miR-325-3p靶向PRELID1基因介导EMT通路对结肠癌细胞侵袭和迁移的影响及其机制

Effect of miR-325-3p targeting PRELID1 gene in regulation of EMT pathway on invasion and migration of colon cancer cells and their mechanisms

摘要

目的 探讨微小RNA-325-3p（miR-325-3p）过表达对结肠癌细胞侵袭和迁移的影响，阐明其作用机制。 方法 收集25例明确诊断为结肠癌患者的肿瘤组织及对应的癌旁正常组织。采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测癌旁正常组织和结肠癌组织中miR-325-3p和进化和淋巴兴趣相关结构域蛋白1（PRELID1）mRNA表达水平。采用RT-qPCR法和Western blotting法检测人正常结肠细胞NCM460及结肠癌细胞SW480、HCT116和HT-29中miR-325-3p及PRELID1 mRNA表达水平和PRELID1蛋白表达水平。将SW480细胞分为对照组、NC-mimics组、miR-325-3p mimics组、miR-325-3p mimics+oe-NC组和miR-325-3p mimics+oe-PRELID1组。采用Transwell小室实验和细胞划痕实验分别检测各组细胞侵袭及迁移能力，Western blotting法检测各组细胞中上皮-间质转化（EMT）中E-钙黏蛋白（E-Cadherin）、N-钙黏蛋白（N-Cadherin）和波形蛋白（Vimentin）表达水平。使用Targetscan生物信息学网站预测miR-325-3p下游靶基因，采用双荧光素酶实验验证miR-325-3p与PRELID1的靶向调控关系。 结果 与癌旁正常组织比较，结肠癌组织中miR-325-3p表达水平明显降低（P<0.05），PRELID1 mRNA表达水平明显升高（P<0.05），且结肠癌组织中miR-325-3p和PRELID1 mRNA表达水平呈负相关关系（r<0，R²=0.392， P<0.001）。 与NCM460细胞比较， SW480、 HCT116和HT-29细胞中miR-325-3p表达水平均明显降低（P<0.05），PRELID1 mRNA表达水平明显升高（P<0.05）。与对照组和NC-mimics组比较，miR-325-3p mimics组SW480细胞侵袭细胞数明显减少（P<0.05），划痕愈合率降低（P<0.05），E-Cadherin蛋白表达水平升高（P<0.05），N-Cadherin和Vimentin蛋白表达水平降低（P<0.05）。双荧光素酶实验证实PRELID1是miR-325-3p的直接靶标。与miR-325-3p mimics+oe-NC组比较，miR-325-3p mimics+oe-PRELID1组SW480细胞侵袭细胞数明显增加（P<0.05），划痕愈合率升高（P<0.05），E-Cadherin蛋白表达水平降低（P<0.05），N-Cadherin和Vimentin蛋白表达水平均升高（P<0.05）。 结论 过表达miR-325-3p可靶向下调PRELID1表达，抑制EMT进程，进而抑制SW480细胞侵袭和迁移。

