基于甾醇酯与肝内导管、胆道和胆囊恶性肿瘤发生的因果关系的孟德尔随机化分析

Mendelian randomization analysis based on causal association of sterol esters with occurrence of intrahepatic ductal, biliary, and gallbladder malignancy

摘要

目的 采用两样本孟德尔随机化（MR）分析，探讨甾醇酯与肝内导管、胆道和胆囊恶性肿瘤发生的因果关联，为甾醇酯的生物学机制研究以及探索肝内导管、胆道和胆囊恶性肿瘤的早期防治提供依据。 方法 15种不同种类的甾醇酯特征的工具变量数据来自芬兰数据库（FinnGen），肝内导管、胆道和胆囊恶性肿瘤全基因组数据来自全基因组关联研究（GWAS）数据库，以甾醇酯、肝内导管、胆道和胆囊恶性肿瘤为关键词进行检索，下载编号为ICD-O-3和GCST90277238-GCST9027725，采用逆方差加权法（IVW）、MR-Egger回归法和加权中位数（WM）法评价甾醇酯与肝内导管、胆道和胆囊恶性肿瘤发生的因果关联，采用MR-Egger截距法进行多效性检验，Cochran Q检验进行异质性检验，留一法进行敏感性分析，综合评估结果的可靠性和稳健性。 结果 IVW分析，甾醇酯（27：1/14：0）［比值比（OR）=2.349，95%置信区间（CI）=1.371~4.025，P=0.002］、甾醇酯（27：1/16：0）（OR=1.248，95%CI=1.018~1.523，P=0.033）、甾醇酯（27：1/18：2）（OR=1.361，95%CI=1.078~1.718，P=0.009）和甾醇酯（27：1/22：6）（OR=1.339，95%CI=1.001~1.791，P=0.049）增加患肝内导管、胆道和胆囊恶性肿瘤的风险。MR-Egger回归分析，甾醇酯（27：1/18：2）（OR=2.038，95%CI=1.337~3.105，P=0.011）是肝内导管、胆道和胆囊恶性肿瘤的危险因素。WM分析，甾醇酯（27：1/14：0）（OR=2.786，95%CI=1.419~5.468，P=0.003），甾醇酯（27：1/18：2）（OR=1.548，95%CI=1.148~2.088，P=0.004）是肝内导管、胆道和胆囊恶性肿瘤的危险因素。MR-Egger截距分析和Cochran Q检验，本研究无水平多效性和异质性。留一法敏感性分析未发现影响较大的异常单核苷酸多态性（SNPs），确保本研究可靠性。 结论 甾醇酯（27：1/14：0）、甾醇酯（27：1/16：0）、甾醇酯（27：1/18：2）和甾醇酯（27：1/22：6）与肝内导管、胆道和胆囊恶性肿瘤之间存在因果关联且促进该类恶性肿瘤的发生发展。

Abstract

Objective To discuss the causal association between sterol esters and intrahepatic duct， biliary tract， and gallbladder malignancies using two-sample Mendelian randomization （MR） analysis， and to clarify the biological mechanisms of sterol esters， and to provide the a basis for early prevention and treatment of these malignancies. Methods The instrumental variable data for 15 different types of sterol ester traits were obtained from the Finnish database （FinnGen）. The genome-wide association study （GWAS） data for intrahepatic duct， biliary tract， and gallbladder malignancies were retrieved from the GWAS database using the keywords “sterol ester” and “intrahepatic duct， biliary tract， and gallbladder malignancies”（accession numbers： ICD-O-3 and GCST90277238-GCST9027725）. The inverse-variance weighted （IVW） method， MR-Egger regression， and weighted median （WM） method were used to assess the causal association between sterol esters and the risk of these malignancies. Pleiotropy was tested using the MR-Egger intercept method； heterogeneity was evaluated using Cochran’s Q test； and sensitivity analysis was performed using the leave-one-out approach to comprehensively assess the reliability and robustness of the results. Results The IVW analysis results showed that Sterol ester （27：1/14：0） odds ratio（OR）=2.349， 95% confidence interval （CI）=1.371-4.025， P=0.002）， Sterol ester（27：1/16：0） （OR=1.248， 95%CI=1.018-1.523， P=0.033）， Sterol ester （27：1/18：2） （OR=1.361， 95%CI=1.078-1.718， P=0.009）， and Sterol ester （27：1/22：6） （OR=1.339， 95%CI=1.001-1.791， P=0.049） were associated with an increased risk of intrahepatic duct， biliary tract， and gallbladder malignancies. The MR-Egger regression analysis results indicated that Sterol ester （27：1/18：2） （OR=2.038， 95%CI=1.337-3.105， P=0.011） was a risk factor for these malignancies. The WM analysis results revealed that Sterol ester （27：1/14：0） （OR=2.786， 95%CI=1.419-5.468， P=0.003） and Sterol ester （27：1/18：2） （OR=1.548， 95%CI=1.148-2.088， P=0.004） were also risk factors. The MR-Egger intercept analysis and Cochran’s Q test results indicated no significant horizontal pleiotropy or heterogeneity. The leave-one-out sensitivity analysis did not identify any influential outlier single nucleotide polymorphism （SNPs）， confirming the reliability of the study. Conclusion Sterol ester （27：1/14：0）， Sterol ester （27：1/16：0）， Sterol ester （27：1/18：2）， and Sterol ester （27：1/22：6） exhibit causal associations with intrahepatic duct， biliary tract， and gallbladder malignancies and may promote their development.

