MDA） in liver tissue and mitochondria of the rats in various groups； Western blotting method was used to detect the expression levels of α-smooth muscle actin （α-SMA）， collagen type Ⅰ alpha 1 chain （ColⅠα1）， matrix metalloproteinase （MMP） 13， MMP2， tissue inhibitor of metalloproteinase （TIMP） 1， TIMP2， transforming growth factor β1 （TGF-β1）， TGF-β1 receptor （TβR）， mothers against decapentaplegic homolog （Smad） 2/3， Smad4， and Smad7 proteins in liver tissue of the rats in various groups. Results Compared with sham operation group， the liver weight， liver index and degree of liver regeneration of the rats in model group were increased （P<0.05）； compared with model group， the liver weight and liver index of the rats in IGBR group showed a decreasing trend， but the difference was not statistically significant （P>0.05）. The HE staining results showed that the liver lobule structure in sham operation group was intact and clear， with large hepatocytes， abundant eosinophilic cytoplasm， and hepatocytes arranged in single cords radiating from the central vein； there were irregular hepatic sinusoids between plates， with only a small amount of collagen fibers and inflammatory cell infiltration in the portal area， and no degeneration or necrosis of hepatocytes. In model group， the normal arrangement of hepatocytes disappeared， the liver lobule structure was disrupted， small cell hyperplasia （mainly oval cells） was observed in the portal area， with massive collagen deposition and significant fibrous tissue hyperplasia in the fibrous septum； hepatocytes showed extensive degenerative edema， hydropic degeneration or even ballooning degeneration and focal necrosis； basophilic hepatocytes formed proliferative areas with clear cytoplasm， centrally located nuclei and 1-2 prominent nucleoli； glassy hepatocytes with enlarged nuclei and pale transparent cytoplasm were also observed. In IGBR group， the liver lobule structure was basically preserved， with reduced inflammatory lesions， mild edema， and scattered spotty or focal necrosis； nuclear atypia and pathological mitotic figures or binucleation were observed. The immunohistochemistry results showed GST-Pi protein positive foci with brown-yellow cytoplasmic staining in round or oval nodules. The GST-Pi protein positive foci were observed in liver tissue of the rats in model group， indicating successful establishment of precancerous liver lesion model. The scattered GST-Pi protein positive foci were observed in IGBR group， which were significantly reduced compared with model group. Compared with sham operation group， the activity of γ-GT in liver tissue of the rats in model group was increased （P<0.05）； compared with model group， the activity of γ-GT in liver tissue of the rats in IGBR group was decreased （P<0.05）. Compared with sham operation group， the GST activity and MDA level in liver tissue and liver mitochondria of the rats in model group were increased （P<0.05）， while the activities of SOD， CAT， and GSH-Px were decreased （P<0.05）； compared with model group， the GST activity and MDA level in liver tissue and liver mitochondria of the rats in IGBR group were decreased （P<0.05）， while the activities of SOD， CAT， and GSH-PX were increased （P<0.05）. The Western blotting results showed that compared with sham operation group， the expression levels of α-SMA， ColⅠα1， TIMP1， and TIMP2 proteins in liver tissue of the rats in model group were increased （P<0.05）， while the expression levels of MMP13 and MMP2 proteins were decreased （P<0.05）， and the ratios of TIMP1/MMP13 and TIMP2/MMP2 were increased （P<0.05）； compared with model group， the expression levels of α-SMA， ColⅠα1， and TIMP2 proteins in liver tissue of the rats in IGBR group were decreased （P<0.05）， while the expression levels of MMP13 and MMP2 proteins were increased （P<0.05）， and the ratios of TIMP1/MMP13 and TIMP2/MMP2 were decreased （P<0.05）. Compared with sham operation group， the expression levels of TGF-β1 and Smad2/3 proteins in liver tissue of the rats in model group were increased （P<0.05）； compared with model group， the expression levels of TGF-β1， Smad2/3 and Smad 4 proteins in liver tissue of the rats in IGBR group were decreased （P<0.05）. Conclusion IGBR can inhibit precancerous liver lesions and liver fibrosis in rats， and its mechanism may be related to enhancing the antioxidant capacity of liver tissue， inhibiting TGF-β/Smad signaling pathway and regulating TIMP/MMP balance.