Abstract

Objective To investigate the effects of microRNA-325-3p （miR-325-3p） over-expression on the invasion and migration of colon cancer cells， and to clarify their mechanisms. Methods The tumor tissue and the corresponding adjacent normal tissue of 25 patients clearly diagnosed with colon cancer were collected. The expression levels of miR-325-3p and relevant evolutionary and lymphoid interest domain containing protein 1（PRELID1） mRNA were detected by real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR） method. The expression levels of miR-325-3p and PRELID1 mRNA and the expression levels of PRELID1 protein in human normal colon cells NCM460 and colon cancer cells SW480， HCT116 and HT-29 were detected by RT-qPCR and Western blotting methods. The SW480 cells were divided into control group， NC-mimics group， miR-325-3p mimics group， miR-325-3p mimics+oe-NC group and miR-325-3p mimics+oe-PRELID1 group. The invasion and migration abilities of cells in various groups were detected by Transwell chamber assay and scratch healing assay， respectively. The expression levels of E-Cadherin， N-Cadherin and Vimentin in the epithelial-mesenchymal transition （EMT） of cells in various groups were detected by Western blotting method.The downstream target genes of miR-325-3p were predicted using the Targetscan bioinformatics website， and the targeted regulatory relationship between miR-325-3p and PRELID1 was verified by the dual-luciferase assay. Results Compared with adjacent normal tissue， the expression level of miR-325-3p in cancer tissue was significantly decreased （P<0.05）， while the expression level of PRELID1 mRNA was significantly increased （P<0.05）. The expression levels of miR-325-3p and PRELID1 mRNA was negatively correlated in colon cancer tissue （r<0， R²=0.392， P<0.001）. Compared with NCM460 cells， the expression levels of miR-325-3p in SW480， HCT116 and HT-29 cells were significantly decreased （P<0.05）， and the expression levels of PRELID1 mRNA were significantly increased （P<0.05）. Compared with control group and NC-mimics group， the number of invasive SW480 cells in miR-325-3p mimics group was significantly reduced （P<0.05）， the rate of scratch healing was decreased （P<0.05）， and the expression level of E-Cadherin protein was increased， while the expression levels of N-Cadherin and Vimentin proteins were decreased （P<0.05）. The dual-luciferase assay confirmed that PRELID1 was the direct target of miR-325-3p. Compared with miR-325-3p mimics+oe-NC group， the number of invasive SW480 cells in miR-325-3p mimics+oe-PRELID1 group was significantly increased （P<0.05）， the rate of scratch healing was increased （P<0.05）， the expression level of E-Cadherin protein was decreased， and the expression levels of N-Cadherin and Vimentin proteins were increased （P<0.05）. Conclusion Over-expression of miR-325-3p can inhibit EMT process by down-regulating PRELID1 expression， thereby inhibiting SW480 cell invasion and migration.

Graphical abstract

关键词

微小RNA-325-3p / 进化和淋巴兴趣相关结构域蛋白1 / 结肠肿瘤 / 细胞侵袭 / 细胞迁移 / 上皮-间质转化

Key words

MicroRNA-325-3p / Relevant evolutionary and lymphoid interest domain containing protein 1 / Colon neoplasm / Cell invasion / Cell migration / Epithelial-mesenchymal transition

结肠癌是世界范围内最常见的癌症之一，2020年结肠癌新发患者近120万，相关死亡病例近60万^［1］。结直肠癌局部病变患者5年生存率可达90%，然而伴有远处转移的结肠癌患者生存率降至14%^［2］。微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一种与真核生物生长和病理进程相关的非编码RNA ^［3］，其在多种癌症中呈现异常表达，并直接调控肿瘤发生和侵袭转移等恶性生物学行为^［4］。研究^［5-7］显示：miR-325-3p在肺癌、胃癌和膀胱癌等多种实体肿瘤中表达异常。进化和淋巴兴趣相关结构域蛋白1（relevant evolutionary and lymphoid interest domain containing protein 1，PRELID1）作为PRELI样蛋白家族核心成员，近年被证实是肿瘤进展的关键调控枢纽。研究^［8］显示：PRELID1是肿瘤发展的一个重要开关，其通过依赖细胞微环境的方式，精准调节线粒体活性氧生成和细胞增殖。XU等^［9］研究发现：PRELID1在肝癌组织中呈现特异性高表达，且PRELID1可作为肝癌患者的独立预测生物标志物。本课题组前期通过生物信息学分析发现miR-325-3p与PRELID1基因间存在结合位点，然而目前尚未有文献阐明miR-325-3p靶向PRELID1在结肠癌中的调控作用。基于此，本研究探讨miR-325-3p和PRELID1对人结肠癌细胞SW480侵袭、迁移及上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）通路的影响，阐明其相关分子机制，为结肠癌靶向治疗提供潜在分子靶点和理论依据。

1 资料与方法

1.1　临床资料

收集2024年1—6月于蚌埠医科大学第一附属医院行结肠癌根治术患者25例，于术中采集结肠癌及癌旁正常组织（距癌结缘≥3 cm）。所有患者均签订知情同意书。纳入标准：①手术前后均有确切病理诊断，确认为结肠癌；②术前未接受过任何治疗。排除标准：①非原发肿瘤或并发其他肿瘤；②患有心、肝和肾等重要脏器严重功能障碍；③重症感染者。本研究获得蚌埠医科大学第一附属医院伦理委员会批准（伦科批字〔2024〕第213号）。

