脂肪源性干细胞诱导分化的施万样细胞中神经生长因子高表达对大鼠背根神经节细胞突起生长的促进作用

摘要

目的：探讨脂肪源性干细胞（ADSCs）诱导分化的施万样细胞（SCLCs）高表达的神经生长因子（NGF）对大鼠背根神经节（DRG）细胞突起生长的促进作用，并阐明其作用机制。方法：从SD大鼠附睾旁脂肪中提取ADSCs，通过成骨诱导、成脂诱导和成软骨诱导鉴定ADSCs的多向分化能力。将ADSCs诱导分化为SCLCs，并通过免疫荧光法和Western blotting法检测ADSCs和SCLCs中胶质纤维酸性蛋白（GFAP）及S100钙结合蛋白β(S100β)表达水平。分离培养大鼠DRG细胞，采用免疫荧光法检测DRG细胞中Ⅲ类β微管蛋白（βⅢ-tubulin）以鉴定DRG细胞。将SCLCs与DRG细胞共培养（共培养组），DRG细胞单独培养作为DRG组。利用甲苯胺蓝染色在光学显微镜下观察并测量共培养组和DRG组细胞的突起长度。采用小干扰RNA(siRNA)转染技术敲低NGF，质粒转染技术过表达NGF，实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测各组细胞中NGF mRNA表达水平，酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测各组细胞上清中NGF蛋白表达水平。将转染后的SCLCs与DRG细胞共培养，分为对照组、siNC/vector组、NGF敲低组（si-NGF组）和NGF过表达组（oe-NGF组），观察各组DRG细胞突起的长度。结果：原代ADSCs接种24 h后基本贴壁并留有少量脂滴，培养3 d后细胞多为短梭形、纺锤状或多角形，呈旋涡状生长，增长迅速，传代后细胞形态均一，呈长梭形，鱼群状排列。ADSCs经成脂诱导培养基培养14 d后，细胞形态由梭形变为扁圆形，中间可见透亮的圆形脂滴形成，经油红O染色可见细胞质中的脂滴被染成红色。ADSCs经成骨诱导培养基培养28 d后可见细胞呈沙粒样，形态模糊，出现钙化结节，经茜素红染色后可见钙化结节被红染，沉积在细胞外基质。ADSCs经成软骨诱导培养基立体培养28 d后可见小米粒大小的软骨球生成，对软骨球进行冰冻切片，阿利辛蓝染色后显微镜下可见软骨组织中的酸性黏多糖被染色成蓝色。在荧光显微镜下观察纯化后第3代ADSCs，可见被异硫氰酸荧光素（FITC）标记为绿色荧光的CD29蛋白表达阳性、被Cy3标记为红色荧光CD44蛋白表达阳性。免疫荧光法，可见GFAP被FITC标记为绿色荧光，S100β被Cy3标记为红色荧光。Western blotting法，与ADSCs比较，SCLCs高表达S100β和GFAP蛋白。原代提取的DRG细胞常规培养6 h后开始贴壁，培养3 d后细胞胞体发亮呈圆形，胞体发出两条线状突起。荧光显微镜下观察，细胞中神经元特异性标志物βⅢ-tubulin呈阳性表达，表明分离提取的细胞为DRG细胞。与ADSCs比较，SCLCs中NGF蛋白表达水平升高（P<0.05）。与DRG组比较，DRG细胞与SCLCs以1∶2比例接种时，共培养组DRG细胞突起长度最高（P<0.05）。RT-qPCR法，与si-NC组比较，si-NGF-1、si-NGF-2和si-NGF-3组细胞中NGF m RNA表达水平明显降低（P<0.05），且si NGF-1敲低效率最好，后续将采用si-NGF-1进行实验。ELISA法，与si-NC组比较，si-NGF-1、si-NGF-2和si-NGF-3组细胞上清中NGF水平均降低（P<0.05）。与vector组比较，oe-NGF组细胞中NGF m RNA表达水平升高（P<0.05），细胞上清中NGF水平升高（P<0.05）。与对照组和si NC/vector组比较，si NGF组DRG细胞突起长度缩短（P<0.05）,oe-NGF组DRG细胞突起长度增加（P<0.01）。结论：ADSCs可以定向分化为SCLCs，且分化后的细胞高表达NGF；敲低或过表达NGF可影响DRG细胞突起的生长。

关键词

施万样细胞 / 神经生长因子 / 背根神经节细胞 / 脂肪源性干细胞 / 周围神经损伤