Graphical abstract

关键词

草苁蓉环烯醚萜苷 / 肝脏癌前病变 / 肝纤维化 / 转化生长因子β1 / 超氧化物岐化酶

Key words

Iridoid glycosides from Boschniakia rossica / Precancerous liver lesions / Liver fibrosis / Transforming growth factor-β1 / Superoxide dismutase

原发性肝癌简称肝癌，是临床上最常见的恶性肿瘤之一，我国是肝癌的高发国家，肝炎和肝硬化并发肝癌的发生率占肝癌患者总数的80%以上^［1-3］。因此，对肝癌高危人群采取针对性的预防措施极为重要^［3］。肝癌前病变是肝硬化发展到肝癌的必经病理过程^［4-5］。目前公认的最好预防方法是抑制肝癌前病变细胞演变成肝癌细胞或使其逆转成正常肝细胞^［4-5］。中医药因在阻断或逆转肝癌及癌前病变方面显现出很好的防治作用而日益受到重视，目前已成为肝癌防治研究的重点^［5-7］。草苁蓉为列当科植物，分布于我国东北长白山、内蒙古高山、日本富士山和朝鲜北部山区和俄罗斯部分地区^［8-9］。中医认为草苁蓉性味甘、酸、湿，主治肾虚阳痿、腰膝冷痛、崩漏带下和膀胱炎等症，具有延缓衰老、精气旺盛及滋补强身的作用，故在民间被誉为“不老草”^［8-9］。据文献^［10-12］报道：草苁蓉具有抗炎、保肝、抗疲劳、促进记忆和提高机体免疫功能以及清除自由基和抗脂质过氧化等作用，对肺癌、胃肠道肿瘤、肝癌和皮肤癌等也具有防治作用。草苁蓉环烯醚萜苷（irioid glycosides from Boschniakia rossica，IGBR）是草苁蓉抗癌的有效成分，体外可诱导肝癌细胞凋亡，体内可抑制肝癌H22移植瘤生长，对大鼠肝脏癌前病变和肝癌发生也有显著抑制作用^［13-16］。研究^［12］显示：IGBR可抑制转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β1介导的肝癌细胞上皮-间质转化过程，从而减弱肝癌细胞迁移和侵袭能力。研究^［17］显示：TGF-β/抗DPP同源物（mothers against decapentaplegic homolog，Smad）信号通路在多种组织器官的创伤愈合和纤维化病变中起重要作用，但IGBR抗肝癌癌前病变作用能否可通过TGF-β/Smad信号通路抑制肝纤维化而实现尚未明确，本实验采用改良Solt-Faber法构建大鼠肝脏癌前病变模型，探讨IGBR对肝脏癌前病变的抑制作用及其可能的作用机制，为IGBR在肝癌防治中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1　实验动物、主要试剂和仪器

雄性Wistar大鼠，体质量150~180 g（6~8周龄），动物生产许可证号：SCXK（吉）2017-0003，由延边大学实验动物中心提供。IGBR由延边大学医学院尹宗柱教授惠赠，主要由草苁蓉纳拉苷（49%）和7-脱氧表马钱子酸（30%）组成^［12］。二乙基亚硝胺（diethylnitrosamine，DEN）和乙酰氨基芴（acetylaminofluorene，AAF）购自美国Sigma-Aldrich公司，γ-谷酰胺转肽酶（γ-glutamyl transpeptidase，γ-GT）、谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione-S-transferase，GST）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、过氧化氢酶（catalase，CAT）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试制盒购自南京建成生物工程研究所，GST-Pi抗体购自南京凯基生物科技发展有限公司，β-actin抗体购自美国ABclonal公司， α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、Ⅰ型胶原蛋白α1（collagen type Ⅰ alpha 1，ColⅠα1）、基质金属蛋白酶（metrix metalloproteinase，MMP）13、MMP2、组织金属蛋白酶抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）1、TIMP2、TGF-β1、TGF-β1受体 （transforming growth factor β receptor，TβR）Ⅰ、TβRⅡ、Smad2/3、Smad4和Smad7抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG购自美国Merck公司。垂直板电泳仪（型号：164-5051）购自美国Bio-Rad公司，化学发光成像系统购自美国Azure Biosystems公司。

