基于转录组测序的蓖麻毒素诱导巨噬细胞焦亡中氧化应激相关基因及环状RNA表达谱分析

Transcriptome sequencing-based expression profiling of oxidative stress-related genes and circRNAs in ricin toxin-induced macrophage pyroptosis

摘要

目的 利用转录组测序及生物信息学技术，分析鉴定蓖麻毒素（RT）诱导小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7）焦亡中与氧化应激相关的基因和环状RNA（circRNA）表达谱，并初步分析其潜在功能。 方法 使用RT处理单核巨噬细胞（RAW264.7细胞）构建细胞焦亡模型，分为对照组、40 μg·L^-1 RT组和80 μg·L^-1 RT组。采用透射电镜观察各组RAW264.7细胞形态表现，Western blotting法检测各组细胞中细胞焦亡通路中蛋白表达水平，选择80 μg·L^-1 RT进行后续实验，利用转录组测序技术（RNA-Seq）获得对照组和RT组RAW264.7细胞中circRNA表达谱及mRNA表达谱，并进行生物信息学分析。 结果 与对照组比较，40和80 μg·L^-1 RT组细胞均发生形态改变，细胞呈现出明显焦亡样形态改变，表现为濒死细胞出现明显肿胀，质膜上出现特征性的大气泡。与对照组比较，40和80 μg·L^-1 RT组中消皮素D N端结构域（GSDMD-N）蛋白表达水平升高（P<0.05），与40 μg·L^-1 RT组比较，80 μg·L^-1 RT组细胞中GSDMD-N蛋白表达水平升高（P<0.05），故后续实验RT浓度选取80 μg·L^-1。共鉴定出差异表达信使RNA（mRNA）2 930个，差异表达circRNA 24个。构建的circRNA-微小RNA（miRNA）- mRNA竞争性内源RNA（ceRNA）调控网络由7个circRNAs、12个miRNA和13个mRNA组成。基因本体论（GO）功能富集分析，在生物过程（BP）中差异表达基因所调节的功能主要有免疫反应和氧化应激反应等；在细胞组分（CC）中差异表达基因主要定位于质膜外侧和细胞前缘；在分子功能（MF）中主要参与转运体跨膜活性和激素受体结合等。京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析，差异表达基因主要富集于Toll样受体信号通路、叉头框蛋白O（FoxO）信号通路和核因子κB（NF-κB）信号通路。蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络，通过CytoHubba筛选出基质金属蛋白酶9（MMP9）、超氧化物歧化酶2（SOD2）和鸡肉瘤病毒基因（Src）等前10位连接度最高的Hub基因。 结论 RT处理后RAW264.7细胞中氧化应激相关基因和circRNA表达谱发生变化，筛选得到的差异表达circRNA和mRNA可能作为潜在靶点通过氧化应激途径调控RT诱导的RAW264.7细胞焦亡。

