Rh 家族 C 糖蛋白在食管鳞状细胞癌组织中的表达及其临床意义

Expression of Rh family C glycoprotein in esophageal squamous carcinoma and its clinical significance

摘要

目的 探讨Rh家族C糖蛋白（RHCG）在食管鳞状细胞癌（ESCC）癌组织中的表达及其对ESCC细胞恶性生物学行为的影响，阐明RHCG作为ESCC患者诊断和预后标志物的价值。 方法 收集ESCC组织样本143例，癌旁正常组织样本105例。采用免疫组织化学染色法将143例ESCC样本分为2组，免疫组织化学评分≤6分为RHCG低表达组，免疫组织化学评分>6分为RHCG高表达组。免疫组织化学染色法检测143例ESCC组织和105例正常组织中RHCG蛋白表达情况，并分析其与ESCC患者临床病理特征的关系。采用受试者工作特征（ROC）曲线和Kaplan-Meier生存分析评估RHCG蛋白在ESCC患者诊断和预后判断中的价值，单因素与多因素COX回归分析确定影响ESCC患者预后的独立危险因素。采用基因表达谱动态分析（GEPIA）2数据库分析多种肿瘤组织中RHCG mRNA表达情况。培养ESCC TE-1细胞，设置不同Lipofectamine 2000∶RHCG比例，在6孔细胞培养板中转染TE-1细胞，RHCG转染组质粒添加量分别为2.0、2.5和3.0 μg，分别转染24和48 h，转染空载体的正常对照作为对照组，采用Western blotting法检测不同浓度转染后各组TE-1细胞中RHCG蛋白表达量并验证最佳转染条件，细胞计数试剂盒8（CCK-8）实验检测2组TE-1细胞增殖活性，平板克隆实验检测2组TE-1细胞克隆形成数，Transwell小室实验检测2组TE-1细胞迁移细胞数。 结果 与癌旁正常组织比较，ESCC、多形性胶质母细胞瘤和头颈部鳞状细胞癌等多种癌组织中RHCG mRNA表达水平降低（P<0.05）。RHCG蛋白主要位于正常食管鳞状上皮细胞的胞膜上，ESCC组织中RHCG蛋白表达强度低于癌旁正常食管组织（χ²=109.373，P<0.001），且RHCG低表达组患者分化程度差于RHCG高表达组（P=0.041）。RHCG诊断ESCC的ROC曲线下面积（AUC）值为0.86，灵敏度和特异度分别为95.1%及75.0%；Kaplan-Meier生存分析，与RHCG高表达组比较，RHCG低表达组患者生存期更短，预后较差［风险比（HR）=0.269，95%置信区间（CI）=0.113~0.639，P=0.020］；COX回归分析，RHCG低表达可作为影响ESCC预后的独立危险因素（HR=4.569，95%CI=1.315~15.877，P=0.017）。Western blotting法验证，最佳转染条件为RHCG质粒3.0 μg转染48 h，此时RHCG过表达效果最佳，RHCG蛋白表达量最高。CCK-8实验，与对照组比较，接种细胞第4天时，过表达RHCG组细胞增殖活性降低（P<0.001）。在TE-1细胞中，过表达RHCG组TE-1细胞克隆形成数低于对照组（t=17.70，P<0.001）。Transwell小室实验，与对照组比较，过表达RHCG组TE-1细胞迁移数减少（t=23.74，P<0.001）。 结论 RHCG在ESCC组织中低表达且与ESCC患者预后不良相关，过表达RHCG可以抑制TE-1细胞的增殖和迁移，RHCG有望成为ESCC新的诊断和预后标志物及治疗靶点。

