藏红花醛对体外高糖诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖、迁移和表型转变的抑制作用

摘要

目的：探讨高糖诱导的藏红花醛对大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖、迁移和表型转化的影响，阐明藏红花醛在糖尿病（DM）血管病变防治中的作用。方法：选择SD大鼠作为实验对象，取大鼠胸主动脉原代培养VSMCs，分为对照组、25 mmol·L^-1高糖（HG）组和HG+20、40和80μmol·L^-1藏红花醛组。对照组VSMCs不进行处理，25 mmol·L^-1 HG组VSMCs给予25 mmol·L^-1HG预处理，HG+20、40和80μmol·L^-1藏红花醛组VSMCs在25 mmol·L^-1 HG组处理的基础上再分别用20、40和80μmol·L^-1藏红花醛进行48 h干预。采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法确定藏红花醛合适浓度并检测各组VSMCs存活率，细胞划痕愈合实验检测各组VSMCs划痕愈合率，Transwell小室实验检测各组VSMCs迁移细胞数，免疫荧光法检测各组VSMCs中α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和兔抗骨桥蛋白（OPN）荧光强度，Western blotting法检测各组VSMCs中OPN、α-SMA和增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白表达水平。结果：显微镜下可见，体外培养4 d时，胸主动脉组织块边缘有梭形或三角形细胞爬出，其中长梭形为最常见的形态；第14天时细胞逐渐铺满皿底，当细胞密度达到80%～90%时，出现标志性的“谷峰状”生长状态。取第3代细胞进行免疫荧光法鉴定，采用VSMCs特异性标记物α-SMA蛋白进行细胞免疫荧光染色，原代培养VSMCs中α-SMA蛋白均表达为阳性。CCK-8实验，与对照组比较，160μmol·L^-1藏红花醛组VSMCs活性明显降低（P<0.01），即对VSMCs产生了毒性损伤。20、40和80μmol·L^-1藏红花醛干预48 h后，VSMCs活性无明显变化，综合考虑藏红花醛的作用效果和毒性后，采用上述3个浓度藏红花醛用于后续的细胞实验。经过48 h的干预，与对照组比较，25 mmol·L^-1 HG组VSMCs活性升高（P<0.001）；与25 mmol·L^-1 HG组比较，HG+20、40和80μmol·L^-1藏红花醛组VSMCs活性降低（P<0.05）。细胞划痕愈合实验和Transwell小室实验，干预48 h后，25 mmol·L^-1 HG组VSMCs划痕愈合率明显高于对照组（P<0.01），穿过Transwell小室的穿膜细胞数明显增多（P<0.05）；与25μmol·L-1 HG组比较，HG+20、40和80μmol·L^-1藏红花醛组VSMCs划痕愈合率降低（P<0.05），穿膜细胞数减少（P<0.05）。免疫荧光染色，与对照组比较，25 mmol·L^-1 HG组VSMCs中α-SMA蛋白荧光强度明显减弱（P<0.001），而OPN蛋白荧光强度明显增强（P<0.001）；与25 mmol·L^-1 HG组比较，HG+20、40和80μmol·L^-1藏红花醛组VSMCs中α-SMA蛋白荧光强度逐渐增加（P<0.05）,OPN蛋白荧光强度逐渐减弱（P<0.05）。Western blotting法，与对照组比较，25 mmol·L^-1 HG组VSMCs中α-SMA蛋白表达水平降低（P<0.05）,PCNA和OPN蛋白表达水平升高（P<0.01）；与25 mmol·L^-1 HG组比较，HG+20、40和80μmol·L^-1藏红花醛组VSMCs中α-SMA蛋白表达水平升高（P<0.05）,PCNA和OPN蛋白表达水平降低（P<0.05）。结论：藏红花醛能够抑制高糖诱导的大鼠VSMCs的增殖、迁移和表型转换。

关键词

糖尿病 / 血管病变 / 胸主动脉平滑肌细胞 / 细胞迁移 / 细胞增殖