Abstract

Objective To analyze and identify the expression profiles of oxidative stress-related genes and circular RNAs （circRNAs） in ricin toxin （RT）-induced pyroptosis of mouse mononuclear macrophages （RAW264.7） using transcriptome sequencing and bioinformatics technology， and to preliminarily analyze their potential functions. Methods The macrophages （RAW264.7 cells） were treated with RT to establish a cell pyroptosis model and divided into control group， 40 μg·L^-1 RT group， and 80 ng/mL RT group. Transmission electron microscope （TEM） was used to observe the morphology of the RAW264.7 cells in various groups； Western blotting method was used to detect the expression levels of the pyroptosis pathway-related proteins in the cells in various groups； 80 μg·L^-1 RT was selected for subsequent experiments. Transcriptome sequencing （RNA-Seq） was performed to obtain the circRNA and mRNA expression profiles in the RAW264.7 cells in control group and RT-treated group， followed by bioinformatics analysis. Results Compared with control group， the cells in 40 and 80 μg·L^-1 RT groups underwent morphological changes； the cells in RT groups showed obvious pyroptosis-like morphological changes， characterized by significant swelling of dying cells and the appearance of characteristic large bubbles on the plasma membrane. Compared with control group， the expression level of gasdermin DN-terminal fragment （GSDMD-N） protein in 40 and 80 μg·L^-1 RT groups was increased （P<0.05）； compared with 40 μg·L^-1 RT group， the expression level of GSDMD-N protein in the cells in 80 μg·L^-1 RT group was increased （P<0.05）； therefore， the subsequent experiments used the RT concentration of 80 μg·L^-1. A total of 2930 differentially expressed messenger RNAs （mRNAs） and 24 differentially expressed circRNAs were identified. The constructed circRNA-microRNA （miRNA）-mRNA competing endogenous RNA （ceRNA） regulatory network consisted of 7 circRNAs， 12 miRNAs and 13 mRNAs. Gene Ontology （GO） functional enrichment analysis showed that in biological process （BP）， the functions regulated by differentially expressed genes mainly included immune response and oxidative stress response； in cellular component （CC）， differentially expressed genes were mainly localized to the external side of plasma membrane and cell leading edge； in molecular function （MF）， they were mainly involved in transporter transmembrane activity and hormone receptor binding. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） pathway enrichment analysis showed that differentially expressed genes were mainly enriched in Toll-like receptor signaling pathway， Forkhead box O（FoxO） signaling pathway and nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells （NF-κB） signaling pathway. In the protein-protein interaction （PPI） network， the top 10 hub genes with the highest connectivity were screened by CytoHubba， including matrix metalloproteinase 9 （MMP9）， superoxide dismutase 2 （SOD2）， and v-src sarcoma viral oncogene homolog （Src）. Conclusion The expression profiles of oxidative stress-related genes and circRNAs in RAW264.7 cells are altered after RT treatment. The screened differentially expressed circRNAs and mRNAs may serve as potential targets to regulate RT-induced pyroptosis in RAW264.7 cells through oxidative stress pathways.

Graphical abstract

关键词

蓖麻毒素 / 细胞焦亡 / 氧化应激 / 环状RNA / 竞争性内源RNA

Key words

Ricin toxin / Pyroptosis / Oxidative stress / Circular RNA / Competing endogenous RNA

细胞焦亡是一种由gasdermin蛋白家族介导的促炎性细胞死亡方式。研究^［1-2］显示：氧化应激状态与细胞焦亡的发生密切相关，氧化应激是机体内氧化剂产生和抗氧化之间的失衡状态，最终导致细胞功能障碍和组织损伤。氧化应激可以通过多种途径诱导细胞焦亡。近年来，转录组测序技术为研究人员揭示各种生物学过程提供了有力工具，一些环状RNA（circroRNA，circRNA）在细胞焦亡过程中发挥重要作用。circRNA主要作为分子海绵，通过结合微小RNA（microRNA，miRNA）参与多种细胞信号通路，发挥生物调节作用。circRNA与细胞焦亡的发生发展密切相关。ZHANG等^［3］发现：环状RNA NEIL3/微小RNA-1184/PIF1解旋酶信号轴通过诱导DNA损伤并触发AIM2炎性小体激活途径细胞焦亡，LI等^［4］揭示circBbs9通过海绵miR-30e-5p在PM2.5诱导核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体激活和细胞炎症反应中发挥促炎作用。由于氧化应激机制与circRNA参与调控的机制复杂，circRNA在细胞焦亡中的表达水平和参与焦亡发展进程的分子机制仍需进一步探讨。蓖麻毒素（ricin toxin，RT）是一种剧毒植物毒素，属于Ⅱ型核糖体失活蛋白^［5］，已有研究^［6］显示：RT的细胞毒性与内源性细胞凋亡有关。RT对28S rRNA的脱嘌呤作用能够激活细胞蛋白激酶途径（stress-activated protein kinase pathways，SAPKs），导致大量炎症因子和趋化因子的分泌，引起的过度炎性反应可使机体损伤进一步加剧^［7］。目前关于RT与细胞焦亡的研究较少，且主要集中在机体损伤和引发炎症反应等方面，尚未检索到基于circRNA水平探讨RT诱导细胞焦亡的研究。本课题组前期研究^［8］显示：RT可诱导巨噬细胞产生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），进而介导细胞焦亡，细胞焦亡程度受ROS水平调控，提示氧化应激可能是RT诱导细胞焦亡的重要环节。因此，寻找参与该过程的关键生物标志物，具有进一步研究的价值。本研究采用转录组测序技术，筛选RT诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞焦亡中差异表达circRNA和信使RNA（messenger RNA，mRNA），构建氧化应激相关的竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）网络，并探讨其生物学功能及相关通路，为RT中毒的预防和救治寻找潜在治疗靶点。