Graphical abstract

关键词

甾醇酯 / 肝内导管 / 胆道 / 胆囊 / 恶性肿瘤 / 孟德尔随机化

Key words

Sterol ester / Intrahepatic duct / Biliary tract / Gallbladder / Malignancy / Mendelian randomization

肝内导管和胆道癌起源于肝内胆管的上皮细胞，是第二常见的原发性肝恶性肿瘤且患者预后较差^［1］，其5年生存率为21%~35%^［2］。胆囊癌是胆道系统中常见的肿瘤，由于其特殊的生长位置和症状不明显的特点，因此多数胆囊癌多在晚期被发现且患者预后差，胆囊癌患者的5年生存率不足5%^［3］。近年来影响肝内导管、胆道和胆囊恶性肿瘤发生发展的因素逐渐被发现，包括吸烟、饮酒、肥胖、病毒和细菌感染^［4-5］。尽管目前已经采用了多种方法和手段来推进肝内导管、胆道和胆囊恶性肿瘤诊断及治疗，但患者生存预后仍然较差。目前，肝内导管、胆道和胆囊恶性肿瘤的发生发展的病因及其发病机制尚未完全清楚^［6］。

甾醇是多数哺乳动物、植物和真菌中一类关键的脂质。在真核脂滴中，甾醇3-羟基通常与脂肪酸酯化，形成甾醇酯，充当甾醇储存池，其是脂质体的一种，也是细胞内脂滴的重要成分^［7］。甾醇酯在维生素和类固醇激素的膜成分及前体形成中发挥重要作用^［8］。甾醇酯的合成和分解在甾醇稳态中发挥重要的作用，游离胆固醇池和酯化胆固醇池之间的不平衡与多种人类疾病有关，可导致肥胖、糖尿病和动脉粥样硬化等^［9-11］。研究^［12-15］显示：血清中甾醇酯影响癌症的发生发展，包括乳腺癌、结直肠癌、胆管癌和胆囊癌等。但有关甾醇酯与肝内导管、胆道和胆囊恶性肿瘤发生的因果关系尚未完全阐明。

随着DNA测序技术和流行病学的发展，孟德尔随机化（Mendelian randomization，MR）分析成为遗传流行病学研究中的一种常见的方法，其利用单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）作为工具变量，MR评估暴露对结局的因果影响，为暴露与疾病风险之间的因果关系提供强了有力证据^［16］，近年来，已有国内外研究^［17-19］使用MR分析探讨脂质体与疾病发生的因果关系，包括血浆脂质体与心脏代谢紊乱疾病、乳腺癌和肺癌等因果关系等。鉴于目前对甾醇酯与肝内导管、胆道和胆囊恶性肿瘤因果关系的理解有限，本研究采用两样本MR研究方法，探讨血清中不同结构甾醇酯与肝内导管、胆道和胆囊恶性肿瘤发生的因果关系，从而为肝内导管、胆道和胆囊恶性肿瘤的预防及治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1　研究设计

本研究采用两样本MR分析，探讨不同种类甾醇酯与肝内导管、胆道和胆囊恶性肿瘤发生的因果关系。将不同结构甾醇酯视为暴露因素，并使用与上述甾醇酯显著相关的SNPs作为工具变量。肝内导管、胆道和胆囊恶性肿瘤的发生作为结局变量。通过两样本MR分析，对结果进行异质性、多效性和敏感性分析，以确保研究结果的可靠性和精确性。