Abstract

Objective To discuss the expression of Rh family C glycoprotein （RHCG） in the esophageal squamous cell carcinoma （ESCC） tissue and its effect on the malignant biological behavior of ESCC cells， and to clarify the value of RHCG as a diagnostic and prognostic marker for the ESCC patients. Methods A total of 143 ESCC tissue samples and 105 adjacent normal tissue samples were collected. Using immunohistochemical staining method， 141 ESCC samples were divided into two groups： RHCG low expression group （immunohistochemistry score ≤6） and RHCG high expression group （immunohistochemistry score >6）. Immunohistochemical method was used to detect the RHCG protein expression in 143 ESCC tissues and 105 normal tissues， and the relationship between the clinicopathological characteristics of the ESCC patients was analyzed. Receiver operating characteristic （ROC） curve and Kaplan-Meier survival analysis were used to evaluate the value of RHCG in diagnosis and prognosis of the ESCC patients； univariate and multivariate COX regression analysis were used to determine the independent risk factors affecting the prognosis of the ESCC patients. Gene Expression Profiling Interactive Analysis （GEPIA2） database was used to analyze the expression of RHCG mRNA in various tumor tissues. The ESCC TE-1 cells were cultured and transfected in to 6-well cell culture plates with different Lipofectamine2000∶RHCG ratios； the cells in RHCG transfection group were transfected with weights of 2.0， 2.5， and 3.0 μg for 24 and 48 h， respectively， and the cells in NC group transfected with empty vector as control. Western blotting method was used to detect the RHCG protein expression level in the TE-1 cells in various groups after transfection at different concentrations and verify the optimal transfection conditions； cell counting kit-8 （CCK-8） assay was used to detect the proliferation activities of the TE-1 cells； plate clone formation assay was used to detect the colony formation numbers of the TE-1 cells； Transwell chamber assay was used to detect the numbers of migrating TE-1 cells. Results Compared with adjacent normal tissue， the RHCG gene expression level in various cancer tissues including ESCC， glioblastoma multiforme， and head and neck squamous cell carcinoma was significantly decreased （P<0.05）. RHCG protein was mainly located on the cell membrane of normal esophageal squamous epithelial cells； the RHCG protein expression intensity in ESCC tissues was lower than that in adjacent normal esophageal tissue （χ²=109.373， P<0.001）， and the patients in RHCG low expression group had poorer differentiation than those in RHCG high expression group （P=0.041）. The area under the curve （AUC） value of RHCG for diagnosing ESCC was 0.86， with sensitivity and specificity of 95.1% and 75.0%， respectively； the Kaplan-Meier survival analysis results showed that compared with high RHCG expression group， the patients in low RHCG expression group had shorter survival time and poorer prognosis ［harard ratio（HR）=0.269，95% confidence interval（CI）： 0.113-0.639， P=0.020］； the COX regression analysis results showed that low RHCG expression could serve as an independent risk factor affecting the prognosis of ESCC ［HR=4.569， 95%CI=1.315-15.877， P=0.017）］. The Western blotting results verified that the optimal transfection condition was 3.0 μg RHCG plasmid for 48 h， at which time RHCG overexpression was optimal and RHCG protein expression level was highest. The CCK-8 assay results showed that compared with control group， the proliferation activity in RHCG overexpression group was decreased on the 4th day after cell seeding （P<0.001）. In the TE-1 cells， the colony formation number of the TE-1 cells in RHCG over-expression group was lower than that in control group （t=17.70， P<0.001）. The Transwell chamber assay results showed that compared with control group， the number of migrating cells in RHCG over-expression group was decreased （t=23.74， P<0.001）. Conclusion RHCG expression is decreased in ESCC tissues and associated with poor prognosis in ESCC patients； overexpression of RHCG can inhibit the proliferation and migration of the TE-1 cells， providing a theoretical basis for RHCG as a novel diagnostic and prognostic marker and therapeutic target for ESCC.