1 材料与方法

1.1　细胞、主要试剂和仪器

RAW264.7细胞和蓖麻毒素由中国农业科学院长春兽医研究所惠赠。RPMI 1640培养基、胰蛋白酶和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）均购自美国Gibco公司，青-链霉素混合液（北京索莱宝公司），BCA法蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，鼠抗β-actin抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG（美国Proteintech公司），鼠抗消皮素D（gasdermin D，GSDMD）单克隆抗体（美国Cell Signaling Technology公司），mirVana^TM miRNA分离试剂盒和增强型化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）试剂盒（美国Thermo Fisher公司），RNA Nano 6000试剂盒（上海优宁维生物科技股份有限公司）。垂直电泳槽（型号：1658004，美国Bio-Rad公司），转膜仪（型号：Power Blotter，美国Thermo Fisher公司），高端凝胶成像系统（美国Alpha Innotech公司），透射电镜（型号：HT7800，日本日立公司），NanoVue Plus 紫外分光光度计（美国通用电气公司），Illumina测序仪（型号：HiSeq 2500，美国Illumina公司）。

1.2　细胞培养和焦亡模型建立

37 ℃水浴中复苏RAW264.7细胞，使用10% FBS RPMI 1640培养基，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养，待细胞汇合度为80%~90%时进行分组，分为对照组和不同浓度RT组，不同浓度RT组使用RT（40和80 μg·L^-1）处理4 h建立细胞焦亡模型，并在电镜下观察细胞形态表现。

1.3　Western blotting法检测各组细胞中细胞焦亡蛋白表达水平

将细胞按2×10⁵个/孔的密度接种于6孔细胞培养板（每孔2 mL），将细胞分为对照组、40 μg·L^-1 RT组和80 μg·L^-1 RT组，加药处理4 h后，4 ℃条件下磷酸盐缓冲液（phosphated buffer saline，PBS）洗涤2次，加入放射免疫沉淀分析（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）缓冲液（每孔100 µL）和苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride， PMSF）（每孔1 µL）冰上裂解30 min后收集，4 ℃离心15 min后取上清，BCA法蛋白进行浓度定量，95 ℃加热5 min使蛋白变性，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）及转膜。使用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，PBST溶液洗涤聚偏氟乙烯 （polyvinylidene fluoride， PVDF）膜5次，二抗室温孵育1 h，PBST溶液洗涤3次后进行ECL显影。抗体溶液使用PBST溶液稀释，GSDMD 1∶1 000，β-actin 1∶5 000。以β-actin作为内参蛋白，采用Image J软件分析蛋白条带灰度值。相对丰度=（目标蛋白灰度值-背景灰度值）/（内参蛋白灰度值-背景灰度值）。

1.4　总RNA提取和转录组测序

采用mirVana^TM miRNA分离试剂盒提取各组细胞总RNA。NanoVue Plus紫外分光光度计测定总RNA的浓度和纯度；RNA Nano 6000试剂盒评估RNA的完整性，RNA完整性数≥7的样本用于后续分析。根据试剂盒说明书使用TruSeq Stranded Total RNA with Ribo-Zero Gold构建文库，构建好的RNA文库用Agilent 2100生物分析仪质检合格后，采用Illumina测序仪进行测序。转录组测序由上海欧易生物医学科技有限公司完成。