1.2　细胞、主要试剂和仪器

人正常结肠细胞NCM460及结肠癌细胞SW480、HCT116和HT-29购自武汉尚恩生物公司，RPMI-1640、DMEM培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司；SYBR Green试剂盒购自日本TaKaRa公司，cDNA反转录试剂盒、Lipo6000^TM转染试剂盒、荧光素酶报告基因检测试剂盒和Matrigel基质胶购自上海碧云天科技有限公司，Transwell小室购自美国Corning公司，TRIzol试剂购自美国Thermo Fisher科技公司；兔抗人PRELID1抗体、兔抗人E-钙黏蛋白（E-Cadherin）抗体、兔抗人N-钙黏蛋白（N-Cadherin）抗体、兔抗人波形蛋白（Vimentin）抗体、兔抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体和山羊抗兔IgG二抗均购自武汉三鹰科技有限公司，引物、miR-325-3p mimics片段、oe-PRELID1质粒、PRELID1野生型（WT-PRELID1）片段（GCACTGGC）和PRELID1突变型（MUT-PRELID1）片段（CACGAAAA）均购自上海吉凯基因公司。实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）仪（型号：Mx3000P）购自美国Agilent公司，CO₂培养箱（型号：BB15）和低温冷冻高速离心机（型号：Freso 21）购自美国Thermo Fisher公司，普通倒置显微镜（型号：CKX41）购于日本Olympus公司，电泳仪（型号：PowerPac basic）购自美国Bio-Rad公司，多功能酶标仪（型号：Infinite M200 Pro）购自瑞士Tecan公司。

1.3　细胞培养、转染和分组

配置含10%胎牛血清及1%青霉素-链霉素的培养基，将细胞于37 ℃含5% CO₂培养箱中进行培养。细胞分为对照组（未处理）、NC-mimics组（转染质粒空载体）、miR-325-3p mimics组（转染miR-325-3p模拟物）、miR-325-3p mimics+oe-NC组（同时转染miR-325-3p模拟物和质粒空载体）和miR-325-3p mimics+oe-PRELID1组（同时转染miR-325-3p模拟物和PRELID1过表达质粒）。采用Lipo6000^TM转染试剂盒按对应方法对各组细胞进行转染，48 h后收集细胞进行后续实验。

1.4　RT-qPCR法检测各组组织和细胞中miR-325-3p和PRELID1 mRNA表达水平

收集患者结肠癌及癌旁组织，NCM460、SW480、HCT116和HT-29细胞及处理后的各组SW480细胞，使用TRIzol试剂提取总RNA，通过逆转录试剂盒将RNA反转录合成cDNA。依据SYBR Green试剂盒说明，加入引物和cDNA配置反应体系，进行RT-qPCR扩增。引物序列：miR-325-3p，上游引物5'-GTAGGTGT-CCAGTAAGTG-3'，下游引物5'-GAACATGTCT-GCGTATCTC-3'；PRELID1，上游引物5'-GCAG-CTGAAAGA-AGCCCAAG-3'，下游引物5′-AGC-CTGAATGCCTTCCTCAG-3'；GAPDH，上游引物5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGTATTG-3'，下游引物5'-CCTGGAAGATGGTGATGGGATT-3'。反应条件：变性95 ℃、20 s，退火55 ℃、40 s，延伸72 ℃、35 s，共35个循环。采用2^-△△Ct法计算各组组织和细胞中miR-325-3p和PRELID1 mRNA表达水平。

1.5　Western blotting法检测各组细胞中PRELID1、E-Cadherin、N-Cadherin和Vimentin蛋白表达水平

取NCM460、SW480、HCT116和HT-29细胞及处理后各组SW480细胞，加入Ripa裂解液提取细胞总蛋白，分别经过浓度测定、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）及PVDF转膜后，使用5%脱脂牛奶封闭1 h。PRELID1、E-Cadherin、N-Cadherin和Vimentin一抗均以1∶1 000稀释比例于4 ℃孵育过夜。经含吐温的Tris缓冲盐溶液（Tris-buffered saline with Tween，TBST）清洗后，加入IgG二抗（稀释比1∶5 000）室温孵育2 h。加入ECL显影液曝光显影。采用Image J软件分析蛋白条带灰度值，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白（GAPDH）条带灰度值。

1.6　Transwell小室实验检测各组侵袭细胞数

将Matrigel基质胶均匀铺于Transwell小室底部。各组SW480细胞经胰蛋白酶消化后，使用无血清培养基重悬细胞密度为1×10⁵ mL^-1，取100 μL培养基于上室，600 μL完全培养基于下室。培养箱培养24 h，加入多聚甲醛固定，结晶紫溶液染色，使用显微镜观察并随机选取3个视野，计算视野内穿膜细胞数，取3个视野穿膜细胞数平均值为各组侵袭细胞数。