1.2　数据来源

本研究使用的全基因组关联研究（genome-wide association study，GWAS）汇总数据来源于芬兰数据库FinnGen（https：//www.finngen.fi/en）， 版本号： R9， 编号： ICD-O-3。15种甾醇酯GWAS数据来源于GWAS Catalog数据库（https：//www.ebi.ac.uk/gwas/，GCST90277238- GCST90277252），由OTTENS MANN等^［17］在2023年发布，研究纳入了174名芬兰人，检测15种血清中甾醇酯水平。肝内导管、胆道和胆囊恶性肿瘤的GWAS数据纳入了1 081例患者和287 137名健康对照，SNPs数量为20 167 537个。研究人群为芬兰人群，排除因种族相关混杂因素造成的偏差。

1.3　工具变量

为了筛选合格的工具变量，本研究选择与暴露因素强相关（P<5×10^-6）的SNPs进行MR分析，以探讨不同种类甾醇酯引起肝内导管、胆道和胆囊恶性肿瘤的潜在因果关联。同时，为排除连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD）偏倚问题，设定连锁不平衡系数r² 的阈值为0.001，区域宽度为10 000 kb。汇总暴露因素与结局的数据集信息，剔除暴露因素中与结局变量强相关的SNPs（P<5×10^-6）。

1.4　统计学分析

采用R 4.3.1统计软件进行统计学分析。采用的软件包为“TwoSampleMR版本号0.5.7”包。MR分析严格遵循以下3个关键假设：①相关性假设，即SNP与暴露之间存在强相关；②排他性假设，即SNP与结局无关；③独立性假设，即SNP与混淆因素无关。基于上述3个关键假设，本研究采用逆方差加权（inverse variance weighted，IVW）法、MR-Egger线性回归和加权中位数（weighted median，WM）法计算出比值比（odds ratio，OR）来评估不同种类甾醇酯引起肝内导管、胆道和胆囊恶性肿瘤发生的因果关联，OR>1即为暴露是结局危险因素，OR<1为保护因素。采用Cochran Q检验法检验SNP的异质性，留一法进行敏感性分析来评估结果的稳健性，MR-Egger截距法检验水平多效性。以P<0.05为差异有统计学意义。为减少多次重复测量产生的数据偏倚，多重假设检验P值均进行错误发现率 （false discovery rate，FDR）校正。

2 结 果

2.1　遗传工具变量选择

根据GWAS中的校验水准，以P<5×10^-6为筛选标准，挑选出15种不同种类的甾醇酯工具变量，并从中筛选出4 504个符合标准的工具变量。设置独立性参数，其中连锁不平衡系数r²设为0.001，连锁不平衡区域宽度为10 000 kb，从而获得106个符合筛选标准的SNPs。随后，在肝内导管、胆道和胆囊恶性肿瘤的遗传数据中找到初步筛选出的70个工具变量。删除与肝内导管、胆道和胆囊恶性肿瘤强相关的SNPs和回文序列。最终，每种甾醇酯工具变量的筛选数量为1~17。见表1。

2.2　甾醇酯对肝内导管、胆道和胆囊恶性肿瘤发生的因果关系MR结果

MR分析和IVW分析结果显示：甾醇酯（27：1/14：0）［OR=2.349，95%置信区间（confidence interval， CI）=1.371~4.025，P=0.002］、甾醇酯（27：1/16：0）（OR=1.248，95%CI=1.018~1.523，P=0.033）、甾醇酯（27：1/18：2）（OR=1.361，95%CI=1.078~1.718，P=0.009）和甾醇酯（27：1/22：6）（OR=1.339，95%CI=1.001~1.791，P=0.049）增加患肝内导管、胆道及胆囊恶性肿瘤的风险。MR-Egger回归分析结果显示：甾醇酯（27：1/18：2）（OR=2.038，95%CI=1.337~3.105，P=0.011）是肝内导管、胆道和胆囊恶性肿瘤发生的危险因素，但MR-Egger回归结果提示甾醇酯（27：1/14：0）（OR=1.861， 95%CI=0.945~2.745， P=0.285）、甾醇酯（27：1/16：0）（OR=1.537，95%CI=1.033~2.289，P=0.053）和甾醇酯（27：1/22：6）（OR=1.927，95%CI=0.790~4.700，P=0.200）与肝内导管、胆道和胆囊恶性肿瘤发生无因果关联，但与其他MR分析方法方向一致。WM法分析结果显示：甾醇酯（27：1/14：0）（OR=2.786，95%CI=1.419~5.468，P=0.003）和甾醇酯（27：1/18：2）（OR=1.548，95%CI=1.148~2.088，P=0.004）是肝内导管、胆道和胆囊恶性肿瘤发生的危险因素，甾醇酯（27：1/16：0）（OR=1.158，95%CI=0.875~1.532，P=0.304）和甾醇酯（27：1/22：6）（OR=1.001，95%CI=0.672~1.440，P=0.932）与肝内导管、胆道和胆囊恶性肿瘤发生无因果关系，但与其他MR分析方法的结果方向一致。其余种类甾醇酯均与肝内导管、胆道和胆囊恶性肿瘤发生无因果关系 （P>0.05）。见表2。