1.5　生物信息学分析

利用DESeq软件对各组样本circRNA和mRNA数目进行标准化处理（采用BaseMean值来估算表达量），计算差异倍数（fold change，FC），并采用负二项分布检验的方式对reads数进行差异显著性检验，根据|log₂FC>1|及差异显著性检验结果（P<0.05）来筛选差异表达circRNA和mRNA。将3个数据库circBase、CIRCpedia v2和circAtlas进行整合，使用CIRI2软件预测circRNA，对预测得到的circRNA与数据库进行比较和注释，查找目标circRNA信息。基于数据库中的注释信息，预测circRNA序列。利用miRanda软件预测circRNA-miRNA相互作用。在基因本体论（Gene Ontology，GO）数据库中搜索“氧化应激（Oxidative Stress）”（http：//geneontology.org/），并以“mus”为筛选条件，进一步筛选出氧化应激相关mRNA。基于TargetScan、miRTarBase和miRDB数据库进行miRNA-mRNA相互作用预测。预测得到的mRNA与测序数据中差异表达mRNA经过筛选后，重叠的mRNA被认为是氧化应激相关的候选mRNA。将预测得到的circRNA-miRNA相互作用对和miRNA-mRNA相互作用对进行整合，构建circRNA-miRNA-mRNA相互作用网络。使用Cytoscape软件绘制circRNA-miRNA-mRNA相互作用网络。对上述ceRNA网络中的circRNA、mRNA进行GO功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信号通路富集分析，利用R软件中的limma软件包，以|log₂FC|>1和P<0.05为阈值进行GO功能富集分析及KEGG信号通路富集分析并将结果可视化。基于已鉴定的差异表达mRNA，使用STRING数据库构建蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络。使用Cytoscape软件绘制PPI网络，并通过Cytohubba应用程序从PPI网络中筛选hub基因模块。

1.6　统计学分析

采用R语言软件（版本号：4.3.1，网址：www.r-project.org/）和GraphPad Prism 9.0软件进行统计学分析。各组RAW264.7细胞中未经切割的GSDMD蛋白全长消皮素D（gasdermin D full-length，GSDMD-FL）和消皮素D N端结构域（gasdermin D N-terminal fragment，GSDMD-N）蛋白表达水平均符合正态分布，以x±s表示。多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　各组RAW264.7细胞形态表现

与对照组比较，40和80 μg·L^-1 RT组细胞均发生形态改变，细胞呈现出明显焦亡样形态改变，表现为濒死细胞出现明显肿胀，质膜上出现特征性的大气泡。见图1。

2.2　各组 RAW264.7细胞中细胞焦亡蛋白表达水平

与对照组比较，40和80 μg·L^-1 RT组中GSDMD-N蛋白表达水平升高（P<0.05）；与40 μg·L^-1 RT组比较，80 μg·L^-1 RT组细胞中GSDMD-N蛋白表达水平升高（P<0.05），故后续实验RT浓度选取80 μg·L^-1。见图2。

2.3　差异circRNA和mRNA表达谱

对RT组和对照组RAW264.7细胞中circRNA和mRNA进行差异表达分析，共得到差异表达circRNA 24个。其中18个circRNA表达上调，6个circRNA表达下调；差异表达mRNA 2 930个，其中1 714个mRNA表达上调，1 216个mRNA表达下调。进一步根据差异表达情况绘制火山图（图3A和3C）和聚类热图（图3B和3D）。

2.4　CeRNA网络构建

利用miRanda软件进行circRNA-miRNA相互作用预测，基于3个网络数据库（miRDB、miRTarBase和TargetScan）鉴定了83个miRNA靶向结合的mRNA，将其与从氧化应激数据库中检索到的mRNA以及测序得到的差异表达mRNA进行交叉验证，共筛选得到13个mRNA（图4A）。将预测得到的circRNA-miRNA相互作用对和miRNA-mRNA相互作用对进行整合，构建了一个基于RT诱导RAW264.7细胞焦亡的ceRNA网络（包括7个circRNA节点、12个miRNA节点和13个mRNA节点）（图4B）。

2.5　GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析

对差异表达circRNA的亲本基因和mRNA进行GO功能富集分析，结果显示：差异表达circRNA主要参与各种免疫过程，包括细胞对生物刺激的反应、模式识别受体活性和2型免疫反应等（图5）；mRNA富集程度最高的为氧化应激反应、细胞对化学应激的反应和对活性氧的反应等（图6）。KEGG信号通路富集分析结果显示：差异表达circRNA主要参与脂质和动脉粥样硬化、鞘脂信号通路和百日咳等组织系统及人类疾病的相关通路（图7A和7B）。差异表达mRNA富集的通路包括叉头框蛋白O（Forkhead box O，FoxO）信号通路、核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信号通路和长寿调节途径等（图7C和7D）。