Graphical abstract

关键词

Rh家族C糖蛋白 / 食管鳞状细胞癌 / 诊断 / 预后 / 受试者工作特征曲线

Key words

Rh family C glycoprotein / Esophageal squamous cell carcinoma / Diagnosis / Prognosis / Receiver operating characteristic curve

中国新发食管癌病例数占全球的51%，死亡食管癌病例数占全球的55%^［1］，呈高发病率和高死亡率的趋势。食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）起病隐匿，早期症状不明显，多数患者出现症状时已是晚期，而晚期ESCC患者预后较差，术后5年生存率仅为6%^［2］。如果能够早期干预，其5年生存率可超过95%^［3］，因此迫切需要寻找更多的用于早期诊断和预后评估的分子标志物，实现早期诊断和早期治疗以提高患者生存率。Rh家族C糖蛋白（Rh type C glycoprotein，RHCG）属于Rhesus（Rh）家族成员之一，最初被鉴定为人类红细胞中的Rh血型抗原。Rh家族是跨膜蛋白，其特征是具有12个跨膜结构域和胞质内N-末端及C-末端^［4］。根据功能可将Rh家族蛋白分为两大类：氨转运型Rh糖蛋白（RHAG、RHBG和RHCG）和非转运型Rh蛋白（RHD和RHCE）。RHBG和RHCG作为氨转运体，在肾脏^［5］、肝脏^［6］、大脑^［7］和胃肠道等多种组织中广泛表达，在氨排泄和肾脏pH值调节过程中发挥重要作用^［8-9］。虽然RHCG在食管和子宫颈组织中呈高表达^［10］，但其在ESCC发生发展的作用尚不明确。本研究基于生物信息学方法初步预测RHCG在ESCC组织中的表达情况，利用免疫组织化学法验证并评估其在ESCC中的诊断和预后价值，同时从细胞学方面分析RHCG对ESCC细胞增殖和迁移的影响，为将RHCG作为ESCC的新的诊断和预后标志物提供理论依据。

1 资料与方法

1.1　细胞、质粒、主要试剂和仪器

ESCC TE-1细胞来源于中国科学院细胞库。pcDNA3.1 RHCG质粒购于上海吉玛制药技术有限公司。RHCG多克隆抗体购于美国Santa Cruz公司，GAPDH抗体购于美国Proteintech公司，DAB染色液试剂盒购自基因科技（上海）股份有限公司，Lipofectamine 2000转染试剂购于美国赛默飞世尔科技公司，5×Loading Buffer购于上海碧云天生物技术有限公司，细胞计数试剂盒8（cell counting kit-8，CCK-8）、细胞增殖和毒性检测试剂盒及0.1%结晶紫溶液购于北京索莱宝科技有限公司，Western blotting电泳仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2　组织样本收集

收集2000—2021年来自石河子大学第一附属医院的石蜡包埋组织样本共248例，其中ESCC组织143例，癌旁正常组织105例。所有收集的病例均经过患者知情同意和伦理委员会批准，并通过电话方式收集随访信息（随访时间截止至2021年9月）。

1.3　免疫组织化学染色检测各组织的免疫组织化学评分

石蜡组织切片经二甲苯和梯度酒精进行脱蜡 和 水 化， 采 用 乙 二 胺 四 乙 酸 溶 液（ethylenediaminetetraacetic acid solution，EDTA）溶液进行抗原修复，阻断内源性过氧化物酶后滴加一抗，采用DAB染色液试剂盒，滴加酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物二抗，并依次进行DAB显色、苏木素复染、脱水、封片、阅片。切片结果由2名资深的病理医师遵循2019版世界卫生组织消化系统标准对染色结果进行判读。依据细胞染色强度和肿瘤细胞阳性百分比进行评分（染色强度：无着色=0分，黄色=1分，棕黄色=2分，棕色=3分；5%<阳性百分比为0分，5%≤阳性百分比<25%为1分，25%≤阳性百分比<50%为2分，50%≤阳性百分比<75%为3分，75%≤阳性百分比≤100%为4分），免疫组织化学评分等于上述2项分值的乘积，免疫组织化学评分≤6分为RHCG低表达组，免疫组织化学评分>6分为RHCG高表达组。

1.4　生物信息学分析

采用基因表达谱动态分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）2数据库（http：//gepia2.cancer-pku.cn/#index）^［11］进行泛癌分析。GEPIA2收集了来自癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）和基因型-组织表达（Genotype-Tissue Expression，GTEx）项目的9 736个肿瘤样本和8 587个正常样本的RNA-seq表达数据，采用“General Information”模块分析多种肿瘤组织中RHCG mRNA表达情况。