1.2　实验动物分组和处理

30只大鼠随机分为假手术组、模型组和IGBR组，按改良Solt-Farber法构建大鼠肝脏癌前病变模型^［16］。模型组大鼠腹腔注射200 mg·kg^-1 DEN，第3周末行肝脏70%切除术，第3周开始饲喂含0.008% AAF的饲料至第8周；IGBR组大鼠腹腔注射200 mg·kg^-1 DEN，第3周末行肝脏70%切除术，第3周开始饲喂含0.008% AAF和250 mg·kg^-1 IGBR的饲料；假手术组大鼠则以生理盐水代替DEN注射，第3周末施行肝脏70%切除术，饲喂正常饲料饲养至第8周。第8周末处死各组大鼠，留取肝组织标本。将部分大鼠肝组织（含结节）制作石蜡切片，其余肝组织（含结节）置于-80 ℃冰箱备用。

1.3　各组大鼠肝脏指数和肝再生度检测

采集大鼠肝组织，计算肝脏指数和肝再生度。肝脏指数=肝脏质量/大鼠体质量×100%；肝再生度=［B-（A/b-A）］/A，其中A为切除两叶后肝质量，B为再生后肝质量，b为切除两叶肝质量与全肝质量之比，本研究中b取值0.7^［18］。

1.4　HE染色法观察各组大鼠肝组织病理形态表现

将各组大鼠肝组织（含结节）固定于4%多聚甲醛中，石蜡包埋并制作切片。常规HE染色，在光镜下观察各组大鼠肝组织病理形态表现。

1.5　免疫组织化学法检测各组大鼠肝组织中GST-Pi蛋白表达水平

将石蜡切片进行常规脱蜡、抗原热修复、封闭后GST-Pi抗体孵育过夜，二抗孵育后显色。采用半定量分析计算各组大鼠肝组织中GST-Pi蛋白的免疫组织化学评分，以免疫组织化学评分代表GST-Pi蛋白表达水平。

1.6　试剂盒法检测各组大鼠肝组织和肝线粒体中γ-GT、GST、SOD、CAT和GSH-Px活性及MDA水平

取适量大鼠肝组织，制备肝组织匀浆，并提取肝线粒体。按试剂盒操作法测定各组大鼠肝组织和肝线粒体中γ-GT、GST、SOD、CAT和GSH-Px活性及MDA水平。

1.7　Western blotting法检测各组大鼠肝组织中凋亡、纤维化相关蛋白和TGF-β1/Smad通路蛋白表达水平

称取大鼠肝组织，加入裂解液裂解并提取蛋白。与上样缓冲液混合、加热变性后行SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜，4 ℃封闭过夜。与相应一抗和二抗孵育、显色。采用Image J软件分析蛋白条带灰度值，计算蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参β-actin蛋白条带灰度值。

1.8　统计学分析

采用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析。各组大鼠体质量，肝质量，肝脏指数，肝再生度，肝组织和肝线粒体中γ-GT、GST、SOD、CAT和GSH-Px活性及MDA水平，肝组织中凋亡、纤维化相关蛋白和TGF-β1/Smad通路蛋白表达水平均符合正态分布且方差齐，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　各组大鼠肝脏外观形态表现、肝脏指数和肝再生度

假手术组大鼠体质量稳定增加，在实验期内无死亡；模型组大鼠精神萎靡，反应迟钝，分别在行肝部分切除术后第1周和第7周各死亡1只；IGBR组大鼠毛色较模型组光润，各组大鼠体质量比较差异无统计学意义（P>0.05）。假手术组大鼠肝脏表面光滑，色淡红，边缘锐利，质地中等；模型组大鼠肝脏表面凹凸不平，色紫红，质地硬，可见直径不等的散在灰白色结节，最大直径为3 mm，切面可见结节为出血坏死的肿瘤灶；IGBR组大鼠肝脏较模型组表面光滑、边缘钝，灰白色结节数较模型组少，直径为0.1~0.6 mm。见图1。与假手术组比较，模型组大鼠肝脏质量和肝脏指数升高（P<0.05）；与模型组比较，IGBR组大鼠肝脏质量和肝脏指数有下降趋势，但组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。与假手术组比较，模型组大鼠肝再生度有升高趋势；IGBR组大鼠肝再生度有下降趋势，但组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2　各组大鼠肝组织病理形态表现