2.3　多效性和异质性检验

MR-Egger截距分析P>0.05，Cochran Q检验P>0.05，见表3。漏斗图和散点图见图1和2。漏斗图显示每个SNP的因果效应分布基本对称。

2.4　敏感性分析

采用留一法进行敏感性分析，并绘制森林图，见图3。逐一剔除工具变量SNPs，剩余的SNPs分析结果与纳入全部SNPs的分析结果相似，未发现甾醇酯（27：1/14：0）、甾醇酯（27：1/16：0）、甾醇酯（27：1/18：2）和甾醇酯（27：1/22：6）与肝内导管、胆道及胆囊恶性肿瘤关联影响较大的异常SNP，确保本研究结果的可靠性。

3 讨 论

本研究首次全面探讨了不同种类甾醇酯对肝内导管、胆道和胆囊恶性肿瘤发病的影响。通过研究15种甾醇酯的特征作为暴露，并以肝内导管、胆道和胆囊恶性肿瘤作为结局，探讨不同种类甾醇酯与肝内导管、胆道和胆囊恶性肿瘤发生的因果关系。本研究结果显示：甾醇酯（27：1/14：0）、甾醇酯（27：1/16：0）、甾醇酯（27：1/18：2）和甾醇酯（27：1/22：6）对肝内导管、胆道和胆囊恶性肿瘤的发生风险有明显影响，各种敏感性分析证实了结果的可靠性和稳健性。

本研究结果显示：甾醇酯（27：1/14：0）、甾醇酯（27：1/16：0）、甾醇酯（27：1/18：2）和甾醇酯（27：1/22：6）增加了患肝内导管、胆道和胆囊恶性肿瘤的风险，可能与甾醇酯的结构有关。所有甾醇的共同特点是在碳原子的3位上有1个羟基，在碳-5，6位上有1个双键，甾醇经由甾醇酯合成酶的作用合成甾醇酯，其中有区别的是有不同数量的碳原子不饱和脂肪酸和附着的双键数量不同，不同的结构所发挥的理化性质存在差异^［20］。血清中不同结构的甾醇酯含量也不同，可能与血清中甾醇酯含量有关。研究^［18］显示：甾醇酯（27：1/20：4）和甾醇酯（27：1/20：5）是乳腺癌发生的危险因素。本研究结果显示：甾醇酯（27：1/14：0）、甾醇酯（27：1/16：0）、甾醇酯（27：1/18：2）和甾醇酯（27：1/22：6）增加患肝内导管、胆道及胆囊恶性肿瘤的风险，可能与肿瘤发生部位不同，以及不同种类甾醇酯在各器官吸收效率不同有关^［21-23］。已有研究^［24］通过核磁共振波谱学对来自不同人类肿瘤组织的总脂质提取物进行研究，发现在恶性肿瘤（胶质母细胞瘤和间变性少突胶质细胞瘤）中可检测出胆固醇酯。既往研究^［13］显示：胆固醇酯代谢相关酶表达水平的改变与结直肠癌的发病机制、临床进展和差异高度相关。胆固醇酯可能是恶性脑瘤和肾肿瘤的标志物^［25-27］。上述研究结果均表明不同结构的甾醇酯影响恶性肿瘤的发生发展。

本研究首次揭示了不同种类甾醇酯与肝内导管、胆道和胆囊恶性肿瘤发生的因果关系，为了解其潜在机制和治疗靶点提供了依据。理解甾醇酯与肝内导管、胆道和胆囊恶性肿瘤发生的关系可能有助于开发针对该疾病的预防措施。

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基金资助

河北省科技厅自然科学基金重点项目(HE2023105018)

河北省唐山市科技局科技计划项目(23130232E)