1.5　细胞学实验

1.5.1　细胞培养

TE-1细胞培养于RPMI-1640完全培养基（含10%胎牛血清、1%青-链霉素）中，并置于37 ℃、5% CO₂恒温培养箱中培养。当细胞密度达到80%~90%时进行换液及细胞传代，用于后续实验。

1.5.2　细胞转染

当细胞密度为70%~80%时采用胰酶消化计数，铺6孔细胞培养板时每孔为4×10⁵个细胞，待细胞贴壁后观察细胞状态并进行转染，EP管中各加入100 μL RPMI-1640培养基，再分别添加7.5 μL Lipofectamine 2000转染试剂和3.0 μg pcDNA3.1 RHCG质粒，分别混匀后静置5~10 min，6孔细胞培养板换液后将转染的混合液体分别均匀滴入每个孔中，继续培养24~48 h以供后续实验使用。按照说明书设置不同Lipofectamine 2000∶RHCG比例，在6孔细胞培养板中转染TE-1细胞，RHCG转染组质粒添加量分别为2.0、2.5和3.0 μg，分别转染24和48 h，转染空载体的正常对照作为对照组，经Western blotting法验证最佳转染条件。

1.5.3　Western blotting法检测TE-1细胞中RHCG蛋白表达情况

转染48 h后的细胞采用磷酸盐缓冲液（phosphated buffer saline，PBS）洗涤3次，冰上裂解细胞进行蛋白提取，加入5×Loading Buffer后100 ℃金属浴10 min。根据说明书制备聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）凝胶，电泳后使用转膜液（湿转法）400 mA、30 min进行转膜，脱脂牛奶封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜（RHCG 1∶1 000；GAPDH 1∶50 000），1×含吐温-20的PBS（PBS with Tween-20，PBST）洗涤3次，每次10 min，适量二抗室温孵育2 h（羊抗鼠二抗1∶10 000），再次使用1×PBST溶液洗涤3次，超敏发光液进行显色。

1.5.4　CCK-8和平板克隆实验检测2组TE-1细胞增殖活性及克隆形成数

取对数生长期的转染后TE-1细胞，在96孔细胞培养板中每孔接种约5×10³个细胞，每组设置3个复孔，并且设置无细胞孔作为调零孔，96孔细胞培养板周围一圈加入无菌PBS缓冲液防止蒸发效应影响实验结果，分别在1、2、3和4 d时加入CCK-8试剂，2 h后采用酶标仪检测450 nm处各孔的吸光度（A）值。平板克隆是在6孔细胞培养板中每孔接种500个转染的细胞，培养7~8 d显示肉眼可见的集落后终止培养，采用PBS缓冲液洗涤3次后4%多聚甲醛固定30 min，洗涤2次去除多余的固定液，0.1%结晶紫4 ℃染色，30 min后用PBS缓冲液再次洗涤2次，晾干后观察并计算每组细胞克隆形成数。

1.5.5　Transwell小室实验检测2组TE-1细胞中迁移细胞数

将转染48 h后细胞采用无血清培养基重悬，将约2×10⁵个细胞加入Transwell小室的上室，上室总体积为300 μL，下室加入800 μL含20%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的完全培养基，将含小室的24孔细胞培养板置于培养箱中培养24 h后进行固定染色，弃去上室培养基，采用4%多聚甲醛浸泡30 min固定细胞，然后采用0.1%结晶紫染色30 min，最后使用双蒸水清洗至背景清晰。使用Image J软件进行细胞计数，首先导入待分析的图片，将其转换为黑白图像，然后使用“Analyze”→“Analyze Particles”功能，得到的结果中“Count”即为迁移的细胞数。

1.6　统计学分析

采用SPSS 26.0和GraphPad Prism 9.5.0统计软件进行统计学分析。正常食管鳞状上皮组织中RHCG蛋白表达情况和不同临床病理特征患者RHCG蛋白表达情况比较采用χ²检验，采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析RHCG的诊断价值并计算ROC曲线下面积（area under curve，AUC），Kaplan-Meier生存曲线分析比较RHCG高表达与RHCG低表达患者总体生存时间的差异（0为存活，1为死亡），单因素和多因素COX分析各因素与ESCC患者预后的关系。各组细胞增殖活性、迁移细胞数和克隆形成数均符合正态分布，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间均数两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　多种癌组织中RHCG mRNA表达水平