HE染色结果显示：假手术组大鼠肝小叶结构完整清晰，肝细胞体积大、胞质丰富、嗜酸性，肝细胞以中央静脉为中心单行排列，呈条索状向四周放射状排列，肝板间有不规则肝窦，仅于汇管区有少许胶原纤维存在和少量的炎症细胞浸润，肝细胞无变性坏死。模型组大鼠肝细胞失去正常排列，肝小叶结构消失，汇管区有以卵圆细胞为主的小细胞增生，纤维隔内有大量胶原沉积，有较明显纤维组织增生；肝细胞胞浆疏松，发生广泛的变性水肿，水样变性、气球样变性甚至灶状坏死，肝小叶中见增生的嗜碱性肝细胞形成细胞增生区，其细胞胞浆透亮，细胞核位于细胞中央，体积不大，染色质丰富，有1或2个明显的核仁，肝小叶内还可见体积增大，细胞核和细胞胞浆着色浅而透明呈毛玻璃样的透明肝细胞灶，2种细胞混合排列拥挤形成肝细胞增生结节；IGBR组大鼠肝小叶结构基本存在，可见肝细胞炎性病变减轻，水肿较轻，可见较多点状坏死或灶状坏死，核异型性大，可见病理性核分裂象或双核。见图2。

2.3　各组大鼠肝组织中GST-Pi蛋白表达情况

免疫组织化学法检测结果显示：GST-Pi蛋白阳性灶为胞浆染色，为棕黄色的圆形或类圆形结节。模型组大鼠肝组织中可观察到GST-Pi蛋白阳性灶，提示肝癌前病变模型制作成功。IGBR组大鼠肝组织中可观察到散在的GST-Pi蛋白阳性灶，较模型组明显减少。见图3。

2.4　各组大鼠肝组织和肝线粒体中γ-GT、GST、SOD、CAT和GSH-Px活性及MDA水平

与假手术组比较，模型组大鼠肝组织中γ-GT活性升高（P<0.05）；与模型组比较，IGBR组大鼠肝组织中γ-GT活性降低（P<0.05）。与假手术组比较，模型组大鼠肝组织和肝线粒体中GST活性升高（P<0.05），SOD活性降低（P<0.05），CAT和GSH-Px活性降低（P<0.05），MDA水平升高（P<0.05）；与模型组比较，IGBR组大鼠肝组织和肝线粒体中GST活性及MDA水平降低（P<0.05），SOD、CAT和GSH-Px活性升高（P<0.05）。见表2和3。

2.5　各组大鼠肝组织中肝纤维化相关蛋白表达水平

与假手术组比较，模型组大鼠肝组织中α-SMA、ColⅠα1、TIMP1和TIMP2蛋白表达水平升高（P<0.05），MMP13和MMP2蛋白表达水平降低（P<0.05），TIMP1/MMP13和TIMP2/MMP2比值升高（P<0.05）；与模型组比较，IGBR组大鼠肝组织中α-SMA、ColⅠα1和TIMP2蛋白表达水平降低（P<0.05），MMP13和MMP2蛋白表达水平升高（P<0.05），TIMP1/MMP13和TIMP2/MMP2比值降低（P<0.05）。见图4。

2.6　各组大鼠肝组织中TGF-β/Smad信号通路蛋白表达水平

与假手术组比较，模型组大鼠肝组织中TGF-β1、Smad2/3和Smad4蛋白表达水平升高（P<0.05），Smad7蛋白表达水平降低（P<0.05）；与模型组比较，IGBR组大鼠肝组织中TGF-β1、Smad2/3和Smad7蛋白表达水平降低（P<0.05），IGBR组大鼠肝组织中Smad4和Smad7蛋白表达水平差异均无统计学意义（P>0.05）。3组大鼠肝组织中TβRⅠ和TβRⅡ蛋白表达水平比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见图5。