1.7　细胞划痕实验检测各组划痕愈合率

取各组转染后细胞，经胰蛋白酶消化后，重悬细胞密度为1×10⁶ mL^-1，取1 mL接种于6孔细胞培养板，细胞培养至融合度达90%后，通过无菌枪头在板中央作一划痕，继续培养细胞24 h。分别于0 h和24 h使用倒置显微镜拍照。划痕愈合率=（0 h划痕宽度-24 h划痕宽度）/0 h划痕宽度×100%。

1.8　双荧光素酶报告基因实验验证miR-325-3p与PRELID1基因的靶向关系

构建基因质粒野生型WT-PRELID1片段和突变型MUT-PRELID1片段，采用Lipo6000^TM转染试剂将WT-PRELID1和MUT-PRELID1基因质粒分别与NC-mimics或miR-325-3p mimics共转染至SW480细胞。转染后培养箱孵育24 h，采用酶标仪检测各组细胞荧光素酶活性。细胞荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶荧光强度/海肾荧光素酶荧光强度。比较各组细胞荧光素酶活性，验证miR-325-3p与PRELID1基因的靶向关系。

1.9　统计学分析

采用SPSS 21.0和GraphPad Prism 8.0统计软件进行统计学分析。正常组织、结肠癌组织和各组细胞中miR-325-3p及PRELID1 mRNA表达水平、各组侵袭细胞数、划痕愈合率及细胞中PRELID1、E-Cadherin、N-Cadherin和Vimentin蛋白表达水平均符合正态分布，以x±s表示，2组间样本均数比较采用两独立样本t检验，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用SNK-q检验。采用Pearson法分析miR-325-3p与PRELID1 mRNA表达水平的相关性。每组实验重复3次。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1　正常组织和结肠癌组织中miR-325-3p及PRELID1 mRNA表达水平

与癌旁正常组织比较，结肠癌组织中miR-325-3p表达水平明显降低（P<0.05），PRELID1 mRNA表达水平明显升高（P<0.05）。Pearson法分析结果显示：miR-325-3p与PRELID1 mRNA表达水平在结肠癌中呈负相关关系（r<0，R²=0.392，P<0.001）。见图1。

2.2　正常结肠细胞和结肠癌细胞中miR-325-3p及PRELID1 mRNA表达水平和PRELID1蛋白表达水平

与人正常结肠细胞NCM460比较，结肠癌细胞SW480、HCT116和HT-29中miR-325-3p表达水平均明显降低（P<0.05），PRELID1 mRNA表达水平明显升高 （P<0.05）。见图2A。Western blotting法检测结果显示：与人正常结肠细胞NCM460比较，结肠癌细胞SW480、HCT116和HT-29中PRELID1蛋白表达量明显升高。见图2B。因SW480细胞中miR-325-3p表达最低，所以本研究选择SW480细胞进行后续过表达miR-325-3p实验。

各组细胞处理后，对照组（3.32±0.49）与NC-mimics组（3.54±0.40）miR-325-3p表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组比较，miR-325-3p mimics组细胞中miR-325-3p表达水平（13.47±0.13）明显升高（P<0.05），证明miR-325-3p模拟物转染成功。

2.3　各组SW480细胞侵袭细胞数和划痕愈合率

对照组和NC-mimics组侵袭细胞数和划痕愈合率比较差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组和NC-mimics组比较，miR-325-3p mimics组侵袭细胞数减少（P<0.05），划痕愈合率降低（P<0.05）。见图3、图4和表1。

2.4　各组SW480细胞中EMT相关蛋白表达水平

与对照组和NC-mimics组比较，miR-325-3p mimics组SW480细胞中E-Cadherin蛋白表达水平明显升高（P<0.05），N-Cadherin和Vimentin蛋白表达水平均明显降低（P<0.05）。见图5。

2.5　双荧光素酶实验验证miR-325-3p与 PRELID1基因的靶向调控关系

Targetscan网站预测miR-325-3p与PRELID1基因间存在结合位点。双荧光素酶实验结果显示：共转染WT-PRELID1质粒后，与NC-mimics组比较，miR-325-3p mimics组细胞荧光素酶活性明显降低（P<0.05）；共转染MUT-PRELID1质粒后，NC-mimics组和miR-325-3p mimics组细胞荧光素酶活性比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图6。