GEPIA2在线数据库分析结果显示：与癌旁正常组织比较，ESCC、多形性胶质母细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌和肾透明细胞癌等多种癌组织中RHCG mRNA表达水平升高（P<0.05），表明RHCG的失活参与了肿瘤的发生发展，其可能成为潜在的肿瘤治疗靶点。见图1。

2.2　ESCC患者癌组织和癌旁正常组织中RHCG蛋白表达

RHCG蛋白主要表达于正常食管鳞状上皮细胞的胞膜（图2）。143例ESCC组织中，120例呈RHCG蛋白低表达（120/143，83.9%），23例呈RHCG蛋白高表达（23/143，16.1%）；105例正常食管上皮组织中，18例呈RHCG蛋白低表达（18/105，17.1%），87例呈RHCG蛋白高表达（87/105，82.9%），ESCC患者癌组织中RHCG蛋白表达低于正常食管上皮组织（χ²=109.373，P<0.001）。

2.3　不同临床病理特征ESCC患者癌组织中RHCG蛋白表达

RHCG蛋白低表达组患者分化程度差于RHCG蛋白高表达组（χ²=4.194，P=0.041）。RHCG蛋白表达与患者的性别（P=0.083）、年龄（P=0.777）、肿瘤部位（P=0.859）、浸润深度（P=0.603）、有无远处转移（P=0.372）、有无淋巴结转移（P=0.760）和TNM分期（P=0.392）无关联。见表1。

2.4　RHCG蛋白表达水平对ESCC的诊断价值

RHCG的蛋白表达水平对ESCC具有较好的诊断价值，AUC=0.86，灵敏度为95.1%，特异度为75.0%，P<0.001。见图3。

2.5　RHCG蛋白表达与ESCC患者预后的关系

在143例ESCC患者中，通过电话随访和医院记录获得了60例患者完整的随访信息。通过Kaplan-Meier生存曲线分析RHCG蛋白表达水平与患者生存时间及生存情况的关系，结果显示：与RHCG蛋白高表达组比较，RHCG蛋白低表达组患者生存时间更短，预后较差［风险比（hazard ratio， HR）：0.269，95%置信区间（confidence interval，CI）：0.113~0.639，P=0.020］。见图4。

单因素COX回归分析结果显示：浸润深度（P=0.004）、淋巴结转移（P=0.008）、TNM分期（P<0.001）和RHCG表达（P=0.031）与ESCC患者预后显著相关。多因素COX回归分析结果显示：RHCG是ESCC发生的独立危险因素（HR：4.569，95%CI：1.315~15.877，P=0.017）。见表2。

2.6　不同浓度转染后TE-1细胞中RHCG蛋白表达量

经Western blotting验证最佳转染条件为RHCG质粒3.0 μg转染48 h，此时RHCG蛋白过表达效果最佳，RHCG蛋白表达量最高（图5）。

2.7　对照组和过表达RHCG组TE-1细胞增殖活性

与对照组比较，接种细胞第4天时，过表达RHCG组的TE-1细胞增殖活性降低（P<0.001）。见图6。

2.8　对照组和过表达RHCG组TE-1细胞克隆形成数

过表达RHCG组TE-1细胞克隆形成数（302.30个±19.04个）低于对照组（513.70个± 8.08个）（t=17.70，P<0.001）。见图7。

2.9　对照组和过表达RHCG组TE-1细胞的迁移细胞数

与对照组（1 234.00个±43.21个）比较，过表达RHCG组细胞迁移数（326.70个±50.16个）减少（t=23.74，P<0.001）。见图8。

3 讨 论

ESCC是一种侵袭性较强的恶性肿瘤，早期常无症状，确诊时多为中晚期，恶性程度高、预后差。尽管近年来食管癌分子靶向治疗已取得重大进展^［12］，但由于缺乏早期诊断和预后评估的分子标志物，ESCC患者5年生存率不足10%，而早期诊断和早期治疗后ESCC患者生存率超过95%^［3］。因此寻找新的ESCC诊断标志物和治疗靶点对于提高ESCC患者生存率至关重要。