3 讨 论

肝癌的发生可分为启动、促进和演进3个阶段，启动阶段通常由病毒和化学致癌物等引起，肝细胞已发生很多酶学改变；在促癌因素持续作用下，进入促进阶段即“癌前病变”阶段，此时已启动的肝细胞进一步增生变为癌前病变细胞；在特定的环境作用下只有少数肝细胞可继续不典型增生，逐渐显现癌细胞特点，进而演变成肝癌^{［16，19］}。肝脏癌前病变是指从肝脏出现炎症、水肿、结节到纤维化的演进过程，主要表现为肝细胞非典型增生^［19-20］。改良Solt-Faber模型，即DEN启动、AAF促癌和联合肝部分切除手术而构建的大鼠肝脏癌前病变模型，除了不典型增生灶外，还有一个典型特征——纤维化病变，与人体肝癌发生过程较为相似^［19-20］。该模型具有良好的专一性和较高的成功率，以γ-GT和GST-Pi升高为重要标志^{［16，19-20］}。本实验末期观察到模型组大鼠肝脏表面有散在灰白色结节，凹凸不平、质地较硬，且GST-Pi蛋白阳性灶增多，γ-GT活性增高，均与诸多报道^［19-20］一致；IGBR处理后可逆转上述病变及指标，提示IGBR对大鼠肝癌前病变具有抑制作用。研究^{［16，19］}显示：自由基的产生和消除失衡与肿瘤的发生发展存在一定关联，自由基诱癌、促癌和致癌作用基本上已被肯定。本研究中肝脏癌前病变大鼠肝组织抗氧化活性降低，而IGBR干预后SOD、CAT和GSH-Px活性均升高，MDA水平降低，表明IGBR可能是通过清除自由基，防止脂质过氧化，提高肝组织抗氧化能力，从而延缓大鼠肝癌前病变的发生发展。

本研究制备Solt-Farber大鼠模型以肝脏纤维化和瘤性结节形成作为特征，因此检测了大鼠肝纤维化的标志性指标α-SMA和胶原蛋白。研究^［17］显示：α-SMA表达上调提示肝星状细胞活化，而肝星状细胞活化是肝纤维化形成的中心驱动因素。MMP是内源性蛋白水解酶，可降解纤维蛋白和胶原蛋白等细胞外基质； TIMP是MMP特异性抑制因子；TIMP/MMP比值是体现基质沉积和降解的重要指标^［21-22］。肝组织中TIMP主要为TIMP1和TIMP2，分别与MMP13和MMP2特异性结合，因此，细胞外基质的代谢主要与TIMP1/MMP13和TIMP2/MMP2平衡有关^［21-22］。本研究结果显示：模型组大鼠肝组织中α-SMA和ColⅠ蛋白表达水平及TIMP1/MMP13和TIMP2/MMP2比值升高，而IGBR干预后大鼠肝组织中α-SMA和ColⅠ蛋白表达水平及TIMP1/MMP13和TIMP2/MMP2比值降低，提示IGBR可通过调控TIMP/MMP平衡抑制大鼠肝脏纤维化进程。研究^［23-24］显示：草苁蓉和IGBR可通过抑制肝星状细胞的活化来抑制肝纤维化的发生，与本研究结果一致。

TGF-β1是激活肝星状细胞的重要始动因子，是迄今发现的最强细胞外基质沉积促进剂，是抑制MMP表达的重要转录因子^{［17，25-26］}。各种致病因素所致的持续的肝实质炎症和坏死发生时，TGF-β1可使肝星状细胞活化、合成并分泌大量胶原纤维等细胞外基质，造成其过度沉积和降解活性不足，导致纤维结缔组织大量增生，从而促进肝纤维化的发生^{［17，25-26］}。本研究结果显示：模型组大鼠肝脏癌前病变组织中TGF-β1和Smad2/3蛋白表达水平升高，提示TGF-β/Smad信号通路被激活；IGBR处理后TGF-β1和Smad2/3蛋白表达水平降低，提示IGBR可通过抑制TGF-β/Smad信号通路调控TIMP/MMP平衡，最终实现对大鼠肝脏纤维化的抑制作用，表明IGBR延缓大鼠肝癌前病变作用可能与其抑制TGF-β/Smad信号通路介导的肝脏纤维化有关。

综上所述，IGBR对大鼠肝脏癌前病变和肝纤维化具有抑制作用，其机制可能与其增强肝组织抗氧化能力、抑制TGF-β/Smad信号通路及调控TIMP/MMP平衡有关。

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基金资助

国家自然科学基金项目(82060113)

国家自然科学基金项目(81760659)