2.6　PPI网络构建与核心基因筛选

通过STRING网站分析，最终得到包含13个节点和12条边的PPI网络（图8A）。使用Cytohubba 插件分析整个核心网络，根据马修斯相关系数（Matthews correlation coefficient，MCC）算法筛选出top 8基因并构建相互作用网络，得到结节性硬化症复合物1（tuberous sclerosis complex 1，Tsc1）、超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2，Sod2）、肉瘤癌基因（sarcoma rous cancer gene，Src）、基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，Mmp9）、共济失调毛细血管扩张突变基因（ataxia telangiectasia mutated，Atm）、纤维蛋白5（fibulin 5，Fbln5）、内皮PAS结构域蛋白1（endothelial PAS domain-containing protein 1，Epas1）和微管相关蛋白tau（microtubule-associated protein tau，Mapt）基因即为所有氧化应激相关差异表达mRNA所构建的PPI网络核心节点，预示上述基因在RT诱导RAW264.7细胞焦亡中发挥关键作用。见图8B和表1。

3 讨 论

氧化应激是指机体内ROS产生与清除之间的失衡状态，可导致细胞分子结构和功能损伤。在炎症的发生发展过程中，氧化应激通过直接损伤细胞膜脂质、蛋白质和核酸，引起细胞功能障碍和死亡。氧化应激还能激活多种细胞内信号通路^［9］，进而促进炎症细胞因子释放，加剧炎症反应。持续的氧化应激还可能导致细胞代谢紊乱和细胞死亡方式的转变，如促进细胞焦亡的发生。RT诱导巨噬细胞焦亡在一定程度上受氧化应激调控，其详细机制仍需进一步研究。本研究通过RT诱导RAW264.7细胞构建细胞焦亡模型，透射电镜观察到RT组细胞发生明显的焦亡样变化，GSDMD-N蛋白表达也显著上调，表明RT诱导RAW264.7细胞焦亡模型构建成功。

研究^［10］显示：circRNA可以参与细胞焦亡的发生发展。环状结构赋予的circRNA的高度稳定性可能使其成为更理想的新型生物标志物和更合适的潜在治疗靶点，circRNA还可作为miRNA分子海绵，通过miRNA应答元件从而影响mRNA转录^［11］。本研究通过转录组测序获得RT诱导RAW264.7细胞焦亡中氧化应激相关基因和环状RNA的表达谱，构建circRNA-miRNA-mRNA的ceRNA网络，旨在阐明 RT诱导细胞焦亡机制并寻找潜在的治疗靶点。本研究结果显示：2 034个circRNA中有24个差异表达的circRNA中，18个circRNA表达上调，6个circRNA表达下调；差异表达mRNA 2 930个，1 714个mRNA表达上调，1 216个mRNA表达下调。本研究中火山图和聚类热图显示：与对照组比较，RT组细胞中circRNA和mRNA的表达水平有明显差异，呈聚类关系。通过测序结果和网络数据库构建出39个RT诱导RAW264.7细胞焦亡与氧化应激相关的ceRNA网络，包括7个circRNA节点、12个miRNA节点和13个mRNA节点。circRNA_0305（circAkap10）参与的ceRNA网络最多，通过6个miRNA（mmu-miR-1187、mmu-miR-346-3p、mmu-miR-466i-5p、mmu-miR-7001-5p、mmu-miR-7020-5p和mmu-miR-7222-3p），调控10个靶基因（Mctp1、Prr5l、Epas1、Tsc1、Sod2、Mmp9、Atm、Src、Mapt和Tnfaip3基因）的表达，提示circRNA_0305可能作为关键调节因子促进氧化应激反应，进而介导RT诱导的RAW264.7细胞焦亡。