2.6　转染后各组细胞中PRELID1蛋白表达水平

Western blotting法检测结果显示：对照组和NC-mimics组细胞中PRELID1蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组和NC-mimics组比较，miR-325-3p mimics组细胞中PRELID1蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。见图7。

2.7　 miR-325-3p和PRELID1共转染后2组侵袭细胞数和划痕愈合率

与miR-325-3p mimics+oe-NC组（0.82±0.04）比较，miR-325-3p mimics+oe-PRELID1组细胞中PRELID1 mRNA表达水平（3.29±0.04）明显升高（P<0.05），证明转染片段有效。与miR-325-3p mimics+oe-NC组（60.33±5.86 和 22.00% ± 3.61%） 比 较， miR-325-3p mimics+oe-PRELID1组侵袭细胞数（195.00±10.15）明显增加（P<0.05），划痕愈合率（65.33%± 3.51%）明显升高（P<0.05）。见图8和9。

2.7　miR-325-3p和PRELID1共转染后2组细胞中 EMT相关蛋白表达水平

与miR-325-3p mimics+oe-NC组比较，miR-325-3p mimics+oe-PRELID1组细胞中E-Cadherin蛋白表达水平明显降低（P<0.05），N-Cadherin和Vimentin蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。见图10。

3 讨 论

结肠癌是全球范围内一种普遍且致命的恶性肿瘤，其发生发展涉及多种因素和基因突变影响，危险因素包括年龄、肥胖、吸烟、饮酒和不良饮食习惯等^［10-11］。流行病学数据^［12］显示：20%结肠癌患者初诊即存在远处转移，超过50%的患者在5年内发生远处转移，且转移患者中有90%因结肠癌失去生命。目前临床治疗策略以手术切除、放疗和化疗为主^［13］。近年来，靶向和免疫治疗已成功应用于结肠癌，然而转移性患者的总体生存率和复发率仍未得到明显改善^［14］。因此，深入探讨结肠癌的发生发展机制对临床肿瘤转移有效控制和患者生存期延长具有重要意义。

多项研究揭示miR-325-3p在多种实体恶性肿瘤中发挥抑癌作用。LI等研究^［15］显示：与癌旁正常组织比较，肝细胞癌组织中miR-325-3p表达水平降低，过表达miR-325-3p可抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭，并抑制血管生成。SUN等^［16］研究显示：miR-325-3p在胃癌组织中表达下调，过表达miR-325-3p可抑制胃癌细胞增殖并促进凋亡，且miR-325-3p通过调控SNHG6基因降低细胞顺铂耐药性。本研究结果显示：结肠癌组织中miR-325-3p表达降低，在SW480细胞中过表达miR-325-3p可抑制细胞侵袭和迁移；双荧光素酶报告实验证实PRELID1是miR-325-3p下游靶基因，两者表达呈负相关关系，且PRELID1过表达可促进结肠癌细胞侵袭和迁移。

EMT是参与肿瘤转移的核心机制之一，其主要特征为细胞上皮性状丢失（如细胞-细胞连接和顶端基底极性等）和间质性状获得（如梭形细胞形状和间质标记），从而促进癌细胞从固定的上皮细胞转变为可移动的侵袭性间充质样细胞^［17-19］。本研究结果显示：miR-325-3p过表达后，SW480细胞中EMT相关蛋白E-Cadherin蛋白表达水平升高，N-Cadherin和Vimentin蛋白表达水平降低；上调PRELID1表达可逆转上述变化趋势。

综上所述，结肠癌组织中miR-325-3p低表达与PRELID1高表达呈负相关关系。过表达miR-325-3p可靶向下调PRELID1表达，抑制EMT进程，进而抑制SW480细胞侵袭和迁移。PRELID1是miR-325-3p的靶基因，上调PRELID1表达能够逆转细胞上述改变。本研究局限性在于仅通过细胞实验验证该机制，后续需开展相关动物实验提供体内验证结果，为结肠癌发生发展机制提供新的思路。

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基金资助

安徽省卫健委卫生健康科研项目(AHWJ2022a019)

蚌埠医科大学自然科学研究项目(2023byzd095)