本研究通过GEPIA2数据库进行泛癌分析结果显示：RHCG基因在ESCC、多形性胶质母细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌和肾透明细胞癌等多种肿瘤低表达，与先前报道^［13-15］一致。研究^［16］显示：RHCG蛋白在正常组织中高表达，表达率为72.5%，ESCC组织中不表达RHCG蛋白。本研究中免疫组织化学染色结果显示：RHCG蛋白在ESCC组织中低表达，其中正常食管上皮组织中RHCG表达率为82.9%，ESCC组织中RHCG表达率为16.1%。研究^［17］显示：RHCG可作为喉鳞状细胞癌的诊断标志物，与hsa_circ_0036722联合诊断的AUC可达到0.859，但目前关于RHCG在诊断ESCC的作用方面尚未明确。本研究通过ROC曲线分析RHCG对ESCC的诊断能力，结果显示：RHCG具有良好的诊断效能（AUC值为0.868）及较高的灵敏度（95.1%）和特异度（75.0%）。由RHCG构建的新型预后模型能够准确预测膀胱癌患者生存率，指导个性化治疗^［18］。本研究结果显示：RHCG蛋白低表达组患者的生存率更低，且RHCG蛋白低表达为ESCC发生的独立危险因素，进一步证实RHCG蛋白低表达与ESCC患者的不良预后相关。

研究^［10］显示：敲低RHCG可导致宫颈癌细胞的增殖和迁移。为了进一步研究RHCG对ESCC细胞的生物学行为的影响，本课题组采用RHCG质粒转染TE-1细胞，通过CCK-8实验、克隆形成实验和Transwell小室实验结果证明了过表达RHCG蛋白可明显降低TE-1细胞增殖和迁移能力。研究^［16］显示：敲低RHCG蛋白可以增加核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信号通路的抑制蛋白IκB（inhibitor of NF-κB，IκB）的磷酸化，使其被蛋白酶体降解，促进NF-κB p65活化和核转位。NF-κB p65移位至细胞核后会促进ESCC的侵袭和转移。在非小细胞肺癌中，过表达RHCG蛋白可降低A549细胞中相关信号通路表达水平^［19］，证明RHCG可通过调控相关信号通路的活化抑制肺癌细胞的增殖。RHCG在胃癌中高表达，并通过保持细胞内碱性促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭^［20］。上述研究表明：RHCG参与肿瘤发生发展。在ESCC患者中，可通过RHCG表达上调增加其放疗敏感性^［21］，为RHCG作为治疗靶点提供了证据支持。

综上所述，RHCG蛋白在ESCC患者中低表达且与患者不良预后相关，是ESCC的独立预后指标。过表达RHCG蛋白可以抑制ESCC TE-1细胞的增殖和迁移能力，RHCG有望成为ESCC有效的诊断和预后标志物及治疗靶点。

参考文献

[1] SUNG H， FERLAY J， SIEGEL R L， et al. Global cancer statistics 2020： GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries［J］. CA Cancer J Clin， 2021， 71（3）： 209-249.

[2] SADDOUGHI S A， REINERSMAN J M， ZHUKOV Y O， et al. Survival after surgical resection of stage Ⅳ esophageal cancer［J］. Ann Thorac Surg， 2017， 103（1）： 261-266.

[3] CIOCIRLAN M， LAPALUS M G， HERVIEU V， et al. Endoscopic mucosal resection for squamous premalignant and early malignant lesions of the esophagus［J］. Endoscopy， 2007， 39（1）： 24-29.

[4] HUANG C H， PENG J B. Evolutionary conservation and diversification of Rh family genes and proteins［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2005， 102（43）： 15512-15517.

