多重耐药铜绿假单胞菌群体感应相关基因表达及其对生物膜形成和耐药性的影响

摘要

目的：探讨临床多重耐药铜绿假单胞菌群体感应相关基因表达对生物膜形成和耐药性的影响，阐明耐药性增加的机制。方法：收集77株铜绿假单胞菌，根据其耐药性将菌株分为多重耐药组和敏感组，微孔板法构建生物膜筛选最佳形成条件，采用光学显微镜观察2组铜绿假单胞菌生物膜形成情况，结晶紫染色半定量法检测2组铜绿假单胞菌生物膜形成能力，微量肉汤稀释法检测2组铜绿假单胞菌对群体感应抑制剂呋喃酮（C-30）的最低抑菌浓度（MIC）值，试剂盒法提取2组铜绿假单胞菌的RNA，改良TRIzol法提取2组铜绿假单胞菌中多重耐药组浮游态和生物膜态RNA，实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测2组以及加入C-30抑制剂前后铜绿假单胞菌中lasR/I、RhlR/I和PqsR/A mRNA表达水平。结果：77株铜绿假单胞菌标本中有56株多重耐药株（多重耐药组），21株全敏感株（敏感组）。构建生物膜最佳条件，当铜绿假单胞菌浓度为1.5×10～8 CFU·mL^-1、培养时间为48 h时生物膜形成量最多；77株铜绿假单胞菌标本的生物膜阳性率为91%，其中生物膜强阳性、中等阳性、弱阳性和阴性分别占16%、34%、41%及9%，多重耐药株的生物膜阳性率为96%，且多重耐药组的生物膜形成能力高于敏感组（P<0.05）。当群体感应抑制剂C-30的浓度为8 mg·L^-1时，可抑制多数铜绿假单胞菌生物膜的形成，且浓度越高，抑制作用越明显；浮游态RNA和生物膜态RNA的吸光度（A）值在1.8～2.0。RT-qPCR法，与浮游态比较，生物膜态的铜绿假单胞菌重群体感应相关基因lasR/I、RhlR/I和PqsR/A mRNA表达水平升高（P<0.01）；与未加抑制剂组比较，加入抑制剂组铜绿假单胞菌中生物膜态的群体感应相关基因lasR/I、RhlR/I和PqsR/A mRNA表达水平降低（P<0.01）。结论：多重耐药铜绿假单胞菌的群体感应相关基因高表达会促进生物膜的形成，从而导致耐药性增加。

关键词

铜绿假单胞菌 / 生物膜 / 群体感应系统 / 实时荧光定量PCR / 耐药性