本研究结果显示：差异表达的circRNA主要参与免疫过程，包括细胞对生物刺激的反应、模式识别受体活性和2型免疫反应等，而细胞焦亡正是受到外界微生物刺激时，由模式识别受体中炎症小体的活化而激活的^［12］，该结果进一步为circRNA可以参与细胞焦亡过程提供了证据。本研究中KEGG信号通路富集分析结果显示：差异表达circRNA主要参与组织系统和人类疾病的相关通路，如脂质代谢和动脉粥样硬化，表明上述circRNA可能在心血管疾病的发展中起作用。鞘脂信号通路的参与可能与神经系统功能和疾病有关，而百日咳相关通路的参与可能与呼吸道疾病存在关联。本研究中差异表达mRNA的GO功能富集分析结果显示：氧化应激反应是一个显著的生物学过程，该结果为本研究中氧化应激途径诱导细胞焦亡提供了佐证。差异表达mRNA富集的信号通路是调节细胞氧化应激反应的重要信号通路，表现在FoxO刺激编码位于不同亚细胞区室的抗氧化蛋白的基因转录，如线粒体中的锰型超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，Mn-SOD）^［13］。白细胞介素（interlukin-17，IL-17）信号通路是一种重要的促炎症细胞因子，可以激活下游信号通路，促进炎症反应^［14］。上述信号通路与炎症、天然免疫反应和细胞凋亡等生物过程密切相关，在细胞中的作用涉及到多个信号通路的调控^［15］，包括代谢、免疫反应和细胞存活及衰老等多个方面。

人们普遍认为基因通常是通过相互作用来发挥功能的^［16］。因此，通过PPI网络分析ceRNA中mRNA的相互作用，使用MCC算法筛选出该PPI网络中排名前8位的Hub基因，即Tsc1、Sod2、Src、Mmp9、Atm、Fbln5、Epas1和Mapt基因。对PPI网络中的Hub基因进行文献检索后得到部分节点与炎症和氧化应激的发生发展密切相关。其中Tsc1可以与Tsc2形成复合体通过不同的信号通路来调控巨噬细胞的极化状态，从而调控巨噬细胞的内稳态，抑制巨噬细胞的炎性反应^［17］。SOD2是存在于线粒体基质的一种SOD，在机体氧化应激过程中发挥着重要的防护作用。研究^［18］显示：环状SOD2还可以竞争性地吸收miR-532-3p来激活硫氧还蛋白相互作用蛋白（thioredoxin interacting protein，TXNIP）/NLRP3炎症小体信号通路，促进非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease， NAFLD）中的细胞焦亡。Src是一种内源性的酪氨酸激酶，激活后的Src能增强受体功能，从而提高受体对胞外刺激的反应^［19］，同时Src家族激酶Lyn还能对NLRP3的酪氨酸磷酸化抑制NLRP3炎症小体的活性^［20］。Mmp9属于基质金属蛋白酶家族成员，能够降解细胞外基质^［21］，并参与细胞过程的调控、抑制炎性因子的分泌^［22］。ATM在氧化应激条件下蛋白可被激活并调节机体氧化还原稳态的平衡^［23］，共济失调毛细血管扩张突变基因（ataxia telangiectasia-mutated gene， ATM）还被证明是巨噬细胞发挥最佳NLRP3和NOD样受体C4（NLP family CARD domain-containing protein 4，NLRC4）炎症小体功能所必需的，因为其失活改变了ROS平衡并因此损害了炎症小体组装^［24］。Fbln5是一种由多种血管细胞分泌的糖蛋白^［25］已被确定为细胞外SOD的一种新的结合蛋白^［26］， Fbln5能通过阻断纤连蛋白和β1整合素之间的相互作用来阻止活性氧的产生^［27］。EPAS1是一种转录因子，能够激活炎症介质肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）促进低氧炎症的发展^［28-29］，EPAS1/TNF-α轴是激活低氧炎症的关键信号通路^［30］。Mapt是一种固有无序态的蛋白^［31］，可以通过线粒体的超极化引起氧化应激^［32］。由此推测，circRNA可能通过分子海绵miRNA调控上述靶点基因的表达，进而调控氧化应激诱导细胞焦亡。

综上所述，本研究利用转录组测序技术检测了RT诱导RAW264.7细胞焦亡中circRNA和mRNA表达谱的变化，筛选出了参与RT诱导巨噬细胞焦亡中Hub基因，上述circRNA可能通过ceRNA网络参与调控焦亡中氧化应激相关的8个Hub基因和炎症信号通路，进而介导RT诱导的RAW264.7细胞焦亡。本研究结果为RT诱导炎症机制提供了新的见解，为RT造成炎症损伤的后续治疗和预防提供了理论依据

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基金资助

吉林省科技厅科技发展计划项目(20240303082NC)