[5] ELADARI D， CHEVAL L， QUENTIN F， et al. Expression of RhCG， a new putative NH（3）/NH（4）（+） transporter， along the rat nephron［J］. J Am Soc Nephrol， 2002， 13（8）： 1999-2008.

[6] GEYER R R， PARKER M D， TOYE A M， et al. Relative CO₂/NH₃ permeabilities of human RhAG， RhBG and RhCG［J］. J Membr Biol， 2013， 246（12）： 915-926.

[7] HILLMANN P， KÖSE M， SÖHL K， et al. Ammonium-induced calcium mobilization in 1321N1 astrocytoma cells［J］. Toxicol Appl Pharmacol， 2008， 227（1）： 36-47.

[8] BIVER S， BELGE H， BOURGEOIS S， et al. A role for Rhesus factor Rhcg in renal ammonium excretion and male fertility［J］. Nature， 2008， 456（7220）： 339-343.

[9] GRUSWITZ F， CHAUDHARY S， HO J D， et al. Function of human Rh based on structure of RhCG at 2.1 A［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2010， 107（21）： 9638-9643.

[10] WANG D G， LI T M， LIU X. RHCG suppresses cervical cancer progression through inhibiting migration and inducing apoptosis regulated by TGF-β1［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2018， 503（1）： 86-93.

[11] LI C W， TANG Z F， ZHANG W J， et al. GEPIA2021： integrating multiple deconvolution-based analysis into GEPIA［J］. Nucleic Acids Res， 2021， 49（W1）： W242-W246.

[12] FATEHI HASSANABAD A， CHEHADE R， BREADNER D， et al. Esophageal carcinoma： towards targeted therapies［J］. Cell Oncol （Dordr）， 2020， 43（2）： 195-209.

[13] XU W G， ZOU H H， WEI Z， et al. Rh type C-glycoprotein functions as a novel tumor suppressor gene by inhibiting tumorigenicity and metastasis in head and neck squamous cell carcinoma［J］. Aging （Albany NY）， 2019， 11（11）： 3601-3623.

[14] HAN K H， CROKER B P， CLAPP W L， et al. Expression of the ammonia transporter， rhC glycoprotein， in normal and neoplastic human kidney［J］. J Am Soc Nephrol， 2006， 17（10）： 2670-2679.

[15] YE H， YU T W， TEMAM S， et al. Transcriptomic dissection of tongue squamous cell carcinoma［J］. BMC Genomics， 2008， 9： 69.

[16] MING X Y， ZHANG X， CAO T T， et al. RHCG suppresses tumorigenicity and metastasis in esophageal squamous cell carcinoma via inhibiting NF-κB signaling and MMP1 expression［J］. Theranostics， 2018， 8（1）： 185-198.

[17] GUO Y， HUANG Q， ZHENG J， et al. Diagnostic role of dysregulated circular RNA hsa_circ_0036722 in laryngeal squamous cell carcinoma［J］. Onco Targets Ther， 2020， 13： 5709-5719.

[18] SHEN C， CHAI W， HAN J W， et al. Identification and validation of a dysregulated TME-related gene signature for predicting prognosis， and immunological properties in bladder cancer［J］. Front Immunol， 2023， 14： 1213947.

[19] 张玉辉， 高亚坤， 肖连波， 等. RHCG基因在非小细胞肺癌中的表达及对细胞增殖的影响［J］. 基因组学与应用生物学， 2020， 39（1）： 278-282.

[20] CHEN P， LIU C， LI P， et al. High RhCG expression predicts poor survival and promotes migration and proliferation of gastric cancer via keeping intracellular alkaline［J］. Exp Cell Res， 2020， 386（2）： 111740.

[21] ZHANG K， FAN R T， ZHAO D Y， et al. CircATIC inhibits esophageal carcinoma progression and promotes radiosensitivity by elevating RHCG through sponging miR-10-3p［J］. Thorac Cancer， 2022， 13（7）： 934-946.

基金资助

国家自然科学基金项目(82160542)

国家自然科学基金项目(82273020)

南京大学医学院附属鼓楼医院临床研究专项资金项目(2023-LCYJ-MS-17)