基于转录组测序的蓖麻毒素诱导巨噬细胞焦亡中氧化应激相关基因及环状RNA表达谱分析

摘要

目的：利用转录组测序及生物信息学技术，分析鉴定蓖麻毒素（RT）诱导小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7）焦亡中与氧化应激相关的基因和环状RNA（circRNA）表达谱，并初步分析其潜在功能。方法：使用RT处理单核巨噬细胞（RAW264.7细胞）构建细胞焦亡模型，分为对照组、40μg·L^-1 RT组和80μg·L^-1 RT组。采用透射电镜观察各组RAW264.7细胞形态表现，Western blotting法检测各组细胞中细胞焦亡通路中蛋白表达水平，选择80μg·L^-1 RT进行后续实验，利用转录组测序技术（RNA-Seq）获得对照组和RT组RAW264.7细胞中circRNA表达谱及mRNA表达谱，并进行生物信息学分析。结果：与对照组比较，40和80μg·L^-1 RT组细胞均发生形态改变，细胞呈现出明显焦亡样形态改变，表现为濒死细胞出现明显肿胀，质膜上出现特征性的大气泡。与对照组比较，40和80μg·L^-1 RT组中消皮素D N端结构域（GSDMD-N）蛋白表达水平升高（P<0.05），与40μg·L^-1RT组比较，80μg·L^-1 RT组细胞中GSDMD-N蛋白表达水平升高（P<0.05），故后续实验RT浓度选取80μg·L^-1。共鉴定出差异表达信使RNA（mRNA） 2 930个，差异表达circRNA 24个。构建的circRNA-微小RNA（miRNA）-mRNA竞争性内源RNA（ceRNA）调控网络由7个circRNAs、12个miRNA和13个mRNA组成。基因本体论（GO）功能富集分析，在生物过程（BP）中差异表达基因所调节的功能主要有免疫反应和氧化应激反应等；在细胞组分（CC）中差异表达基因主要定位于质膜外侧和细胞前缘；在分子功能（MF）中主要参与转运体跨膜活性和激素受体结合等。京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析，差异表达基因主要富集于Toll样受体信号通路、叉头框蛋白O（FoxO）信号通路和核因子κB（NF-κB）信号通路。蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络，通过CytoHubba筛选出基质金属蛋白酶9（MMP9）、超氧化物歧化酶2（SOD2）和鸡肉瘤病毒基因（Src）等前10位连接度最高的Hub基因。结论：RT处理后RAW264.7细胞中氧化应激相关基因和circRNA表达谱发生变化，筛选得到的差异表达circRNA和mRNA可能作为潜在靶点通过氧化应激途径调控RT诱导的RAW264.7细胞焦亡。

关键词

蓖麻毒素 / 细胞焦亡 / 氧化应激 / 环状RNA / 竞争性内源RNA